Hier beschreven is een protocol voor directe immuunetikettering van necrotische myovezels in spier cryosecties. Necrotische cellen zijn permeabel voor serum proteïnen, waaronder immunoglobuline G (IgG). Het onthullen van de opname van IgG door myofibers maakt het mogelijk de identificatie en kwantificering van myovezels die necrose ondergaan ongeacht spieraandoening.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Immunolabeling Myofiber degeneratie in spier biopsies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De necrose van spiervezels (myonecrose) speelt een centrale rol in de pathogenese van verschillende spieraandoeningen, waaronder spier dystrofieën. Therapeutische opties aanpakken van de oorzaken van spierdystrofie pathogenese worden verwacht te verlichten spier degeneratie. Daarom is een methode nodig om de mate van celdood in spier biopsieën te testen en te kwantificeren. Conventionele methoden om myofiber degeneratie in situ te observeren zijn ofwel slecht kwantitatief of vertrouwen op de injectie van vitale kleurstoffen. In dit artikel wordt een immunofluorescentie protocol beschreven dat necrotische myovezels vlekken door de opname van immunoglobuline G (IgG) door myovezels te targeten. De IgG-opnamemethode is gebaseerd op celkenmerken die de necrotische ondergang karakteriseren, waaronder 1) het verlies van de integriteit van het plasma membraan met de afgifte van schade-geassocieerde moleculaire patronen en 2) de opname van plasmatische eiwitten. De co-immuunetikettering van myovezels, extracellulaire matrix proteïnen en muis IgG maakt een heldere en eenvoudige identificatie van myovezels met necrotisch lot mogelijk. Deze eenvoudige methode is geschikt voor kwantitatieve analyse en toepasbaar op alle soorten, inclusief menselijke monsters, en vereist geen injectie van vitale kleurstof. De kleuring van necrotische myovezels door IgG-opname kan ook worden gekoppeld aan andere co-immunolabeling.
Inleiding
Striated skeletspieren bestaan voornamelijk uit spiervezels (myofibers), die verantwoordelijk zijn voor de kenmerkende vrijwillige contractiele functie. Deze cellen zijn multinucleated, post-mitotische structuren die mechanische stress die optreedt tijdens de contractie ondersteunen. Structurele stabiliteit van het myofiber membraan (sarcolemma) en de extracellulaire matrix zijn cruciaal voor weefselhomeostase. Satelliet cellen bestaan uit de belangrijkste spier voorloper populatie in volwassen skeletspieren en bestaan in een rusttoestand in gezonde spieren. Na de dood van myofiber wordt de spier regeneratie ondersteund door satelliet cellen na een myogeen programma dat satellietcel activatie, proliferatie, differentiatie en fusie inhoudt om uiteindelijk nieuwe meerkernige myovezels te vormen.
Myofiber ondergang kan optreden in meerdere spieraandoeningen, met inbegrip van mechanisch trauma, ischemie-reperfusie verwondingen, of spier dystrofieën, en het wordt geassocieerd met de necrotische morfologie van dode cellen1,2. Necrotische dood wordt gekenmerkt door de snelle permeabiliteit van het plasma membraan en het vrijkomen van celinhoud in het extracellulaire compartiment3. Het kan voortvloeien uit een niet-gereglementeerde proces waarbij geen goede cel signalering (dat wil zeggen, toevallige necrose), of een georkestreerde intracellulaire traject (dat wil zeggen, gereguleerde necrose). In myofibers, zowel gereguleerde4 en niet-gereglementeerde5 processen kunnen leiden tot necrose. Een typisch gevolg van myonecrose is het vrijkomen van schade-geassocieerde molecuul patronen, het activeren van een krachtige ontstekingsreactie6. De aanwezigheid van macrofagen wordt waargenomen bij ongeveer 48 uur en 72 h na letsel7. Naast hun rol in de klaring van necrotisch puin, zijn ze ook belangrijk in de spier regeneratie van8,9.
