Een goedkope, geur-beloningsassociatietaak voor het testen van leren en geheugen

Samenvatting

Een associatieve leertaak met geurbeloning werd gebruikt om de differentiële effecten van fysiologische manipulatie op het langetermijn- en kortetermijngeheugen te onderzoeken.

Samenvatting

Robuuste en eenvoudige gedragsparadigma's van appetitief, associatief geheugen zijn cruciaal voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in cellulaire en moleculaire mechanismen van het geheugen. In dit artikel wordt een effectief en goedkoop gedragsprotocol voor muizen beschreven voor het onderzoeken van de effecten van fysiologische manipulatie (zoals de infusie van farmacologische middelen) op de leersnelheid en de duur van het geurbeloningsgeheugen. Representatieve resultaten worden geleverd uit een onderzoek naar de differentiële rol van tyrosinekinasereceptoractiviteit in het kortetermijngeheugen (STM) en het langetermijngeheugen (LTM). Mannelijke muizen werden geconditioneerd om een beloning (suikerkorrel) te associëren met een van de twee geuren, en hun geheugen voor de associatie werd 2 of 48 uur later getest. Onmiddellijk voorafgaand aan de training werden een tyrosinekinase (Trk)-receptorremmer of vehiculuminfusies in de bulbus olfactorius (OB) toegediend. Hoewel er geen effect was van de infusie op de leersnelheid, verminderde blokkade van de Trk-receptoren in de OB selectief de LTM (48 uur), en niet het kortetermijngeheugen (STM; 2 uur). De LTM-stoornis werd toegeschreven aan de verminderde geurselectiviteit zoals gemeten aan de lengte van de graaftijd. Het hoogtepunt van de resultaten van dit experiment toonde aan dat Trk-receptoractivering in de OB de sleutel is tot consolidatie van het olfactorisch geheugen.

Inleiding

De mechanismen van associatieve geheugenvorming zijn eerder onderzocht, voornamelijk op basis van onderzoeken naar angstconditionering in één proef. Veel alledaagse taken hebben echter doorgaans complexere acquisitiepatronen en zijn afhankelijk van herhaalde ontmoetingen. Het doel van dit protocol is om een kosteneffectief gedragsparadigma voor knaagdieren te bieden dat wordt gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van multi-trial appetitief leren en geheugen te begrijpen.

Geurleren dat afhankelijk is van de hoofdbulbus olfactorius (OB) biedt verschillende voordelen voor de studie van het appetijtelijk geheugen voor meerdere proeven. Ten eerste hebben OB-afhankelijke herinneringen een verschillende duur (STM, LTM en intermediate-term memory¹) en vertrouwen ze op hetzelfde moleculaire ^2,3 en structurele mechanisme als elders in de hersenen, waaronder neuromodulatie⁴, langetermijnpotentiëring⁵ en volwassen neurogenese ^6,7,8. Ten tweede, in tegenstelling tot de regio's van hogere orde, zoals de hippocampus, maken OB-afhankelijke geheugens observaties mogelijk van een meer directe overeenkomst tussen experimentatormanipulaties van de perceptuele omgeving en veranderingen in de neurale circuits die verantwoordelijk zijn voor het leren 8,9,10,11 . In dit artikel wordt een OB-afhankelijk associatief leer- en geheugenparadigma beschreven, dat kan worden gebruikt om algemene moleculaire en structurele mechanismen te bestuderen. Het is ontwikkeld om onderzoekers toegang te geven tot de voordelen van olfactorisch leren voor de studie van cellulaire en moleculaire mechanismen van het geheugen.

In onze recente publicatie³ werd het hier beschreven protocol gebruikt om aan te tonen dat de consolidatie van smakelijk geurleren afhankelijk is van activering van de Trk-receptor in de OB. In het onderstaande protocol worden ook gebieden besproken waar het gedragsparadigma kan worden aangepast aan verschillende experimentele behoeften.

In totaal werden in dit onderzoek 27 volwassen mannelijke CD-1-muizen gebruikt, 8 weken oud op het moment van canulatie. Voor de precieze groepsverdelingen en het gebruik van geursets, zie de sectie methoden van onze vorige publicatie³. Mannelijke muizen werden gebruikt om grote fluctuaties in oestrogeenspiegels te voorkomen, omdat eerder onderzoek¹² aantoonde dat het olfactorisch geheugen wordt versterkt door verhoogde oestrogeenspiegels. Deze muizen werden altijd op een 12:12 uur omgekeerde licht/donker-cyclus gehouden en hadden toegang tot water. Tijdens de gedragsexperimenten werd het dieet van de muizen beperkt om ze op ~90% van hun vrije voedingsgewicht te houden. De dieetbeperking begon 3 dagen voor aanvang van het gedragsexperiment. Zoals hieronder zal worden beschreven, wordt dezelfde set muizen gepresenteerd met verschillende geursets om de juiste niveaus van statistische power te bereiken en tegelijkertijd het gebruik van dieren te minimaliseren. Het gedeelte over statistische analyse laat zien hoe rekening kan worden gehouden met de willekeurige variantie die hierdoor kan worden geïntroduceerd.

