Methodenartikel

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

DOI:

10.3791/59733

⸱

19 juli 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biological Chemistry, Department of Molecular Biology, Showa University School of Pharmacy, 2Department of Biochemistry, Showa University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Talrijke intracellulaire eiwitten communiceren fysiek in overeenstemming met hun intracellulaire en extracellulaire omstandigheden. Inderdaad, cellulaire functies grotendeels afhangen van intracellulaire eiwit – eiwit interacties. Daarom is onderzoek met betrekking tot deze interacties onmisbaar om het begrijpen van fysiologische processen te vergemakkelijken. Co-precipitatie van geassocieerde eiwitten, gevolgd door massaspectrometrie (MS) analyse, maakt het mogelijk nieuwe eiwit interacties te identificeren. In deze studie hebben we details gegeven over de nieuwe techniek van Immunoprecipitation-vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS-analyse in combinatie met on-membraan vertering voor de analyse van eiwit-eiwit interacties. Deze techniek is geschikt voor ruwe immunoprecipitanten en kan de doorvoer van proteomische analyses verbeteren. Gelabelde recombinant eiwitten werden neergeprecipiteerd met specifieke antilichamen; vervolgens werden immunoprecipitanten die op polyvinylideendifluoride membraan stukken werden geblopt, onderworpen aan reductieve alkylatie. Na trypsinisatie werden de verteerde proteïne residuen geanalyseerd met LC-MS/MS. met behulp van deze techniek, waren we in staat om verschillende kandidaat-geassocieerde eiwitten te identificeren. Deze methode is dus handig en nuttig voor de karakterisering van nieuwe proteïne-eiwit interacties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel eiwitten een constitutieve rol spelen in levende organismen, worden ze voortdurend gesynthetiseerd, verwerkt en afgebroken in de intracellulaire omgeving. Bovendien, intracellulaire eiwitten vaak fysiek en biochemisch interactie, die de functie van een of beide1,2,3beïnvloedt. Bijvoorbeeld, de directe binding van spliceosome-geassocieerde proteïne homo CWC22 met eukaryotische omzettings initiatie factor 4a3 (eIF4A3) is noodzakelijk voor de assemblage van de Exon Junction complex4. Consistent met deze, een eIF4A3 mutant die niet affiniteit voor CWC22 niet in slaagt om Exon Junction complex gestuurde mRNA splicing4te faciliteren. Zo is de studie van eiwit interacties cruciaal voor het precieze begrip van fysiologische regulering en van cellulaire functies.

Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) zijn toegepast op de uitgebreide analyse van eiwit-eiwit interacties. Bijvoorbeeld, de co-precipitatie van endogene eiwitten of exogenously introduceerde gelabelde eiwitten met hun geassocieerde eiwitten, gevolgd door MS-analyse, maakt de identificatie mogelijk van nieuwe eiwit interacties5. Een belangrijk knelpunt bij MS/MS-analyses is echter een slecht herstel van tryptische vergisters van eiwit monsters. Voor het uitvoeren van proteomische analyses op cellysaten worden in het algemeen in-gel en op membraan vergistings technieken gebruikt om MS/MS-monsters voor te bereiden. We hebben eerder een in-gel vergistings procedure vergeleken met een on-membraan vergistings techniek6, en toonden aan dat deze laatste gepaard ging met een betere sequentiedekking. Polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan kan geschikt zijn voor dit doel, omdat het mechanisch robuust en bestand is tegen hoge concentraties van organische oplosmiddelen7,8, waardoor de enzymatische vertering van geïmmobiliseerde eiwitten in aanwezigheid van 80% acetonitril9. Bovendien kan immobilisatie op een membraan conformationele veranderingen in doel eiwitten veroorzaken, wat leidt tot verbeteringen in de efficiëntie van tryptische spijsvertering10. Dienovereenkomstig hebben we in dit artikel het gebruik van Immunoprecipitation-LC/MS/MS-analyse van eiwit interacties beschreven met behulp van een verterings techniek op het membraan. Deze eenvoudige methode vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties, zelfs in niet-gespecialiseerde laboratoria.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. immunoprecipitatie

Opmerking: we gebruikten niet-natriumdodecylsulfaat (SDS) lysisbuffer en citraat elutie, zoals beschreven in de volgende secties. Het gebruik van een alternatieve in-House immunoprecipitatie-techniek kan echter ook van toepassing zijn voor het bereiden van LC-MS/MS-monsters.

