DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

Summary

Experimenten met eiwitbinding Microarray (PBM) in combinatie met biochemische assays koppelen de bindende en katalytische eigenschappen van DNA primase, een enzym dat RNA-primers op Template DNA synthetiseert. Deze methode, aangeduid als high-throughput Primase profilering (HTPP), kan worden gebruikt om DNA-bindende patronen van een verscheidenheid aan enzymen te onthullen.

Abstract

DNA primase synthetiseert korte RNA-primers die DNA-synthese van Okazaki fragmenten op de achterblijvende streng door DNA-polymerase tijdens DNA-replicatie initiëren. De binding van prokaryotische DnaG-achtige primases aan DNA vindt plaats in een specifieke trinucleotide-herkennings sequentie. Het is een cruciale stap in de vorming van Okazaki fragmenten. Conventionele biochemische hulpmiddelen die worden gebruikt om de DNA-herkennings volgorde van DNA primase te bepalen, bieden slechts beperkte informatie. Met behulp van een op hoge doorvoer microarray gebaseerde bindende assay en opeenvolgende biochemische analyses, is aangetoond dat 1) de specifieke bindende context (flankerende sequenties van de herkennings plaats) de bindende sterkte van het DNA primase op zijn template beïnvloedt DNA, en 2) sterkere binding van Primase aan het DNA levert langere RNA-primers op, wat duidt op een hogere processiviteit van het enzym. Deze methode combineert PBM en Primase activity assay en is aangewezen als high-throughput Primase profilering (HTPP), en het maakt karakteriseren van specifieke sequentie herkenning door DNA primase in ongekende tijd en schaalbaarheid mogelijk.

Introduction

HTPP maakt gebruik van DNA-bindende microarray-technologie in combinatie met biochemische analyse (Figuur 1) om statistisch specifieke kenmerken van DNA-templates te identificeren die de enzymatische activiteit van DNA primase beïnvloeden. Daarom biedt HTPP een technologisch platform dat een kennis sprong in het veld vergemakkelijkt. De klassieke instrumenten die worden gebruikt om de Primase herkennings locaties te bepalen, hebben niet de mogelijkheid om enorme hoeveelheden gegevens te leveren, terwijl HTPP dat wel doet.

PBM is een techniek die routinematig wordt gebruikt om de bindende voorkeuren van transcriptiefactoren te bepalen naar DNA^1,2; het is echter niet geschikt voor het opsporen van zwakke/voorbijgaande binding van eiwitten aan DNA. In tegenstelling tot de universele PBM die informatie verschaft over de gemiddelde eiwit bindende specificiteit van alle mogelijke sequenties bestaande uit acht basis paren, is HTPP gebaseerd op de bibliotheek van enkel-streng DNA-templates, bestaande uit unieke sequentie-elementen. Dergelijke DNA sequentie elementen omvatten tienduizenden korte (enkele tientallen BP) genomische sequenties, evenals computationeel ontworpen DNA sequenties verrijkt in bepaalde DNA repetitieve sequentie elementen aanwezig in het genoom, die beschikken over verschillende gemiddelde GC inhoud . Een dergelijke aanpak met hoge doorvoer maakt het mogelijk om, op een systematische, kwantitatieve en hypothese-gestuurde manier, de sequentie-gerelateerde eigenschappen te bepalen die belangrijk zijn voor de binding van Primase en de enzymatische activiteit³. In het bijzonder is het belangrijke verband tussen de voorkeuren van Primase-DNA-binding (gemoduleerd door DNA-sequenties flankerende specifieke Tri-nucleotide binding sites) en Primase processiviteit geïdentificeerd voor dit enzymatische systeem⁴.