Protocol

Het onderstaande protocol voldoet aan de richtlijnen voor dierenverzorging van de IACUC op Earlham College.

1. Cannulatie van de bulbus olfactorius

OPMERKING: Voor deze operaties is geen steriele techniek vereist, omdat er geen grote incisies hoeven te worden gemaakt. Elke instelling kan echter verschillen in hun vereisten. Als experimentatoren deze operatie uitvoeren op immuungecompromitteerde muizenstammen, kunnen aanvullende overwegingen nodig zijn. In het algemeen worden onderzoekers aangemoedigd om dit protocol vóór gebruik met hun dierenarts en dierenverzorgingsteam te bespreken en om alle gereedschappen tussen elke operatie schoon te maken en te desinfecteren.

1. Week tijdens het instellen canules en schroeven in een klein bekerglas of petrischaaltje met 32% chloorhexidine om ze gedesinfecteerd te houden.
2. Verdoof muizen met gasvormig 4% isofluraan in zuivere zuurstof en zet ze vast in een stereotactisch apparaat. Zorg er tijdens de operatie voor dat de muizen onder 1,5-2% isofluraan-anesthesie worden gehouden die via een neuskegel wordt toegediend. Bewaak de ademhaling tijdens de operatie. Gebruik oogzalf om uitdroging van de ogen onder narcose te voorkomen.
3. Nadat de muis is vastgezet en niet meer reageert op een stevige kneep van de achtervoet, gebruikt u 32% chloorhexidine om over de bovenkant van het hoofd te wrijven om het incisieoppervlak schoon te maken.
4. Wrijf vervolgens de bovenkant van het hoofd in de rostrale naar caudale richting in met lidocaïne (lokale analgesie).
5. Druk stevig naar beneden om een enkele incisie langs de middellijn te maken met een schoon scalpelmes.
6. Boor met behulp van een boor die aan de stereotaxic is bevestigd twee gaten over de reukbollen voor de geleidecanule (26 G) met behulp van de coördinaten AP +5.0 mm, ML +/-0.75 mm ten opzichte van bregma.
7. Boor twee gaten over de cerebellaire formatie.
   NOTITIE: De locatie van deze schroeven hoeft niet precies te zijn, zorg ervoor dat ze symmetrisch zijn langs de middellijn.
8. Plaats schroeven in de twee gaten over de cerebellaire formatie en gebruik een tissuelijm om deze schroeven aan de schedel te bevestigen.
9. Gebruik de stereotactiek om de geleidecanule (26 G) in de gaten te steken die over de bulbus olfactorius zijn geboord (stap 1.6). Laat de canule DV 1,0 mm zakken.
10. Meng het tandcement in een petrischaaltje. Gebruik een kleine metalen schep om het tandcement langzaam rond de canule te stapelen. Laat het 5 s drogen. Verwijder vervolgens de armen van het stereotactische apparaat en zorg ervoor dat u de geleidecanule er niet uit trekt. Ga door met het stapelen van het tandcement over de hele incisie totdat er een klein kapje is gevormd (zie figuur 1A).
11. Plaats op dit punt dummy-stekkers in de geleidecanule om verstopping te voorkomen.
12. Injecteer onmiddellijk na de operatie ketoprofen (0,2 mg/kg) en zoutoplossing (200 μL) om pijn te verminderen en te rehydrateren. Geef de muizen na de operatie zacht voedsel of hydrogel. Laat muizen niet zonder toezicht achter totdat ze weer bij bewustzijn zijn gekomen om sternaal liggend te blijven.
    OPMERKING: Muizen worden vanaf dit punt ook afzonderlijk gehuisvest.
13. Injecteer zoutoplossing (200 μl) en ketoprofen (0,2 mg/kg) eenmaal daags gedurende twee dagen na de operatie.
14. Weeg de muizen gedurende 2 dagen en tot 5 dagen, (indien nodig) na de operatie, en controleer hun gewicht. Als het gewicht niet binnen twee of drie dagen terugkeert naar het niveau van voor de operatie, overleg dan met de dierenarts over de juiste voedingsmethode.
15. Laat muizen minimaal 7 dagen herstellen voordat je met de gedragstraining begint.