Musculaire dystrofieën (MDs) zijn een heterogene groep van pathologieën die vaak het gevolg zijn van een defect in de sarcolemma-structuur. Duchenne spierdystrofie (DMD) is een juveniele X-gebonden ziekte van ongeveer 1 op elke 3.500 mannelijke geboorten wereldwijd10, en wordt veroorzaakt door de afwezigheid van Dystrofine expressie bij de sarcolemma. Chronische degeneratie van het spierweefsel in DMD jongens leidt tot extreme spierzwakte en vroege sterfte. Ontsteking als gevolg van necrotische dood verbetert de cytotoxiciteit, en bevordert spier fibrose en het verlies van spierfunctie11,12. Behandelingen die momenteel in klinische studies gericht zijn op de wortels van spier degeneratieve aandoeningen, zoals gentherapie, worden verwacht om myonecrose te verlichten. Daarom zijn eenvoudige technieken nodig om spier degeneratie nauwkeurig te kwantificeren.
Verschillende methoden worden routinematig gebruikt voor het bewaken van myofiber verlies in vivo. De meting van de enzymatische activiteit van creatine kinase (CK) in het bloed maakt een betrouwbare kwantificering van aanhoudende necrose in spier-en hart weefsels mogelijk. In situ is de kleuring van bij en eosine (H & E) de meest populaire methode die momenteel wordt gebruikt voor de diagnose om de remodelleer van degeneratie-regeneratie te beoordelen. De moleculaire basis van de H & E-etikettering van dode cellen blijft echter onduidelijk. Bovendien zijn kleurwijzigingen die suggereren dat de dood van myofiber in H & E-kleuring relatief subtiel is en niet betrouwbaar en reproduceerbare kwantificering vergemakkelijken. Methoden die DNA-fragmentatie onthullen, zoals de terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick end labelling (TUNEL), onvolkomen label necrotische dood3. Ze zijn ook slecht aangepast om de dood van syncytiële cellen zoals myofibers te monitoren. De injectie van vitale kleurstoffen, zoals Evan's Blue Dye (EBD), vertegenwoordigt een nuttig alternatief voor het beoordelen van myovezels die de integriteit van sarcolemma hebben verloren, maar is niet noodzakelijkerwijs handig in sommige experimentele protocollen. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van EBD in bloedmonsters kan invloed hebben op de resultaten van CK metingen, een colorimetrische assay. Bovendien maakt intracellulaire opname van EBD co-immunolabeling uitdagend. Daarom is een alternatieve methode voor directe etikettering van myofibers die necrose ondergaat van belang.
Het werkingsmechanisme van vitale kleurstoffen berust op het verlies van de integriteit van het plasma membraan in necrotische myovezels en de passieve opname van de geïnjecteerde kleurstof. Evenzo, necrotische myofibers opname bloed eiwitten zoals albumine, waarvoor EBD heeft een sterke affiniteit13,14, immunoglobuline G (IgG), en IgM15. De abnormale aanwezigheid van bloed eiwitten binnen myovezels vertegenwoordigt daarom handige markers voor myonecrose in situ. Kleuring deze eiwitten kunnen een alternatief zijn voor het gebruik van vitale kleurstoffen.
Door gebruik te maken van IgG-opname als een marker van myonecrose in situ, wordt dit protocol gebruikt om de spier degeneratie in de tibialis voorste (TA) van de MDX-Dystrofine-deficiënte muizen te beoordelen. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van alternatieve technieken: 1) het is reproduceerbaar en eenvoudig in de uitvoering ervan; 2) het vereist geen dier behandeling voorafgaand aan de spier inzameling, zoals de injectie van circulerende vitale kleurstoffen, en 3) als elke conventionele immunolabeling, het is compatibel met co-labeling.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Franse en Europese Gemeenschapswetgeving (licentienummer 11-00010).
1. Tragacanth tandvlees bereiding
- Los in een glazen beker 6 g Tragacanth poeder op in 100 mL gedeïoniseerd water. Dek af met folie en laat minstens 3 h. soms handmatig roeren met een metalen spatel als het mengsel snel visceus wordt.
- Laat het Tragacanth mengsel bij 60 °C 's nachts in een waterbad of in de oven. Sluit het bekerglas zorgvuldig af om uitdroging te voorkomen. Roer minstens één keer voordat u gaat aliquoting.
- Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
2. spier collectie
Opmerking: voor dit experiment werd een 4 weken oude mannelijke MDX-muis geofferd door cervicale dislocatie. Deze procedure vereist geen anesthesie en is een humane moord methode in overeenstemming met de lokale wetgeving.