De nieuwe technologie werd toegepast om onze kennis van de herkenningspunten van Primase te herbekijken, zelfs voor de T7 DNA primase die uitgebreid is bestudeerd⁵. In het bijzonder heeft het opnieuw onderzoeken van klassieke concepten, zoals DNA-herkennings locaties van T7 DNA primase (die bijna vier decennia geleden werden vastgesteld ⁶) met behulp van PROTEÏNE-DNA binding Microarray (PBM) geleid tot ongekend inzicht in functies die verband houden met de flankerende volgorde van deze herkennings locaties³. Verwacht werd dat de sequenties flankerende Tri-nucleotide herkenning plaats van T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') willekeurig zal zijn. In plaats daarvan ontdekten we dat TG-rijke flankerende sequenties de kans van T7 DNA primase vergroten om langere RNA-primers te synthetiseren die wijzen op een toename van processiviteit.

Andere methoden die kunnen worden gebruikt om DNA-bindende eigenschappen van eiwitten in vitro te bestuderen, zijn onder andere de elektroforetisch Mobility Shift assay (EMSA)⁷, DNase I Footprinting⁸, Surface-Plasmon Resonance (SPR)⁹en zuidwestelijke blotting ¹⁰. Dit zijn echter methoden met een lage doorvoer die alleen van toepassing zijn op het onderzoeken van een klein aantal DNA-sequenties. Bovendien is de nauwkeurigheid en gevoeligheid van sommige van deze technieken (bijv. EMSA) laag. Aan de andere kant is in vitro selectie¹¹ een techniek die, net als PBM, kan worden gebruikt voor de identificatie van talrijke bindings sequenties. Echter, lage affiniteit reeksen worden meestal uitgesloten in de meeste toepassingen van in vitro selectie; Daarom is deze benadering niet geschikt voor het verkrijgen van vergelijkende bindingsgegevens voor alle beschikbare reeksen. De universele PBM^{1,2wordt voornamelijk} gebruikt om de bindende kenmerken van transcriptiefactoren van prokaryoten en eukaryoten te karakteriseren, evenals specifieke factoren (bijv. de aanwezigheid van bepaalde liganden, cofactoren, enz.) die kunnen invloed op deze interactie¹².

HTPP breidt de PBM-toepassing uit naar DNA-verwerkings enzymen door ongekende hoge doorvoer statistisch vermogen te combineren met hoge precisie om informatie te bieden over de bindings sequentie context. Dergelijke gegevens zijn nog niet verkregen voor primases en verwante enzymen (die een zwakke/voorbijgaande binding hebben met DNA) als gevolg van bovengenoemde technische beperkingen van andere beschikbare technieken.

Protocol

1. ontwerp van Microarray

Opmerking: DNA-sondes vertegenwoordigen aangepaste 36-nucleotide-sequenties, bestaande uit de herkennings plaats voor T7 DNA primase (GTC), gelegen tussen twee variabele flankerende gebieden, gevolgd door een constante 24-nucleotide sequentie die is aangesloten op een glas Slide³. We gebruikten een 4 x 180.000 Microarray formaat, die het spotten van elke DNA sequentie in zes replicaten mogelijk gemaakt, willekeurig verdeeld over de glijbaan.

1. Ontwerp van de DNA-bibliotheek voor primases met bekende herkennings sequenties
   1. Zorg ervoor dat elke sequentie bestaat uit 60 nucleotiden. Houd de eerste 24 nucleotiden constant (te hechten aan de glazen glijbaan). Variabele regio's moeten de volgende algemene vorm hebben: (N)₁₆GTC (n)₁₇; waarbij N een willekeurig gewenst nucleotide vertegenwoordigt.
   2. Ontwerp de flankerende regio om een specifieke wetenschappelijke vraag aan te pakken (een voorbeeld van het ontwerp wordt weergegeven in de volgende tekst). De flankerende gebieden kunnen worden ontworpen om specifieke functies te bevatten, zoals de herhalings elementen of specifieke symmetrie.
      Opmerking: we hebben acht categorieën van verschillende flankerende sequenties gemaakt, bestaande uit twee of drie specifieke nucleotiden: T en G (groep 1); T en C (groep 2); C en A (groep 3); A en G (groep 4); G, C en T (groep 5); C, T en A (groep 6); G, A en T (groep 7); G, A en C (groep 8). 2.000 verschillende reeksen zijn ontworpen voor elke groep. Elke groep had subgroepen van sequenties met verschillende types en verschillende aantallen van sequentie herhalingen.
   3. Neem een set van negatieve controle sequenties (ontbreekt de specifieke binding site)⁴. De aanwezigheid van dergelijke sequenties valideren van het optreden van specifieke binding in het experiment.
2. Ontwerp van de DNA-bibliotheek voor primases met onbekende herkennings sequenties
   1. Als de herkennings volgorde onbekend is, maakt u de DNA-bibliotheek door de sequenties (met of zonder specifieke kenmerken eerder genoemd) te selecteren uit het genoom van het gewenste organisme (bacteriën, schimmels, enz.).
3. Ontwerp van Microarray Slide
   1. Koop aangepaste dia's (bijv. 4x180K, AMADID #78366) van een commerciële leverancier (voor meer details zie tabel van materialen). Volg elke reeks in zes replicaten, waarbij elke replicatie moet worden gekoppeld aan een willekeurig geselecteerde plek op de dia.

