Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection

Summary

Biogenese van spliceosomal snRNAs is een complex proces waarbij verschillende cellulaire compartimenten. Hier hebben we een micro injectie met fluorescently gelabelde Snrna's gebruikt om hun transport in de cel te bewaken.

Abstract

Biogenese van spliceosomale Snrna's is een complex proces waarbij zowel nucleaire als cytoplasmatische fasen en de laatste stap optreedt in een nucleair compartiment genaamd de Cajal lichaam. Echter, sequenties die direct snRNA lokalisatie in deze subnucleaire structuur zijn niet bekend tot voor kort. Om de sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor accumulatie van Snrna's in Cajal-lichamen, werkten we met micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna's, gevolgd door hun lokalisatie in cellen. Eerst bereidden we snRNA deletie mutanten voor, synthetiseerde DNA templates voor in vitro transcriptie en transcribeerde Snrna's in aanwezigheid van UTP in combinatie met Alexa488. Gelabelde Snrna's werden gemengd met 70 kDa-dextran geconjugeerd met TRITC, en microgeïnjecteerde naar de Nucleus of het cytoplasma van menselijke HeLa cellen. Cellen werden gedurende 1 uur geïnincubeerd en de Cajal-Body marker coilin werd gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie, terwijl Snrna's en dextran, die dient als een marker van nucleaire of cytoplasmatische injectie, direct werden waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Deze methode maakt het mogelijk om efficiënt en snel te testen hoe verschillende sequenties de RNA lokalisatie in cellen beïnvloeden. Hier tonen we het belang van de SM-bindende sequentie voor efficiënte lokalisatie van Snrna's in de Cajal-body.

Introduction

RNA splicing is een van de cruciale stappen in genexpressie, die wordt gekatalyseerd door een groot RiboNucleoProteïne complex genaamd de spliceosome. In totaal zijn meer dan 150 eiwitten en 5 kleine nucleaire rna's (snrna's) geïntegreerd in de spliceosoom in verschillende stadia van het splicing traject. De Snrna's U1, U2, U4, U5 en U6 nemen deel aan de splitsing van de grote GU-AG introns. Deze snrna's voegen zich bij de spliceosoom als voorgevormde kleine nucleaire RiboNucleoProteïne deeltjes (snrnps) die snrna bevatten, zeven SM-eiwitten geassocieerd met snrna (of like-SM-eiwitten, die associëren met de U6 snrna) en 1-12 eiwitten die specifiek zijn voor elke snRNP.

Assemblage van snRNPs omvat cytoplasmatische en nucleaire stadia. Nieuw getranscribeerd snRNA wordt geëxporteerd naar het cytoplasma waar het verwerft een ring geassembleerd uit zeven SM-eiwitten. De SM-ring dient vervolgens als een signaal voor het opnieuw importeren van snRNA terug naar de Nucleus. Defecte Snrna's die niet associëren met SM eiwitten worden bewaard in het cytoplasma¹. Nieuw geïmporteerde snrnps verschijnen eerst in het lichaam van Cajal waar ze snRNP-specifieke eiwitten ontmoeten en hun rijping voltooien (beoordeeld in referentie^2,3). We hebben onlangs aangetoond dat remming van de uiteindelijke rijpings stappen resulteert in vastlegging van onrijpe snrnps in Cajal-lichamen^4,5. We stelden een model voor waarbij de uiteindelijke rijping van snRNP onder kwaliteitscontrole is die de toevoeging van snRNP-specifieke eiwitten en de vorming van actieve snRNPs bewaakt. Echter, moleculaire Details van hoe cellen onderscheid maken tussen correct geassembleerde volwassen en afwijkende onvolgroeide deeltjes blijven ongrijpbaar.

Om snRNA-sequenties te bepalen die essentieel zijn voor de targeting en accumulatie van Snrna's in nucleaire Cajal-lichamen, hebben we besloten om micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna's in gebruik te nemen. Micro Injection was een methode van keuze omdat: 1) het vereist geen extra sequentie tag om synthetische Snrna's te onderscheiden van hun endogene tegenhangers, wat vooral belangrijk is voor korte Rna's met weinig ruimte voor het inbrengen van extra tagvolgorde; 2) het maakt analyse van sequenties die belangrijk zijn voor biogenese. De SM-reeks is bijvoorbeeld essentieel voor SM-ring assemblage en opnieuw importeren in de Nucleus⁶. Wanneer Snrna's worden uitgedrukt in de cel, Snrna's ontbreekt de SM sequentie zijn afgebroken in het cytoplasma en niet bereiken de Nucleus en Cajal lichamen⁷. Echter, Snrna's zonder de SM sequentie kunnen direct microgeïnjecteerd in de Nucleus en dus een mogelijke rol van de SM sequentie in Cajal lichaam lokalisatie geassageerd.