  1. Transfect gekweekte cellen met vectoren coderen van een epitoop tag alleen of een fusie-eiwit. Voor het verwerven van representatieve gegevens, overdracht J774 cellen (1 x 106) met vectoren coderen groene fluorescerende proteïne (GFP) alleen of GFP-gesmolten Capn6 (calpain-6 gen) met behulp van cationische liposomen.
  2. Geconjugeerde antilichamen tegen magnetische kralen.
    1. Meng voor dit doel ANTIGFP-antilichamen (2 μL/reactie) met magnetische kralen (25 μL/reactie) in 500 μL citraat fosfaatbuffer (24,5 mM citroenzuur, 51,7 mM dibasisch natriumfosfaat; pH 5,0) in een proefbuisje van 1,5 mL.
    2. Draai het mengsel met 50 rpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de IgG-geconjugeerde kralen driemaal met citraat fosfaatbuffer met 0,1% polyoxyethyleen (20) polyethyleenglycolsorbitaanmono monolauraat.
  3. Met behulp van een geschikte lysisbuffer. Voor het verwerven van representatieve gegevens, Lyse de getransverteerde cellen gedurende 30 minuten op ijs in 400 μL lysisbuffer (50 mM tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% poly (oxyethelene) octylfenyl ether) bevattende 40 μmol/L fenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μg/mL leupeptine, 50 μg/ mL aprotinin, 200 μmol/L natrium orthovanadaat en 1 mM ethyleenglycol tetraazijnzuur (EGTA) in 1,5 mL reageerbuisjes 24 uur na trans fectie.
  4. Wis het lysaat door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 15.000 x g en verzamel het supernatant.
  5. Preclear het lysaat. Voeg ongelabelde magnetische parels (25 μL/reactie) toe in een 1,5 mL reageerbuisje. Was de kralen driemaal met 500 μL citraat fosfaatbuffer. Na het verwijderen van citraat fosfaatbuffer in de laatste wasbeurt, voeg de cel lysaat over de magnetische kralen. Draai het mengsel met behulp van Rotator bij 50 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
  6. Plaats de reageerbuis op een magnetische standaard gedurende 5 minuten voor magnetische scheiding en verzamel het cellenlysaat. Het gebruik van de door de fabrikant aangewezen magnetische standaard wordt aanbevolen.
  7. Bind de doel eiwitten aan de geconjugeerde kralen. Plaats de immunoglobuline (IG) G-geconjugeerde parels op een magnetische standaard gedurende 5 minuten voor magnetische scheiding, gooi de citraatbuffer weg en voeg vervolgens de cellysaat toe aan de afgescheiden kralen.
  8. Draai het mengsel met 50 rpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  9. Scheid de doel eiwitten van vrije niet-doelwit eiwitten. Was de kralen driemaal met behulp van 500 μL citraat fosfaatbuffer met 0,1% polyoxyethyleen (20) polyethyleenglycolsorbitaanmono monolauraat. Voeg na de laatste wasbeurt 30 μL citraat buffer (pH 2 – 3) toe en inincubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de doel eiwitten te Elderen.
    Opmerking: als herstel van de immunoprecipitatie onvoldoende is, kan het gebruik van alternatieve epitoop Tags, zoals vlag of zijn, de efficiëntie verbeteren. Als de efficiëntie van de elutie ontoereikend is, kan het gebruik van andere eluanten, zoals een SDS-based oplossing, de efficiëntie verbeteren.