2. Primase DNA binding experiment

Opmerking: de dag vóór (of ten minste 2 h vóór) de PBM, bereid de blokkerende oplossing [2% w/v magere melk in fosfaatbuffer Saline (PBS)] en roer het op een magneetroerder. Filter de oplossing vóór gebruik met een 0,45 μM filter. Voor het opsporen van de Primase binding aan de DNA-strengen, moeten verschillende stappen worden uitgevoerd in de volgende volgorde.

1. Blokkerings procedure
   1. Pre-nat de microarray Slide in een Coplin potje met 0,01% v/v Triton X-100 in PBS (5 min bij 125 rpm op een labrotator).
   2. Was de pakking Slide (ook wel coverslip genoemd) met water en ethanol en droog met perslucht.
   3. Monteer het onderste deel van de stalen hybridisatie kamer (PBM Chamber) met de pakking Schuif naar boven (commercieel label naar boven gericht). Raadpleeg de tabel met materialenvoor meer informatie over de assembly.
   4. Pipet blokkerende oplossing (2% w/v magere melk in PBS) in elke kamer.
   5. Verwijder de microarray-dia uit de Coplin-pot en droog vervolgens de niet-DNA-zijde (het DNA moet aan dezelfde kant staan als het bedrijfs label) en randen met een fijn doekje. Plaats de microarray langzaam op de pakking Slide, Vermijd bubbels (bedrijfs label naar beneden gericht). Monteer en draai de stalen hybridisatie kamer apparatuur onmiddellijk. Incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
   6. Vul één kleurings schaal (het "PBS"-gerecht) met 800 mL verse PBS. Vul een tweede kleurings schaal (de "WASH" Dish) met 800 mL vers bereide 0,5% v/v tween-20 in PBS.
   7. Schroef de PBM kamer en verwijder de microarray Slide-coverslip "sandwich", het verzorgen van de afdichting niet breken. Demonteer het onderwater in de WASSCHAAL door het plaatsen van een tang tussen de glijbaan en de dekslip.
   8. Schud de microarray Slide onderwater en breng snel over naar een Coplin jar.
   9. Was één keer met 0,1% v/v tween-20 in PBS (5 min bij 125 rpm op een labrotator).
   10. Was één keer met 0,01% v/v Triton X-100 in PBS (2 min bij 125 rpm op een labrotator).
   11. Breng de dia snel over naar een Coplin-potje met PBS.
2. Eiwitbinding
   1. Monteer de PBM-kamer zoals eerder beschreven (stappen 2.1.2 – 2.1.3).
   2. Pipet eiwit bindend mengsel met 5 μM T7 DNA primase, 30 mm tris-HCl pH 7,5, 6,5 mm MgCl₂, 30 mm K-glutamaat, 6 mm dithiotreïtol (DTT), 65 μM ribonucleoside trifosfaat (rntp), 2% m/v magere melk, 100 ng/μl boviene serumalbumine (BSA), 50 ng/μl zalm testes DNA, en 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) in elke kamer van de pakking Slide (zonder de rubberen zijkanten aan te raken en zonder bubbels te introduceren).
   3. Spoel de microarray-dia kort door deze in de PBS-schaal te dippen, waardoor overtollig reinigingsmiddel uit het oppervlak van de dia's wordt verwijderd. Veeg de niet-DNA-oppervlakken van de dia af met een fijn doekje.
   4. Verlaag langzaam de microarray-Slide (naar beneden gericht) op de pakking Slide, voorzichtig om lekkage van de ene kamer naar de andere te voorkomen. Onmiddellijk monteren en draai PBM kamer apparaat zonder het introduceren van bubbels. Als bellen vorm geven, kunnen ze worden verwijderd door zachtjes op de stalen kamer te tikken tegen een hard oppervlak.
   5. Incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
3. Fluorescerende antilichaam bevestiging
   1. Schroef de PBM kamer en verwijder de microarray Slide-coverslip "sandwich", het verzorgen van de afdichting niet breken. Demonteer onderwater in de WASSCHAAL met behulp van een tang. Schud de glijbaan onderwater en breng snel over naar een Coplin-potje met PBS.
   2. Monteer de PBM-kamer met dichting Slide zoals eerder beschreven (stappen 2.1.2 – 2.1.3).
   3. Voeg Alexa 488-geconjugeerde anti-zijn antilichaam (10 ng/μL in bindings buffer) toe aan de pakking Slide.
   4. Spoel de dia kort door deze in PBS-schaal als voorheen te dippen, verwijder de dia dan langzaam van PBS, veeg het niet-DNA-oppervlak af en plaats het naar beneden op de pakking schuif.
   5. Inincuberen 30 min bij RT in het donker (fluorescentie sonde is lichtgevoelig) om foto-bleaching te verminderen.
   6. Demonteer de PBM kamer en dekslip als voorheen, het verwijderen van de dekslip onderwater in de WASH Dish.
   7. Spoel de dia's kort door ze in de PBS-schaal te dompelen. Droog de dia's met perslucht. Bewaar in het donker in een schuif kastje tot u klaar bent om te scannen.
4. De microarray-dia scannen
   1. Scan de chip met behulp van Microarray scanner (Raadpleeg de tabel met materialen) met een excitatie van 495 Nm en een emissie van 519 nm en verzamel de mediane intensiteit van de fluorescentie.

