We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn elektrofiele, het genereren van reactieve elektrofielen op biotransformatie, of induceren oxidatieve stress. Onder de geoxideerde nucleobasen, de meest bestudeerde is een 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) of 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), een biomarker van oxidatively geïnduceerde basis schade in DNA. Aldehyden en epoxyaldehydes als gevolg van het lipiden peroxidatie proces zijn elektrofiele moleculen die in staat zijn mutagene exocyclic DNA adducten te vormen, zoals de etheno adducten 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2- εdGuo) en 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo), die als potentiële biomarkers in de pathofysiologie van ontsteking zijn voorgesteld. Selectieve en gevoelige methoden voor de kwantificering ervan in DNA zijn noodzakelijk voor de ontwikkeling van preventieve strategieën om de mutaties van cellen en de ontwikkeling van chronische ziekten te vertragen (bijv. kanker, neurodegeneratieve ziekten). Onder de gevoelige methoden die beschikbaar zijn voor hun detectie (hoge prestaties vloeibare chromatografie gekoppeld aan elektrochemische of tandem massaspectrometrie detectoren, Comet Assay, immunoassays, 32P-postlabeling), de meest selectieve zijn die op basis op hoge prestaties vloeibare chromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (HPLC-ESI-MS/MS). Selectiviteit is een essentieel voordeel bij het analyseren van complexe biologische monsters en HPLC-ESI-MS/MS geëvolueerd als de gouden standaard voor de kwantificering van gemodificeerde nucleosiden in biologische matrices, zoals DNA, urine, plasma en speeksel. Het gebruik van isotopically gelabeld interne normen voegt het voordeel van correcties voor molecule verliezen tijdens de DNA-hydrolyse en analyt verrijking stappen, alsmede voor de verschillen van de analyt ionisatie tussen de monsters. Het helpt ook bij de identificatie van de juiste chromatografie piek wanneer er meer dan een piek aanwezig is.
We presenteren hier gevalideerd gevoelige, accurate en nauwkeurige HPLC-ESI-MS/MS methoden die met succes werden toegepast voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-Dado en 1,N2-dGuo in de Long-, lever-en nier-DNA van A/J muizen voor de beoordeling van de effecten van ambient PM2,5 blootstelling.
Inleiding
Sommige reactieve zuurstofsoorten (ROS) kunnen koolstof dubbele banden van de basissen van DNA en sommige koolstof in deoxyribose moiety oxideren, die geoxideerde basissen en de bundel onderbrekingen van DNA produceert1. Als een negatief geladen molecuul rijk aan stikstof-en zuurstofatomen, DNA is ook een doelwit voor elektrofiele groepen die covalente reageren met de nucleofiele sites (stikstof en zuurstof), het geven van producten die worden genoemd DNA adducten2. Dus, DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn el....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Vier weken oude mannelijke A/J muizen, specifieke pathogeen vrij, werden verkregen uit het broed centrum van proefdieren van Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brazilië, en werden dienovereenkomstig behandeld aan de ethische commissie van de Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van São Paulo (protocol no 1310/09).
1. verzameling van muizen weefsels
- Verdoven het dier met xylazine en ketamine. Voor een muis met 30 g lichaamsgewicht, een oplossing injecteren (niet meer dan 2 mL) met 2,63 mg ketamine en 0,38 mg xylazine, ze intraperitoneaal.
- Verzamel bloed (0,5-1,5 mL) voor aanvullende analyses (b....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gemiddelde concentraties van DNA (± BR) die van muizen lever (~ 1 g weefsel) worden verkregen, Long (~ 0,2 g weefsel) en nier (~ 0,4 g weefsel) waren, respectievelijk, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021, en 3.223 ± 723 µ g/mL in het uiteindelijke volume van 200 µ L. Een vertegenwoordiger chromatogram verkregen door HPLC-papa van het gezuiverde DNA wordt getoond in Figuur 3. De aanwezigheid van de vier 2 '-deoxynucleosides, vrij van de RNA ribonucleosides, die El.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een groot probleem dat in de 8-oxodGuo analyses door HPLC methodes wordt gevonden is de mogelijke inductie van zijn vorming tijdens de Workup procedures van de extractie van DNA, de hydrolyse van DNA, en concentratie van DNA eiwithydrolysaten22,38. Om het probleem van 8-oxodGuo artefactuele vorming te minimaliseren, wordt het aanbevolen de toevoeging van deferoxamine aan alle DNA-extractie, opslag en hydrolyse oplossingen, het gebruik van de Natriumjodide chaotro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do de São Paulo, proc. 2012/22190-3 en 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 en 429184/2016-6), Kaap, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPEs/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPEs; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) en CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira en A. A. F. Oliveira kregen beurzen van FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) en CAPEs (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva, en A. P....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| [15N5]-2’-deoxyadenosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2’-deoxyguanosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3899-CA-10 | |
| acetonitrile | Carlo Erba Reagents | 412413000 | |
| alkaline phosphatase uit boviene intestinale mucosa | Sigma | P5521 | |
| ammoniumacetaat | Merck | 101116 | |
| kalfsthymus-DNA | Sigma | D1501 | |
| cell lysis oplossing | QIAGEN | 158908 | |
| chloroform | Carlo Erba Reagents | 412653 | |
| deferoxamine | Sigma | D9533 | |
| deoxyribonuclease I (DNase I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| ethanol | Carlo Erba Reagents | 414542 | |
| mierenzuur | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| HPLC-ESI-MS/MS systeem | HPLC: Agilent 1200 series ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments | HPLC: binaire pomp (G1312B), isocraatpomp (G1310A), kolomoven met kolomschakelklep (G1316B), diode-arraydetector (G1315C), autosampler (G1367C). ESI-MS/MS: Lineair Quadrupool Ion Trap-massaspectrometer, Model 4000 QTRAP. | |
| HPLC/DAD systeem | Shimadzu | Twee pompen (LC-20AT), fotodiode-arraydetector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), kolomoven (CTO-10AS/VP) | |
| HPLC kolom (50 x 2,0 mm i.d., 2,5 µm, C18) | Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| HPLC kolom (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 µm, C18) | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| HPLC kolom (250 x 4,6 mm i.d., 5,0 µm, C18) | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| HPLC C18 security guard cartridge (4,0 x 3,0 mm i.d.) | Phenomenex | AJO-4287 | |
| isoamylalcohol | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| isopropylalcohol (isopropanol) | Carlo Erba Reagents | A412790010 | |
| ketamine | Ceva | Commerciële naam: Dopalen | |
| magnesiumchloride | Carlo Erba Reagents | 349377 | |
| magnesiumchloride | Sigma | M2393 | |
| methanol | Carlo Erba Reagents | L022909K7 | |
| fosfodiesterase I uit Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| eiwitprecipitatieoplossing | QIAGEN | 158912 | |
| proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| ribonuclease A | Sigma | R5000 | |
| natriumchloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18 (Strata-X) | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| tris(hydroxymethyl)-aminomethaan | Carlo Erba Reagents | 489983 | |
| xylazine | Syntec do Brasil | Commerciële naam: Xilazin |
Referenties
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