2. Taak Associatieve discriminatie

1. Infusies
   1. Dien als volgt OB-specifieke infusies van de tyrosinekinaseremmer K252a (50 μM; 5% DMSO in zoutoplossing) of vehiculum (5% DMSO in zoutoplossing) toe aan de muizen.
      1. Dien de infusie bilateraal toe aan de OB van de muizen. Injecteer 2,0 μL eindvolume per bol met een infusiesnelheid van 0,2 μL/min en 10 minuten totale infusietijd met behulp van een dubbele injectorpomp.
         OPMERKING: De timing van de manipulatie kan worden aangepast, afhankelijk van het type gedragsonderzoek dat wordt uitgevoerd. De exacte stappen van de infusie zijn specifiek voor elke injectorpomp en staan vermeld in de handleiding van de fabrikant.
      2. Zorg ervoor dat de injectoren ongeveer 5 minuten na de bevalling in de canules blijven om de terugstroming te remmen en de diffusie te bevorderen. (d.w.z. plan in totaal 15 minuten voor elke infusie).
2. Geur sets.
   1. Verdun alle geurstoffen in lichte minerale olie tot een partiële druk van 1,0 Pa met behulp van een vooraf berekende verhouding op basis van de dampspanning (tabel 1).
   2. Gebruik de 5 afzonderlijke geurparen uit tabel 1 (cijfers in de tabel geven het volume aan in μL om 50 ml minerale olie voor 1.0 Pa te mengen).
   3. Om het geurende zand voor te bereiden voor gebruik tijdens de gedragsstappen (paragraaf 2.3 en 3), mengt u 400 μL van de 1.0 Pa geurstof uit stap 2.2.2 voor elke 100 g speelzand.
3. Vormgeving
   OPMERKING: Muizen moeten gedurende een periode van 10 dagen worden gevormd, zoals hieronder beschreven.
   1. Breng muizen naar de behandelkamer en behandel ze de eerste twee dagen na herstel van de operatie gedurende 10 minuten per dag.
   2. Plaats op dag 3 een petrischaaltje gevuld met (+)-limoneen geurend zand in de huiskooien van de muizen en gevuld met ongeveer 10 sucrosekorrels, elk 5 mg in massa.
      OPMERKING: Gebruik 1.0 Pa (+)-limoneen (meng 102 μL in 50 ml minerale olie) als de beloonde geur en gewone minerale olie (het verdunningsmiddel voor de testgeuren) als de onbeloonde geur. Het kiezen van monomoleculaire geurstoffen wordt ook aanbevolen, omdat deze het meest waarschijnlijk nieuw zijn voor muizen.
   3. Vul zowel het zand als de korrels aan op dag 4.
   4. Acclimatiseer de muizen op dag 5 en 6 aan het op maat gemaakte gedragsapparaat, door ze in het apparaat te plaatsen en ze de ruimte te laten verkennen (Figuur 1B,C). Maak het apparaat met behulp van een standaard thuiskooi en poly (methylmethacrylaat) om twee deksels en een zwarte middenverdeler te maken. Zorg ervoor dat zowel de deksels als de middenverdeler 1-2 cm groter zijn dan de huiskooi.
   5. Bereid een petrischaaltje met limoneengeur zand en een andere met zand dat minerale olie bevat. Na acclimatisatie op zowel dag 5 als 6, plaats je beide zandschaaltjes in de testkamer en meng je 10 sucrosekorrels in de naar limoneen geurende schaal om als beloning te dienen. Plaats elke muis gedurende 10 minuten in de testkamer en laat de beloningspellets vrij verkennen en consumeren.
   6. Laat muizen op dag 7 kennismaken met een verkorte versie van de laatste testprocedure door de schaaltjes met limoneengeur en naar minerale olie geurend zand in het gedragsapparaat te plaatsen. Deze keer inclusief de middenverdeler.
      1. Leg een enkele beloning op het naar limoneen geurende zand en plaats de muis in de rustkamer.
      2. Zodra de muis in de rustkamer is geplaatst, tilt u de middenverdeler op zodat de muis de testkamer kan betreden om de met zand gevulde schalen te onderzoeken en erin te graven. Breng de muis terug naar de rustkamer nadat hij de beloningspellet heeft opgehaald of nadat er 5 minuten zijn verstreken.
      3. Herhaal dit proces voor een totaal van 10 proeven voor elke individuele muis. Compenseer de plaatsing van het beloningsgerecht aan de linker- of rechterkant door een generator voor willekeurige getallen te gebruiken. Er zijn geen rustperioden tussen de proeven.
   7. Herhaal op dag 8 de proeven van dag 7, maar begraaf de korrel ook geleidelijk dieper en dieper in het zand.
      OPMERKING: De meeste muizen zouden tegen de 10e^{proef op} dag 8 naar de onzichtbare beloningspellet moeten graven.
   8. Verhoog op dag 9 het aantal proeven tot 20 proeven voor elke muis met de volledige diepe begraving van de sucrosekorrel en het introduceren van de muizen in de testkamer gedurende 1 minuut per proef. Laat muizen in beide schalen graven voor de beloning.
   9. Herhaal op dag 10 de 20 proeven voor elke muis, maar als ze in de niet-beloonde schaal graven voordat ze in de beloonde schaal graven, en beginnen dan met de volgende proef. Laat de muizen die zich eerst in de beloonde (limoneen-geurende) schaal hebben ingegraven de beloningspellet ophalen voordat ze terug naar de rustkamer worden gestuurd.