- Dissectie van de tibialis voorste (TA) spier
- Na het scheren van de muis poot leg je de muis op zijn rug en speld je de voeten op een kurken bord met naalden. Met behulp van precisie schaar (of een scalpel) en Tang, verwijder de been huid van de voet naar de knie om de gehele lengte van de tibia en TA bloot.
- Met een schaar, maak een incisie tussen de tibia en TA. Dit vergemakkelijkt de scheiding van de TA van het bot en zorgt voor een gemakkelijke grip op de epimysium. Met behulp van precisie Tang, verwijder voorzichtig de epimysium laag van het oppervlak van de TA.
Opmerking: vanaf deze stap kan de TA meer vatbaar zijn voor droging, wat vermeden moet worden. - In de enkel regio, Isoleer de TA pees van andere pezen met een tang. Trek voorzichtig de TA pees om het te isoleren van de tibia en de omringende spieren.
- Wanneer de TA-buik volledig gescheiden is, houd je de pees omhoog zodat alleen het proximale deel van de TA-spier aan de knie is bevestigd. De proximale pees niet zo dicht mogelijk bij het knie been verbreken.
- Plaats de TA in een gaas dat licht bevochtigd is met zoutoplossing om uitdroging te voorkomen voordat de spier wordt bevroren.
- Pre-cool 70 − 100 mL isopentane in een plastic of polytetrafluorethyleen bekerglas door het gedeeltelijk in vloeibare stikstof te dompelen. Laat het afkoelen tot de isopentane aan de onderkant van het bekerglas een witte vaste stof wordt.
- Op een cirkelvormig stukje kurk (20 mm x 11 mm x 8 mm), plaats ~ 0,5 mL Tragacanth gum. Zorgvuldig pre-label de andere kant van de kurk zodat de biopsie correct kan worden geïdentificeerd na de Vries stap.
- Sluit de TA in het tandvlees met een tang, distale pees. Om geschikte dwarsdoorsneden van de spier, houd de spier met zijn as loodrecht op het oppervlak van kurk. De kwaliteit van de cryosecties zal verbeteren als de biopsie niet volledig is ingebed in het tandvlees. Laat ten minste de helft van de TA (pees zijde) worden blootgelegd door het tandvlees.
- Dompel de kurk met de ingesloten spier snel in de onbevroren, koude isopentane laag. Merk op dat de kurk in de vloeibare isopentane zal zweven. Houd het monster ondersteboven als de spier moet worden ondergedompeld in isopentane. Laat de monsters in de isopentane voor ongeveer 2 min om volledige bevriezing toe te staan.
NB: vanaf dit podium moet de TA bevroren blijven tot cryosectie. Bewaar de spier in droogijs voor lange termijn opslag in een vriezer van 80 °C.
3. cryosnijden
- Stel de cryostaat temperatuur in op-25 °C. Houd de object temperatuur bij ongeveer-20 °C. Bevestig het object in de cryostaat met behulp van de optimale snijtemperatuur (OCT) compound. Trim de spier tot het bereiken van de spier buik en snijd vervolgens 7 − 10 μm secties.
Opmerking: de stabilisatie van de object temperatuur vereist minstens 10 min. - Houd glaasjes die worden gebruikt voor het verzamelen van cryosecties bij kamertemperatuur (RT). Verzamel ten minste twee secties op elke dia. De spier secties zullen automatisch vasthouden en ontdooien bij het contact van de warme glazen glijbaan. Verwijder de dia en houd deze op RT.
- Laat secties ten minste 20 minuten bij RT drogen in een geventileerde omgeving.
- Bewaar de cryosecties op glasplaten bij-80 °C tot gebruik.
4. immunolabelling
- Het ontdooien van dia's bij RT gedurende ten minste 15 minuten in een geventileerde omgeving.
- Het secties gebied afbakenen met een hydrofobe pen. Laat de hydrofobe barrière drogen.
- Bevestig het weefsel met 2% Paraformaldehyde gedurende 10 minuten in een vochtige kamer.
- Was de secties met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 2x voor 5 min per stuk.
