Experimenten met eiwitbinding Microarray (PBM) in combinatie met biochemische assays koppelen de bindende en katalytische eigenschappen van DNA primase, een enzym dat RNA-primers op Template DNA synthetiseert. Deze methode, aangeduid als high-throughput Primase profilering (HTPP), kan worden gebruikt om DNA-bindende patronen van een verscheidenheid aan enzymen te onthullen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
DNA primase synthetiseert korte RNA-primers die DNA-synthese van Okazaki fragmenten op de achterblijvende streng door DNA-polymerase tijdens DNA-replicatie initiëren. De binding van prokaryotische DnaG-achtige primases aan DNA vindt plaats in een specifieke trinucleotide-herkennings sequentie. Het is een cruciale stap in de vorming van Okazaki fragmenten. Conventionele biochemische hulpmiddelen die worden gebruikt om de DNA-herkennings volgorde van DNA primase te bepalen, bieden slechts beperkte informatie. Met behulp van een op hoge doorvoer microarray gebaseerde bindende assay en opeenvolgende biochemische analyses, is aangetoond dat 1) de specifieke bindende context (flankerende sequenties van de herkennings plaats) de bindende sterkte van het DNA primase op zijn template beïnvloedt DNA, en 2) sterkere binding van Primase aan het DNA levert langere RNA-primers op, wat duidt op een hogere processiviteit van het enzym. Deze methode combineert PBM en Primase activity assay en is aangewezen als high-throughput Primase profilering (HTPP), en het maakt karakteriseren van specifieke sequentie herkenning door DNA primase in ongekende tijd en schaalbaarheid mogelijk.
Inleiding
HTPP maakt gebruik van DNA-bindende microarray-technologie in combinatie met biochemische analyse (Figuur 1) om statistisch specifieke kenmerken van DNA-templates te identificeren die de enzymatische activiteit van DNA primase beïnvloeden. Daarom biedt HTPP een technologisch platform dat een kennis sprong in het veld vergemakkelijkt. De klassieke instrumenten die worden gebruikt om de Primase herkennings locaties te bepalen, hebben niet de mogelijkheid om enorme hoeveelheden gegevens te leveren, terwijl HTPP dat wel doet.
PBM is een techniek die routinematig wordt gebruikt om de bindende voorkeuren van transcri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. ontwerp van Microarray
Opmerking: DNA-sondes vertegenwoordigen aangepaste 36-nucleotide-sequenties, bestaande uit de herkennings plaats voor T7 DNA primase (GTC), gelegen tussen twee variabele flankerende gebieden, gevolgd door een constante 24-nucleotide sequentie die is aangesloten op een glas Slide3. We gebruikten een 4 x 180.000 Microarray formaat, die het spotten van elke DNA sequentie in zes replicaten mogelijk gemaakt, willekeurig verdeeld over de glijbaan.
-
Ontwerp van de DNA-bibliotheek voor primases met bekende herkennings sequenties
- Zorg ervoor dat elke sequentie bes....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze technologische voorsprong voor het in kaart brengen van de Primase bindingsplaatsen maakt het verkrijgen van DNA bindings eigenschappen die moeilijk, zo niet onmogelijk zijn, te observeren met behulp van klassieke gereedschappen. Nog belangrijker is dat HTPP het herbezoeken van het traditionele begrip van de bindende sites van Primase mogelijk maakt. In het bijzonder onthult HTPP bindende specifieke kenmerken naast bekende 5 '-GTC-3 ' herkennings sequenties, wat leidt tot verandering.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De PBM-methode is op grote schaal gebruikt om bindende eigenschappen van transcriptiefactoren te onderzoeken en kan ook worden toegepast op DNA-verwerkings enzymen, zoals DNA primase, die binden aan DNA met een lage affiniteit. Er zijn echter bepaalde wijzigingen van experimentele procedures vereist. Het microarray-experiment omvat verschillende stappen: ontwerp van de DNA-bibliotheek, voorbereiding van de chip, binding van het eiwit doelwit, fluorescerende labeling en scannen. Milde wasstappen zijn van cruciaal belang, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door de ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1023/18).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 fosforimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | Als er meerdere slides worden gebruikt |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
Referenties
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