3. Trainen en testen

OPMERKING: Zodra de muizen zijn begonnen met het betrouwbaar graven naar de onzichtbare, geurige beloningspellets, kan het experiment beginnen.

1. Opleiding
   OPMERKING: De trainingsfase begint twee dagen nadat de vormgeving is voltooid en bestaat uit 20 proeven voor elke muis. Dien voorafgaand aan de training de intrabulbaire infusies van geneesmiddelen/vehicula onmiddellijk toe (zie rubriek 2.1 voor details over de infusie) en begin onmiddellijk na de infusies met de training.
   1. Plaats een muis in de rustkamer.
   2. Plaats twee schaaltjes met zand geparfumeerd met een nieuw geurpaar in de testkamer, waar een beloningspellet in een van de schaaltjes wordt begraven.
   3. Zodra de testkamer klaar is, tilt u de ondoorzichtige barrière op en plaatst u de muis in de testkamer. Breng de muis onmiddellijk terug naar de rustkamer, als de muis eerst in de niet-beloonde schaal graaft (noteer deze proeven als een "0"). Als de muis eerst in de belonende geur graaft, laat hem dan de pellet ophalen en terugbrengen naar de rustkamer. Noteer deze beproevingen als een '1'. Als de proef 1 minuut duurt zonder dat de muis de beloning ophaalt, stuur de muis dan terug naar de rustkamer.
   4. Maak de vaat schoon en vul deze opnieuw en begin aan de volgende proefperiode. Herhaal hetzelfde gedurende 20 pogingen.
2. Testing
   OPMERKING: Geheugentesten kunnen worden uitgevoerd op elke duur die voor de onderzoeker interessant is. In dit experiment werden twee afzonderlijke groepen muizen getest 2 uur (STM) of 48 uur (LTM) na de training, gezien de interesse in de differentiële invloed van K252a op STM en LTM.
   1. Voer tests uit met dezelfde geuren en procedure als beschreven voor de training (paragraaf 3.1).
      OPMERKING: Afhankelijk van de onderzoeksvraag kan het nodig zijn dat de onderzoeker controlegroepen opneemt. In het eerder gepubliceerde experiment werden bijvoorbeeld de effecten van Trk-receptorblokkade op geheugenconsolidatie bestudeerd³. Daarom werd een controlegroep voorafgaand aan de 48-uurs test toegediend met K252a om aan te tonen dat de effecten niet te wijten waren aan interferentie met het ophalen.
3. Statistische analyse
   OPMERKING: SPSS 22.0-syntaxis voor elke stap als voorbeeld als aanvullend bestand .
   1. Voer statistische analyse uit met behulp van lineaire analyse van gemengde effecten. In tegenstelling tot ANOVA's kunnen lineaire modellen met gemengde effecten beter rekening houden met willekeurige effecten en herhaalde maatregelen.
   2. Bereken de afhankelijke maat: 'proportie correct'. Bedenk uit 3.1.3 dat een "1" werd toegekend aan proeven waarbij de muis als eerste de belonende geur ingroeft, en een "0" als de muis als eerste de niet-belonende geur ingroef. Gemiddeld elke vijf proeven om vier proefblokken te maken (TB; bijv. proefblok 1 of TB1 was het gemiddelde van proeven 1-5, proefblok 2 of TB 2 was het gemiddelde van onderzoeken 6-10 enzovoort).
   3. Stel de onafhankelijke variabelen of vaste effecten in als geneesmiddelgroepen (K252a of Medium; Paragraaf 2.1.1) en proefblokken (vanaf 3.3.1). In de representatieve resultaten hieronder worden de variabelen gespecificeerd die voor elke analyse worden gebruikt.
   4. Voeg individuele muizen- en geursets toe die in de muis zijn genest als "willekeurige effecten" om te compenseren voor intrinsieke gedragsverschillen bij de muizen en eventuele effecten van het gebruik van meerdere geursets.
   5. Voer een logit-transformatie uit op de juiste verhouding.
      OPMERKING: De verhouding correct is geen continue, ongebonden afhankelijke variabele. Het schendt dus twee aannames voor lineaire modellen. Daarom wordt de logit-transformatie uitgevoerd.
   6. Gebruik geschatte marginale middelen om post hoc tests uit te voeren op significante interacties die door het volledige model zijn geïdentificeerd; Meerdere paarsgewijze vergelijkingen moeten worden gecorrigeerd voor post hoc testen. Bonferroni of Šidák worden meestal gebruikt.