- Blokkeer de spier secties met 10% geit serum verdund in PBS voor 1 uur op RT in een vochtige kamer.
- Inbroed de secties voor 2 uur bij RT (of 's nachts bij 4 °C) in een vochtige kamer met de primaire antilichamen verdund in 5% geit serum. Voor eenvoudige IgG opname-etikettering in myovezels, worden alleen secties met konijn-antilichamen voor muismat-laminineinbroed.
Opmerking: andere antigenen van de extracellulaire matrix kunnen worden gericht zolang ze duidelijke etikettering van de omringende extracellulaire matrix van de myovezels bieden. Markers voor spier regeneratie, ontsteking of andere parameters kunnen worden gecombineerd zolang de antilichamen niet worden verhoogd in een muis host. De voor de analyse gebruikte Microscoop moet een aanvullende fluorescentie kleur bevatten. - Was de secties met PBS 3x voor 5 min elk.
- Inbroed de secties met rode fluorescerende geit polyklonale secundaire antilichaam aan konijn IgG H & L en groene fluorescerende geit polyklonale secundaire antilichaam aan muis IgG H & L. incuberen bij RT voor 45 min in een vochtige kamer.
- Wassen met PBS 3x voor 10 min elk.
- Monteer de secties in fluorescerende bevestigings medium met 100 ng/mL 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en dek elke dia af met een dekglaasje.
- Laat drogen gedurende een nacht bij 4 °C vóór beeldvorming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Myovezels worden omgeven door een lamininebevattende extracellulaire matrix. Rode kleuring bebaand de myofibers periferie en maakt identificatie mogelijk. IgG wordt groen weergegeven. Nuclei zijn gekleurd met DAPI en worden blauw gevonden onder de Microscoop. Kernen worden hier echter in wit getoond (Figuur 1). Een zwakke IgG-immunoreactiviteit wordt verwacht in het extracellulaire compartiment, dat kan worden verhoogd in geval van ontsteking. Groene kleuring...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Myofiber necrose is een gemeenschappelijk gevolg van traumatische oefening in normale spieren. Het is goed gecompenseerd door een krachtige regeneratieve capaciteit van de lokale spier voor ouders. Echter, in verschillende spieraandoeningen zoals in MDs, de regeneratieve capaciteit van de satelliet cellen wordt aangetast door chronische myonecrose en overmatige fibrose. Recente bevindingen tonen aan dat spiervezels kunnen sterven door necroptose, een gereguleerde vorm van necrose. Meer in het bijzonder kan de remming van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de Association Française contre les Myopathies met het Translamuscle programma. De auteurs bedanken Dr. Perla Reyes-Fernandez en Dr. Matthew Borok voor hun zorgvuldige lezing van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Vergeet niet om de kurk duidelijk te labelen zodat de ID van het monster na het invriezen kan worden bepaald |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Cryosectie van spieren moet worden uitgevoerd tussen -20 en -25°C. Dikte: 7-10 micrometer. |
| Dakopen | Dako | S2002 | Een hydrofobe barrière rond de spiersecties. Het voorkomt de verspreiding van het medium tijdens incubatie |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Geit anti-muis IgG (H+L) antilichaam, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Verdunning: 1/500 |
| Geit anti-konijn IgG (H+L) antilichaam Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Verdunning: 1/500 |
| Geitenserum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Gebruik bij de blokkeerfase een verdunning van 10% in PBS. Voor incubatie met antilichamen, gebruik een verdunning van 5% in PBS |
| Isopentaan | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Vriesmedium. Moet worden afgekoeld in een beker geplaatst in vloeibare stikstof. |
| mdx muis | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx muizen zijn gemutateerd voor het dystrofine-gen. Vanaf de leeftijd van drie weken worden spieren gekenmerkt door chronische degeneratie |
| Microscoop | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Inbeddingsmatrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Geborek voor het fixeren van cryosectie (2% of 4% PFA kan worden gebruikt) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Verdunningsmedium voor immunolabeling |
| Precisie schaar | FST | fst 14001-12 en fst 14001-14 | Gebruikt voor de verzameling van spieren |
| Konijn antilichaam tegen muis pan-Laminine | Sigma Aldrich | L9393 | Verdunning: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Porties om op +4°C te bewaren |
Referenties
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655(2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