2. op-membraan vertering van eiwitten

Opmerking: het gebruik van eiwit vrije materialen en apparatuur is noodzakelijk om besmetting met exogene eiwitten te voorkomen. Bovendien wordt aanbevolen dat de bediener een chirurgisch masker en handschoenen draagt om verontreiniging door menselijke eiwitten te voorkomen.

  1. Snijd PVDF-membranen in stukjes van 3 mm x 3 mm met behulp van een chirurgische schaar die met methanol is afgeveegd en onmiddellijk vóór gebruik is gedroogd.
  2. Voeg 2 – 5 μL ethanol toe op de stukjes PVDF-membraan op schone aluminiumfolie.
  3. Voordat ze volledig drogen, voeg de eluant (2 – 5 μL elk, 4 – 6 stuks per monster) toe aan de hydrofiele PVDF-membranen en lucht-droog de membranen totdat het membraanoppervlak mat wordt. Gedroogde membranen kunnen worden bewaard bij 4 °C.
  4. Breng de alle membranen over in 1,5 mL plastic buizen, Voeg 20 – 30 μL ethanol toe om de membranen hydrofiel te maken en verwijder vervolgens de ethanol met behulp van een pipet.
  5. Voeg, voordat het membraan volledig uitdroogt, 200 μL dithiotreïtol (DTT)-gebaseerde reactie oplossing (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT en 20% acetonitril) toe en inincuberen deze bij 56 °c gedurende 1 uur.
  6. Vervang de reactie oplossing met 300 μL iodoacetamideoplossing (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamide en 20% acetonitril) en inincuberen gedurende 45 min bij kamertemperatuur in het donker.
  7. Was de membranen tweemaal met 1 mL gedistilleerd water en eenmaal met 1 mL 2% acetonitril door vortex menging voor > 10 s.
  8. Los in de reactie oplossing (30 mM NH4HCO3 met 70% acetonitril) GELYOFILISEERDE MS-grade trypsine (tabel met materialen) op. Voeg 100 μL van de reactie oplossing met 1 μg trypsine (tafel van de materialen) (30 mm NH4hco3 met 70% acetonitril) toe en incuberen bij 37 °c 's nachts.
  9. Breng de reactie oplossing met de tryptische verteert over in een schone 1,5 ml reageerbuis met behulp van een pipet.
  10. Voeg 100 μL wasoplossing (70% acetonitril/1% trifluorazijnzuur) toe aan het membraan en inincuberen bij 60 °C gedurende 2 uur. Verzamel de wasoplossing en meng deze met de reactie oplossing. Voeg nog eens 100 μL wasoplossing toe aan het membraan en sonificeren het gedurende 10 min. Verzamel vervolgens de reinigingsoplossing en meng met de reactie oplossing.
  11. Bedek de reageerbuis met een stukje laboratorium folie en maak een paar kleine gaatjes met een naald. Droog de oplossing met een vacuüm concentrator.
  12. Los het residu op in 10 μL van 0,2% mierenzuur. Na centrifugeren (12.000 × g, 3 min bij kamertemperatuur), breng het supernatant over in een monsterbuis.
    Opmerking: de wast zijn de kritieke stappen van deze sectie. Tijdens een on-membraan eiwit vertering is het wassen van de membranen met de geïmmobiliseerde eiwitten na reductie en alkylatie met gedistilleerd water, gevolgd door 2% acetonitril, voor meer dan 10 sec per stuk, van cruciaal belang voor het verwijderen van de reagentia.