3. Microarray data-analyse

Opmerking: alle gegevensverwerking is uitgevoerd met behulp van aangepaste geschreven scripts in MATLAB.

1. Voer de initiële PBM gegevensverwerking met behulp van Wilcoxon Rank Sum test p-waarde zoals eerder beschreven⁴.
2. Gebruik de mediaanwaarde van de bindings intensiteit voor elke DNA-sequentie voor verdere analyse.
3. Vervolgens, met behulp van de One-way ANOVA p-waarden, vergelijken statistische significantie van de waargenomen verschillen in Primase-DNA bindings intensiteiten verkregen voor verschillende groepen van DNA-sondes, zoals hierboven uitgelegd in de DNA-bibliotheek ontwerp sectie³.

4. door de template geleide RNA-synthese gekatalyseerd door T7 DNA primase

1. Bereiding van denaturerende polyacrylamidegel
   1. Om 100 mL gel mengsel te bereiden, combineer 62,5 mL 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1), 42 g ureum, 1,1 g van tris base (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol), 0,55 g boorzuur en 0,4 mL 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing.
   2. Verdeel het mengsel in 14 mL aliquots (de hoeveelheid die nodig is voor één gel van 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) en houd ze beschermd tegen licht bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
   3. Om één denaturerende polyacrylamidegel te bereiden, Voeg 4 μL TEMED en 40 μL van 10% w/v ammonium persulfate toe aan 14 mL van het eerder bereide mengsel, giet het en laat het aan polymeriseren gedurende ten minste 2 uur bij RT. De gel kan gedurende één dag op 4 °C worden bewaard.
2. Monstervoorbereiding
   Opmerking: Bewaar de reagentia, het reactiemengsel en de monsters op ijs.
   1. Om het reactiemengsel te bereiden dat nodig is voor tien reacties, combineer 11 μL 5x activiteit buffer (200 mM tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM dithiothreitol, 250 mM kalium glutamaat, 50 mM MgCl₂), 5,5 μl van 2,5 mm mengsel van nucleotide Tri-fosfaat (ntps), en 5,5 μl van ribonucleotide [bv., ATP, (α-32p) 3000 CI/mmol].
      Opmerking: alle bedragen zijn verhoogd met 10% als gevolg van mogelijke Pipetteer fouten. Radiolabeled ribonucleotiden moeten worden verdund volgens de sterkte van het radioactieve signaal (initiële verdunning is meestal 1:10 of meer).
   2. Breng 2 μL van het reactiemengsel over in tien PCR-buizen.
   3. Voeg 1 μL 100 μM DNA-template toe aan de corresponderende PCR-buis en draai naar beneden.
   4. Voeg 2 μL 16 μM T7 DNA primase toe, spin naar beneden, meng zachtjes en draai weer naar beneden.
   5. Incuberen de reactie bij RT gedurende 20 minuten.
   6. Stop de reactie door 5 μL afschrikkings oplossing toe te voegen (95% formamide, 20 mm EDTA, 0,05% w/v xyleen cyanol en broom fenol Blue), meng en draai naar beneden.
3. Scheiding van RNA-producten door elektroforese door denaturerende polyacrylamidegel en daaropvolgende signaaldetectie
