Coincubation assay voor het kwantificeren van concurrerende interacties tussen Vibrio fischeri isolaten

Samenvatting

Bacteriën coderen diverse mechanismen voor het aangaan van interbacteriële concurrentie. Hier presenteren we een op cultuur gebaseerd protocol voor het karakteriseren van concurrerende interacties tussen bacteriële isolaten en hoe ze van invloed zijn op de ruimtelijke structuur van een gemengde populatie.

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een op cultuur gebaseerde, coincubation assay voor het opsporen en karakteriseren van concurrerende interacties tussen twee bacteriële populaties. Deze methode maakt gebruik van stabiele plasmiden die het mogelijk maken elke populatie te differentieel gelabeld met verschillende antibioticaresistentie capaciteiten en fluorescerende eiwitten voor selectie en visuele discriminatie van elke populatie, respectievelijk. Hier beschrijven we de voorbereiding en coincubatie van concurrerende Vibrio fischeri stammen, fluorescentiemicroscopie beeldvorming en kwantitatieve gegevensanalyse. Deze aanpak is eenvoudig, levert snelle resultaten op en kan worden gebruikt om te bepalen of een populatie de groei van een andere populatie doodt of remt, en of de concurrentie wordt gemedieerd door een diffugeerbaar molecuul of directe celcelcontact vereist. Omdat elke bacterie populatie een ander fluorescerend eiwit uitdrukt, maakt de bepaling de ruimtelijke discriminatie van concurrerende populaties in een gemengde kolonie mogelijk. Hoewel de beschreven methoden worden uitgevoerd met de symbiotische bacterie V. fischeri met voorwaarden die zijn geoptimaliseerd voor deze soort, kan het protocol worden aangepast voor de meeste culturable bacteriële isolaten.

Inleiding

Dit manuscript schetst een op cultuur gebaseerde methode om te bepalen of twee bacteriële isolaten in staat zijn om concurrerende interacties te maken. Bij het bestuderen van gemengde populaties is het belangrijk om te beoordelen in hoeverre de bacteriële isolaten interageren, met name of isolaten rechtstreeks concurreren door middel van interferentie mechanismen. Interferentie concurrentie verwijst naar interacties waarbij één populatie direct de groei remt of een concurrent populatie doodt¹. Deze interacties zijn belangrijk om te identificeren, omdat ze ingrijpende gevolgen kunnen hebben voor de structuur van een microbiële Gemeenschap en de ....

Protocol

1. bereid stammen voor Coincubation

1. Kies een geschikte referentiestam die zal dienen als doelwit voor bacteriële concurrentie tijdens de coincubation assay. Zie discussie voor aanbevolen procedures bij het selecteren van een referentiestam en de invloed van de referentiestam op de resultaten. In dit protocol, V. fischeri stam ES114 zal dienen als de referentiestam.
2. Bepalen welke selectie-en screeningsmethoden zullen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de isolaten in coincubation
   1. Typisch, transformeren stammen met stabiele plasmiden met verschillende antibioticaresistentiegenen (bv. ka....

Resultaten

Om de concurrerende interacties tussen bacteriële populaties te beoordelen, werd een coincubation assay protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd voor V. fischeri. Deze methode maakt gebruik van stabiele plasmiden die antibioticaresistentie-genen en fluorescerende eiwitten coderen, waardoor differentiële selectie en visuele discriminatie van elke stam mogelijk zijn. Door het analyseren van de gegevens verzameld uit de coincubation Assay, het concurrentie resultaat van een interactie.......

Discussie

De coincubation assay die hierboven is beschreven, biedt een krachtige methode om interbacteriële concurrentie te ontdekken. Deze aanpak stond in voor de identificatie van intraspecifieke concurrentie tussen V. fischeri isolaten en de karakterisering van het competitieve mechanisme¹⁹. Hoewel de beschreven methode geoptimaliseerd is voor de mariene bacterie V. fischeri, kan deze gemakkelijk worden aangepast om andere bacteriesoorten te herbergen, waaronder klinische en milieu-isol.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher	05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates	Fisher	07-200-84	steriele met deksel
96-well plates	VWR	10062-900	steriele met deksel
Calculator
Chloramphenicol	Sigma	C0378	stock (20 mg/mL in Ethanol); eindconcentratie in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescentie dissectiemicroscoop met camera en beeldvormingssoftware
Pincet	Fisher	08-880
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	stock (100 mg/mL in water, filter sterieliseer); eindconcentratie in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membraan (FS MCE, 25MM, NS)	Fisher	SA1J788H5	0.22 μm nitrocellulose membraan (pk van 100)
Petri schotels	Fisher	FB0875713	steriele met deksel
Spectrofotometer
Semi-micro cuvettes	VWR	97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter systeem	USA Scientific	1111-3500	10 racks
TipOne 200 μL starter systeem	USA Scientific	1111-500	10 racks
TipOne 1000 μL starter systeem	USA Scientific	1111-2520	10 racks
Vortex
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5)			50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Alleen toevoegen voor platen)
DI water			950 mL
Natriumchloride	Fisher	S640-3	20 g
Tryptone	Fisher	BP97265	10 g
Gist Extract	Fisher	BP9727-2	5 g