Resultaten

Zoals beschreven, stelt dit protocol onderzoekers in staat om de invloed van enige manipulatie op leren, STM en LTM te beoordelen. Voorbeeldresultaten van Tong et al, 2018³ worden hier gepresenteerd. De resultaten ondersteunen de hypothese dat blokkade van de Trk-receptor selectief LTM remt, maar niet leren of STM.

Figuur 2A toont de schema's van training, STM-test en LTM-test. Ten eerste werd aangetoond dat K252a-infusies geen invloed hadden op de leersnelheid van een geur-beloningsassociatie. Figuur 2B (Paragraaf 3.1) toont de leersnelheid van zowel de K252a als de voertuiggroepen van Training. Statistische analyse met behulp van een lineair gemengd model werd uitgevoerd met twee vaste effecten, geneesmiddelgroep en proefblok (TB); Muis en geurset genesteld in de muis waren willekeurige effecten. Gegevens van testen (paragraaf 3.2) zijn niet opgenomen in de analyse. Een significant hoofdeffect werd gezien bij studieblokkade (F(3, 183.692) = 43.735, p < 0.001), maar geen effect bij de geneesmiddelengroep (F(1, 85.685) = 0.132, p = 0.717) en geen significante interactie (F(3, 183.692) = 0.111, p = 0.954). Post-hoctests, met behulp van de Šidák-aanpassing, bevestigden dat de K252a en voertuiggroepen tijdens de training op geen van de testblokken verschilden (p > 0,05 voor alle vergelijkingen). TB2, TB3 en TB4 waren significant hoger dan TB1 voor alle vergelijkingen (p ≤ 0,001 in alle gevallen), wat aantoont dat beide groepen met succes de geur-beloningsassociatie leerden aan het einde van 20 trainingsproeven.

Om de effecten van de infusie op STM en LTM te onderzoeken, werd vervolgens dezelfde analyse uitgevoerd en werden gegevens uit de tests opgenomen (sectie 3.2). Het toonde een significante interactie tussen de geneesmiddelgroep en het onderzoeksblok (F(2, 77.558) = 4.043, p = 0.021), zonder significante hoofdeffecten van de geneesmiddelgroep (F(1, 55.629) = 1.438, p = 0.236) of onderzoeksblok (F(2, 69.979) = 1.360, p = 0.263). Om het geheugen specifiek te onderzoeken, vergeleken post hoc paarsgewijze vergelijkingen met Šidák-correctie verschillen tussen het laatste proefblok van Training (Sectie 3.1) en het eerste testblok (Sectie 3.2) ofwel 2 (STM) of 48 uur (LTM) later. Voor muizen met een voertuiginjectie toonden de vergelijkingen behoud van het associatieve geheugen aan zowel 2 als 48 uur na de training (p > 0,05 voor alle vergelijkingen met trainingsprestaties). Voor muizen met K252a verschilde het eerste proefblok van de 2-uurs test (STM) niet van het laatste proefblok van Training (p > 0,05); Hun geheugenprestaties waren echter significant lager na 48 uur (p = 0,018). Bovendien was het geheugen bij de 48-uurstest aanzienlijk verminderd in vergelijking met het geheugen bij de 2-uurstest (p = 0,009) en met de prestaties van de voertuiggroep bij de 48-uurstest (p = 0,006). Er was geen verschil in STM tussen met voertuigen en K252a doordrenkte muizen (p = 0,356). Samen tonen de resultaten aan dat K252a-remming van Trk-receptoren in de bulbus olfactorius selectief het geurgeheugen op lange termijn verstoort, maar niet op korte termijn (Figuur 3).