   1. Pre-run de gel voor 1 h (10 mA, 600 V) in 1x TBE buffer (90 mM tris-borate, 2 mM EDTA).
   2. Laad tot 2 μL van elk monster en voer elektroforese (20 mA, 1100 V) in 1x TBE buffer (90 mM tris-borate, 2 mM EDTA).
   3. Droog de gel voor 2 uur bij 80 °C onder een vacuüm.
   4. Stel de fosfer beeldplaat gedurende enkele uren in op radioactieve gel, afhankelijk van de sterkte van het radioactieve signaal.
   5. Noteer het signaal (fotogestimuleerde luminescentie) met behulp van foshorimager (Zie tabel met materialen).

Results

Deze technologische voorsprong voor het in kaart brengen van de Primase bindingsplaatsen maakt het verkrijgen van DNA bindings eigenschappen die moeilijk, zo niet onmogelijk zijn, te observeren met behulp van klassieke gereedschappen. Nog belangrijker is dat HTPP het herbezoeken van het traditionele begrip van de bindende sites van Primase mogelijk maakt. In het bijzonder onthult HTPP bindende specifieke kenmerken naast bekende 5 '-GTC-3 ' herkennings sequenties, wat leidt tot verandering...

Discussion

De PBM-methode is op grote schaal gebruikt om bindende eigenschappen van transcriptiefactoren te onderzoeken en kan ook worden toegepast op DNA-verwerkings enzymen, zoals DNA primase, die binden aan DNA met een lage affiniteit. Er zijn echter bepaalde wijzigingen van experimentele procedures vereist. Het microarray-experiment omvat verschillende stappen: ontwerp van de DNA-bibliotheek, voorbereiding van de chip, binding van het eiwit doelwit, fluorescerende labeling en scannen. Milde wasstappen zijn van cruciaal belang, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution	Merck	1006401000
95% formamide	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody	Qiagen	35310
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer	NEG003H250UC
Boric acid, granular	Glentham Life Sciences	GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA)	Roche	10735094001
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA microarray	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 fosforimager	FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack	Thermo Scientific	12869995	Als er meerdere slides worden gebruikt
Lab rotator	Thermo Scientific	88880025
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63064-500G
Microarray Hybridization Chamber	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A)	Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Potassium glutamate	Alfa Aesar	A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)	New England BioLabs	N0466S
Salmon testes DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
Skim milk powder	Sigma-Aldrich	70166-500G
Staining dish	Thermo Scientific	12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma-Aldrich	93362-500G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Urea	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
Xylene cyanol	Alfa Aesar	B21530