Hier beschrijven we in detail een micro injectie methode die we hebben toegepast om snRNA-sequenties te bepalen die nodig zijn om Snrna's in de Cajal-Body⁵te targeten. We toonden aan dat SM en SMN binding sites samen noodzakelijk en voldoende zijn om niet alleen Snrna's te lokaliseren, maar verschillende korte niet-Codeer Rna's in het Cajal lichaam. Op basis van Microinjection en ander bewijs, stelden we voor dat de SM-ring die op de SM-bindingsplaats is geassembleerd, het Cajal-lichaam lokalisatie signaal is.

Protocol

1. bereiding van Snrna's voor micro Injection

1. Bereid een DNA-template met de volledige of afgeknotte/gemuleerde versie van snRNA door PCR met behulp van een volgende PCR-instelling: 98 °C voor 60 s, 98 °C voor 15 s, 68 °C voor 30 s, 72 °C gedurende 1 minuut, 98 °C gedurende 15 sec. voor 35x en 72 °C gedurende 5 min.
2. De voorwaartse primer moet een volgorde van de organisator voor in vitro transcriptie bevatten, net stroomopwaarts van het eerste getranscribeerde nucleotide. Amplificatie U2 snRNA-sequentie met behulp van de voorwaartse primer met de T7 promoter en de reverse primer, die eindigt met het laatst getranscribeerd nucleotide (Zie tabel met materialen voor details).
3. Synthetiseren snRNA met behulp van een Kit voor korte RNA-synthese (Zie tabel met materialen voor details) met T7 RNA polymerase. Voeg 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine Cap analoog (M3^{2, 2, 7}G (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml van een RNA-remmer en 500-700 ng van de DNA-sjabloon aan het reactiemengsel en inbroed bij 37 °c 's nachts
4. Voeg 1 μL (2U) DNase toe aan de reactie en bebroed 15 minuten extra bij 37 °C.
5. Isoleren van snRNA door zure fenol/chloroform extractie. Verwijder de bovenste waterfase en voeg 1/10 van het oorspronkelijke volume van 3 M Natriumacetaat toe (pH = 5,2), 3 μL glycogeen voor betere korrel visualisatie en 2,5 volumes van 100% ethanol. Inincuberen gedurende 1 uur bij-80 °C, centrifugeer 10 min bij 14.000 x g en 4 °c.
6. Was de pellet met 70% ethanol en los op in 12 μL Nuclease-vrij water. De gebruikelijke RNA-opbrengst was rond 600 ng/mL. Bewaren bij-80 °C.
7. Bewaak de integriteit van in vitro getranscribeerd Snrna's door agarose gel elektroforeses.
8. Verdun vóór micro injectie RNA tot de uiteindelijke concentratie 200 ng/mL in water dat 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa bevat.

2. cellen

1. Behandel vóór het gebruik de dekstroken met 1 M HCl voor 1 uur, grondig wassen in gedistilleerd water en bewaren in 100% ethanol. Zure behandeling bevordert de hechting van cellen om celpeeling tijdens of na de injectie te voorkomen. Gebruik voor een gemakkelijkere identificatie van geïnjecteerde cellen een dekslip met een rooster.
2. Zaad Hela of andere aanhandige cellen 1 dag voor micro injectie op 12 mm dekstroken (nr. 1 of nr. 1,5) om 50% confluentie te bereiken op het moment van micro injectie.

3. injectie

Opmerking: HeLa-cellen werden microgeïnjecteerd in het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glucose met fenolrood en antibiotica). Injectie werd uitgevoerd met behulp van een injector en een micro manipulator uitgerust met de steriele naald (Zie tabel met materialen voor details). Het gehele microscopisch/micromanipulator systeem werd voorverwarmd tot 37 °C gedurende ten minste 4 uur om fluctuatie van afzonderlijke delen van de Microscoop en de micro injector te voorkomen.

1. Plaats de Petri schaal (30 mm) met 2 mL kweekmedia met de Afdeklijst in het midden in de houder van de Microscoop. Laad 3 μL snRNA-mengsel in de naald met behulp van een micro lader. Installeer de naald in de houder van de micro injector in 45 ° met betrekking tot het oppervlak van de Petri schaal.
2. Om de naald te vinden, gebruik een 10x lange afstand doel. Stel eerst de snelheid grof in op de injector en verlaag de naald totdat deze het kweekmedium raakt. Met behulp van de Microscoop verrekijker, vinden de lichte plek, dat is de plaats waar de naald raakt het cultuurmedium.
3. Verander de snelheid in fijn en verder verlagen van de naald terwijl het kijken naar de Microscoop totdat de punt van de naald wordt waargenomen. Beweeg de naald in het midden van het gezichtsveld en schakel over op een 40x lange afstand doel.
4. Nadat u de doelstelling hebt gewijzigd, selecteert u de cel en verplaatst u de naald boven deze cel. Stel de druk en tijd voor het celcontact in (Zie Tips en probleemoplossing in discussie).
5. Beweeg de naald naar beneden in de cel en stel vervolgens de ondergrens op de micro manipulator in. Let op dat u de naald niet onder de cel beweegt.
6. Nadat u de ondergrens hebt ingesteld, beweegt u de naald terug boven de cel en drukt u op de injectieknop op de joystick van de injector. De naald beweegt automatisch in de cel naar de plaats waar de limiet is ingesteld en injecteert het RNA-mengsel.
7. Om te eindigen, druk op het knop menu op de injector en verwijder de naald uit de houder. Koppel vervolgens de buis los van de injector alvorens de injector en de micro manipulator uit te schakelen.