Geur set	Geur 1	Geur 2
1	Pentaanzuur	Butaanzuur
	225.1	63.6
2	hexanaal	Zevenkamp
	11.1	35.3
3	propylacetaat	Butylacetaat
	3.1	10.9
4	2-octanon	2-heptanon
	87.4	28.7
5	pentanol	hexanol
	37.2	127.3

Tabel 1: Mengvolumes voor geursets. Elke rij toont twee geuren die als paar kunnen worden gebruikt voor de gedragsstappen. Om bijvoorbeeld de eerste "geurset" te gebruiken, maakt u de pentaanzuur- en butaanzuurmengsels. De cijfers in de tabel geven het volume in μL aan dat moet worden gemengd in 50 ml minerale olie voor een concentratie van 1,0 Pa van elke geur. Tijdens training en testen werd het ene petrischaaltje geparfumeerd met pentaanzuur, het andere met butaanzuur.

Figuur 1: Cannulatieplaatsing en gedragsapparaat. (A) Toont de relatieve positie van de canule, de tandcementdop en de schroeven op de kop van de muis. Merk op dat de naalden van de canule tot in de twee bulbus olfactorius reiken, het voetstuk zelf is ingebed in de tandcementkap. De schroeven worden in twee gaten geplaatst die in de schedel over de cerebellaire formatie zijn geboord. De schroeven raken de hersenen zelf niet, maar fungeren als een staartanker voor de tandcementkap. De afbeelding toont de relatieve grootte om de cementkap te maken. (B) Toont het geassembleerde gedragsapparaat. Het lichaam is een typische thuiskooi van muizen. Deksels met gaten voor lucht werden gemaakt van plexiglas. De middenverdeler is ook gemaakt van zwart plexiglas. De deksels moeten gemaakt zijn van plexiglas dat zwaar genoeg is om als een kanaal te kunnen dienen voor de middenverdeler die tijdens de proeven kan worden opgetild en neergezet. (C) Toont één kant van het gedragsapparaat. Merk op dat de middenverdeler iets hoger is dan de kooi om hem gemakkelijk op te tillen. Langs de rand kunnen petrischaaltjes met zand worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Onderzoeksopzet en leerresultaten. (A) Toont het schema van de onderzoeksopzet. Merk op dat de STM- en LTM-groepen onafhankelijk waren (d.w.z. verschillende groepen muizen). De symbolen aan het begin van de blokken geven het tijdstip aan waarop de infusies zijn gegeven. (B) Toont het juiste aandeel voor proeven 1-20 tijdens de training. De resultaten geven aan dat K252a en voertuiggroepen niet verschilden in hun leersnelheid (helling van de lijnen). Foutbalken vertegenwoordigden de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Sterretjes vertonen significante stijgingen in proportie correct in vergelijking met TB1 voor zowel het voertuig als de K252a-cohorten (p ≤ 0,001 voor alle vergelijkingen). Dit cijfer is met toestemming³ overgenomen van Tong et al. 2018. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Differentiële effecten van blokkade van de Trk-receptor op STM en LTM. Toont het juiste aandeel voor proefblok 4 van training en proefblok 1 van zowel de STM- als de LTM-test. Dat wil zeggen dat een lineair gemengd model wordt gebruikt om het juiste aandeel te vergelijken tijdens het laatste proefblok van de trainingsfase (Figuur 2; Training-TB4) aan degenen tijdens de eerste proefblokken (Testing-TB1) van kortetermijn- (2-uurstest) en langetermijn- (48-uurstest) geheugentest. Het lineair gemengde model had twee vaste effecten: geneesmiddelgroep en proefblok (Training-TB4, STM-TB1, LTM-TB1). De willekeurige effecten waren muis en geur set genest in de muis. Uit post-hocvergelijkingen bleek dat K252a-muizen een significant verminderde LTM hadden (vergelijking met training TB4; p = 0,018) maar niet STM (p > 0,05). De LTM-prestaties van muizen met K252a waren ook significant lager dan de STM van muizen met K252a-injectie (p = 0,009) en lager dan de LTM van voertuigmuizen (p = 0,006). Foutbalken vertegenwoordigden de SEM. Dit cijfer is met toestemming³ overgenomen van Tong et al. 2018. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand: Syntaxis gebruikt voor de statistische analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Angstconditionering in één proef is een krachtig gedragsprotocol voor het bestuderen van de moleculaire en cellulaire dynamiek van het geheugen, maar veel van het natuurlijke leren is incrementeel en kan het beste worden gemodelleerd door middel van een paradigma zoals hierboven beschreven. De remming van Trk-receptoren in de OB verhinderde de consolidatie van het olfactorisch geheugen in een multi-trial, appetitief leerparadigma, zoals eerder aangetoond door onze groep³. De bevinding opent nieuwe wegen voor onderzoek naar de differentiële timing van moleculaire mechanismen, zoals neurotrofines, in appetijt en aversief leren.