3. LC – elektro spray ionisatie (ESI)-MS/MS-analyse

  1. Activeer een ESI-MS/MS-instrument (tabel met materialen) in combinatie met een nano-LC HPLC-systeem (tabel metmaterialen). Koppel een pre-Column (tabel met materialen) en een analytische kolom (tabel met materialen).
  2. Kalibreer vóór de analyse de massaspectrometer met behulp van tryptische verteerd boviene serumalbumine opgelost in 0,2% mierenzuur, dat standaard peptiden biedt.
  3. Analyseer de samples met de positive Ion-modus en een massa bereik van 400 – 1250 m/z; vervolgens verkrijgt u tot 10 MS/MS spectra (elk 100 MS) met een massa bereik van 100 – 1600 m/z en een lineaire gradiënt van 2% – 80% acetonitril en 0,2% mierenzuur voor 80 min bij een debiet van 300 nL/min.
  4. Analyseer de uitvoergegevens met behulp van software voor eiwit identificatie (tabel met materialen) om de geassocieerde eiwitten van de kandidaat te identificeren. Voor de positieve identificatie van een kandidaat-eiwit is een detectie van ten minste één high-fidelity peptide fragment (> 95% getrouwheid) vereist.
  5. Laat de eiwitten weg die ook worden neergeprecipiteerd in GFP-uitdrukken van lysaten (transfectie van vector die een GFP-tag alleen uitdrukt) uit de lijst van kandidaat-eiwitten.
    Opmerking: als er weinig eiwitten in de database-analyse worden geïdentificeerd, kan wijziging van de MS/MS-acquisitie voorwaarden (bijv. het veranderen van de tijd van 100 MS elk tot 50 MS per stuk) het aantal geïdentificeerde eiwitten verhogen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door middel van de hierboven beschreven procedure werden immunoprecipitanten geanalyseerd met LC-MS/MS (Figuur 1). Na de uitsluiting van exogenously afgeleide eiwitten (eiwitten van andere soorten en Igg's) werden 17 eiwitten geïdentificeerd in calpain-6-geassocieerde immunoprecipitanten (tabel 1) en 15 eiwitten werden geïdentificeerd in GFP-geassocieerde immunoprecipitanten ( Tabel 2). Van de calpain-6-en GFP-geassocieerde e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben eerder beschreven een analyse van de oxidatieve modificaties van apolipoproteïne B-100 in geoxideerde low-density lipoproteïne met behulp van LC-MS/MS voorafgegaan door een op-membraan spijsvertering techniek6. In de huidige studie, we combineerden deze techniek met immunoprecipitatie en hebben verschillende calpain-6-geassocieerde eiwitten geïdentificeerd. Deze nieuwe techniek vertegenwoordigt een handige methode voor het screenen van kandidaat-geassocieerde eiwitten. Calpain-6 is een n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd deels gesteund door Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI subsidie nummer 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI subsidie nummer 15K09418 (TM), een onderzoeksbeurs van Kanehara Ichiro Medical Science Foundation en een onderzoeksbeurs van Suzuken Memorial Foundation (all to TM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetonitrileWako014-00386
Citric acidWako030-05525
DiNAKYA Tech Co.nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AIKYA Tech Co.nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTTNacalai tesque14112-94
Dynabeads protein GThermo Fisher Scientific10003D
Formic acidWako066-00461
HiQ Sil C18W-3KYA Tech Co.E03-100-1000.10mmID * 100mmL
IodoacetamideWako095-02151
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)Clontech632380
NaClWako191-01665
NH4HCO3Wako018-21742
Nonidet P-40SigmaN6507poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standardKYA Tech Co.tBSA-04tryptic digests of bovine serum albumin
PP vialKYA Tech Co.03100Splastic sample tube
Protease inhibitor cooctailSigmaP8465
ProteinPilot softwareSciex5034057software for protein identification
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111trypsin
Sodium orthovanadateSigmaS6508
Sodium phosphate dibasic dihydrateSigma71643
TFAWako206-10731
trap columnKYA Tech Co.A03-05-0010.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 systemSciex4466015Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
TrisWako207-06275
Tween-20Wako160-21211

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
  2. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).
  3. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
  4. Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
  5. Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
  6. Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
  7. Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
  8. Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
  9. Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
  10. Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
  11. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
  12. Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
  13. Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
  14. Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
  15. Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunoprecipitatie LC MS MSPVDF membraantrypsineverteringmagnetische kralenmassaspectrometrieproteomische analyseruwe immunoprecipitatenreductieve alkylering

Gerelateerde artikelen