Dit experiment bestond uit twee cruciale onderdelen: (1) de cannulatie en (2) de associatieve discriminatietaak (onderverdeeld in vormgeven, trainen en testen). Experimentatoren kunnen dit protocol aanpassen aan hun specifieke onderzoeksvraag. We waren bijvoorbeeld vooral geïnteresseerd in de OB en dit gevestigde protocol kan gemakkelijk worden toegepast op andere OB-studies. Voor experimentatoren met andere interessegebieden zal het belangrijk zijn om de infusieplaatsen te valideren in een pilotstudie. Experimentatoren moeten mogelijk ook rekening houden met de diffusiesnelheid, ruimtelijke penetratie en bio-activiteitsduur van wat ze infuseren.

De vormgevingsstappen die in het protocol worden beschreven, zijn uitgebreid gebruikt door de auteurs van dit protocol. Het lijkt belangrijk om je eraan te houden zoals beschreven om de muizen de taak tijdig te laten leren. Met behulp van andere tijdlijnen zagen de auteurs meer variatie tussen de muizen in hun vertrouwdheid met de taak en dit betekende extra training om alle muizen op een criterium te krijgen voor het testen met experimentele geuren. Voor training en testen heeft de onderzoeker, afhankelijk van zijn onderzoeksinteresses, flexibiliteit met het aantal proeven, de concentratie van de experimentele geuren en de gelijkenis van de geuren met elkaar. We raden aan om waar mogelijk meerdere geursets te gebruiken, zoals we hebben beschreven, om het aantal dieren dat voor het experiment wordt gebruikt te verminderen. Zie de sectie Statistische analyse voor de richtlijnen voor het verantwoorden van het gebruik van meerdere ordersets in de uiteindelijke analyse. In principe kan de gelijkenis van het geurpaar worden gevarieerd om de moeilijkheidsgraad van de discriminatie aan te passen. In de eerder gepubliceerde studie van onze groep³ bestaan de geurparen uit twee geurstoffen van dezelfde functionele groep, maar verschilden ze van elkaar met één koolstoflengte. Deze onderscheidingen zijn moeilijker dan paren die twee of meer koolstoflengtes verschillen, maar gemakkelijker dan enantiomeren (bijv. (+)-limoneen en (-)-limoneen). Geurstoffen uit verschillende functionele groepen zijn perceptueel zeer verschillend. Cleland et al¹³ bespreken meer stimulusvariaties en hun effect op specifieke leerparameters.

Een belangrijke beperking van dit protocol is dat het veel langer duurt om uit te voeren in vergelijking met geautomatiseerde associatieve leertaken waarbij meerdere dieren parallel kunnen worden getest. Voor een bepaalde test zou het een onderzoeker minstens 20 minuten kosten om 20 proeven voor één muis te voltooien. Het is echter dit gebrek aan automatisering dat ervoor zorgt dat het protocol financieel toegankelijker is, een prioriteit voor veel instellingen. Belangrijk is dat in het geval van dit experiment is gebleken dat dit protocol zeer handelbaar en effectief is voor het opleiden van niet-gegradueerde onderzoekers met interesse in gedragsneurowetenschappen. In het bijzonder ontwikkelen deze studenten sterke vaardigheden om met dieren om te gaan, naast de gebruikelijke voordelen van deelname aan onderzoek.

Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het aannemen van dit paradigma kunnen verschillende parameters variëren. Het meest duidelijk is dat farmacologische manipulaties van mechanismen divers zijn, en dit gedragsprotocol kan worden gebruikt met chemogenetische technieken of verschillende andere manieren om moleculaire en cellulaire routes te manipuleren (bijv. optogenetica). Het paradigma zelf kan worden aangepast om het soort leren en het geteste geheugen te variëren. Onderzoekers kunnen bijvoorbeeld de gelijkenis van de twee gepresenteerde geuren aanpassen om de leersnelheid te beheersen. In onze studie³ bestaan de geurparen uit twee geurstoffen van dezelfde functionele groep, maar verschilden ze van elkaar door één koolstoflengte. Deze discriminaties zijn moeilijker dan paren die twee of meer koolstoflengtes verschillen, maar gemakkelijker dan enantiomeren (bijv. (+)-limoneen en (-)-limoneen). Geurstoffen uit verschillende functionele groepen zijn perceptueel zeer verschillend. Cleland et al¹³ bespreken meer stimulusvariaties en hun effect op specifieke leerparameters, en concluderen dat meer vergelijkbare geuren moeilijker te onderscheiden zijn en daarom langer duren om te leren¹⁴. Deze manipulaties zouden ook de sterkte van herinneringen beïnvloeden. In deze geest kunnen onderzoekers geïnteresseerd zijn in het testen van het geheugen op verschillende tijdstippen na het leren. Twee studies^15,16 onderzochten bijvoorbeeld de rol van BDNF bij LTM-persistentie voor een aversieve leertaak in één proef. BDNF is een ligand van TrkB. De studies toonden aan dat anti-BDNF-antisense-oligonucleotide-infusie in de hippocampus 12 uur na het leren LTM 7 dagen later blokkeerde, maar niet 2 dagen later. Deze studie toont aan dat de tijdschaal van moleculaire mechanismen na het eerste leren een interessante en nog te begrijpen rol speelt bij LTM. Dit artikel beschrijft een gedragsprotocol dat het mogelijk maakt om deze tijdschema's te onderzoeken. Andere parameters die van belang zijn voor toekomstige toepassing zijn onder meer het gebruikte muismodel. Het zou bijvoorbeeld interessant zijn om mannelijke muizen (die een significant beter bestudeerde neurobiologie hebben)¹⁷ te vervangen door vrouwelijke muizen in toekomstige studies om variaties in de leersnelheid, STM en LTM te onderzoeken, aangezien vrouwelijke zoogdieren een hogere gevoeligheid en selectiviteit voor geuren hebben dan mannelijke zoogdieren¹⁸. Natuurlijk kunnen knaagdiermodellen van ziekten ook effectief worden gebruikt met dit protocol.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Double guide cannula	PlasticsOne	C235GS-5-1.5/SPC	Op bestelling
(-)-limonene	Sigma-Aldrich	218367-50G
(+)-limonene	Sigma-Aldrich	183164-100ML
2-hetanone	Sigma-Aldrich	537683
2-octanone	Sigma-Aldrich	O4709
5mg sucrose pellets	Test Diet	1811560	Op maat gemaakt. Gebruikt voor beloningen
Butanoic acid	Sigma-Aldrich	B103500
butyl acetate	Sigma-Aldrich	402842
Dental Cement Powder (Coral)	A-M Systems	525000
Dental Cement Solvent	A-M Systems	526000
Double connector assembly	PlasticsOne	C232C
Double dummy cannula	PlasticsOne	C235DCS-5/SPC dummy dbl	Op bestelling
Double injector	PlasticsOne	C235IS-5/SPC	Op bestelling
Drill	Kopf Instruments	Model 1474 High Speed Stereotaxic Drill	Deze boor vereist een extra 'adapter' om bepaalde boorkoppen te kunnen gebruiken. We komen dit probleem tegemoet door de boorkop met laboratoriumtape te omwikkelen om de omtrek van de boor te vergroten. Dit is mogelijk niet een optie voor operaties die een steriele techniek vereisen.
Eye Ointment			Koop bij de plaatselijke apotheek
Figure 1 illustration software	BioRender
heptanal	Sigma-Aldrich	W254002
hexanal	Sigma-Aldrich	115606
hexanol	Sigma-Aldrich	H13303
Infusion pump model 11	Harvard Apparatus	4169D	Gebruikte pompen verkrijgbaar via American Instrument Exchange
Isoflurane	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx	Veterinaire recept nodig voor bestelling
K252a	Sigma-Aldrich	K2015	Gemengd tot 50uM in DMSO (5%)
Ketoprofen	Allivet	25920	Veterinaire recept nodig voor bestelling
Lidocaine	Aspercreme		Gekocht bij Amazon
Mounting Screws	PlasticsOne	00-96 X 3/32
Mouse Anesthesia Mask	Kopf Instruments	Model 907 Mouse Anesthesia Mask	Gebruikt met de stereotaxische om zuurstof en anesthesie mogelijk te maken terwijl de muis in stereotax
Mouse Nose Adaptor	Kopf Instruments	Model 926 Mouse Adaptor	Gebruikt met de stereotaxische om de kop van de muis vast te zetten.
Novalsan	Jeffers	41375
Pentanoic acid	Sigma-Aldrich	240370
pentanol	Sigma-Aldrich	138975
Petri dish glass bottoms	VWR	10754-804
Polycarbonate Café bottoms	Ancare	N10PCSEC	Gebruik normale kooien en pas een speciaal ontworpen baan in het midden aan om als baan te fungeren voor een ondoorzichtige plexiglas scheidingswand
propyl acetate	Sigma-Aldrich	537438
Quikrete Premium Play Sand			Koop bij de plaatselijke bouwmarkt
Saline	Insight Needles	N/A	Steriele zoutoplossing voor het mengen van geneesmiddelen
Stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 902 Small Animal Stereotaxic Instrument
Testing chamber	Ancare	N10PCSEC	Onze testkamers zijn aangepast aan de reguliere muizenkooi. De handleiding beschrijft wat er is gedaan.
Vetbond Tissue Adhesive	3M		Gekocht bij Amazon