4. fixatie en kleuring van cellen

1. Na de micro injectie, retourneer de cellen in een CO₂ -incubator en incuberen bij 37 °c gedurende 1 uur.
2. Na de incubatie, spoel de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur, Fix voor 20 min met 4% Paraformaldehyde in 0,1 M buizen pH 6,9, en was drie keer met kamertemperatuur PBS. Als alleen snRNA-lokalisatie wordt geanalyseerd, spoel de cellen dan kort in water en Monteer deze in een afdekmedium met DAPI.
3. In geval van extra eiwit lokalisatie, permeabiliseer de cellen met 0,5% Triton-X100 in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na drie spoelen met PBS, inbroed de cellen met primaire en secundaire antilichamen en na de laatste wasbeurten in PBS en korte spoeling in water, Monteer in een afdekmedium met DAPI.

5. microscopie

1. Als deze niet direct na de montage wordt afgebeeld, slaat u de glaasjes op 4 °C op tot beeldvorming.
2. Verkrijg beelden met behulp van een hoogwaardig fluorescentie microscopisch systeem uitgerust met een immersie doelstelling (60X of 100x/1.4 NA).
3. Zodra microgeïnjecteerde cellen zijn geïdentificeerd, verzamel een stapel van 20 z-secties met 200 nm z stappen per monster en onderworpen aan wiskundige deconvolutie. De maximale projecties of individuele z-stapels werden vervolgens gepresenteerd.
4. Om het fluorescerende signaal te kwantificeren, trekt u regio van belang (ROI) rond een Cajal-lichaam dat wordt geïdentificeerd door coilin-immunokleuring. Meet de intensiteit van het snRNA-signaal in de door coilin gedefinieerde ROI. Bepaal vervolgens de intensiteit van de snRNA-fluorescentie in ROI die willekeurig in het nucleoplasma wordt geplaatst en bereken de verhouding van het RNA-signaal in het lichaam van Cajal en het nucleoplasma.

Results

Voor het monitoren van snRNA lokalisatie en de rol van de SM binding site in Cajal Body targeting, bereidden we een DNA-template voor met de T7 promoter en ofwel de full-length U2 snRNA of U2 snRNA zonder de zeven nucleotiden (AUUUUUG) die de SM binding site vormen. Snrna's werden in vitro getranscribeerd, geïsoleerd en vermengd met TRITC-gekoppelde dextran-70kDa. We microgeïnjecteerde het mengsel dat in vitro getranscribeerd snRNA in de Nucleus of het cytoplasma van HeLa cellen.

Er is al eerd...

Discussion

We werkten met Microinjection van fluorescently gelabelde Snrna's om sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor snRNA-lokalisatie in nucleaire Cajal-lichamen. Door een snelle en vrij eenvoudige bereiding van gelabelde Rna's (voorbereiding van DNA-Template door PCR gevolgd door in vitro transcriptie) biedt de methode een effectieve analyse van hoe verschillende sequenties bijdragen aan RNA lokalisatie. In relatief korte tijd konden we tien verschillende verwijderingen of vervangingen van het snRNA van U2 (referentie

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Voorraadconcentratie 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - hoge glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Bevat 4,5 g⁄L D-glucose, Fenol rood en antibiotica
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Micro-injectienaad van 0,5 µm binnen- en 0,7 µm buitendiameter
Fluoromont G met DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Voorraadconcentratie 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Dekvlakjes met een raster, geen directe ervaring met ze
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethielde cap analoog	Jena Bioscience	NU-853-1	Voorraadconcentratie 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcriptie Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscoop Dekglasjes 12 mm, Nr. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	Voor routinewerk
Microscoop Dekglasjes 12 mm, Nr. 1,5	Paul Marienfeld GmbH	117520	Voor hoge resolutie beelden
Microscoop DeltaVision	GE Healthcare		Voor beeldacquisitie
Microscoop DMI6000	Leica		Voor micro-injectie
Paraformaldehyde 32% oplossing EM-kwaliteit	EMS	15714	Opgelost in PIPES tot de uiteindelijke concentratie 4%
Fenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers voor U2-amplificatie: Forward: 5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Reverse: 5’ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromotersequentie in cursief
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Voorraadconcentratie 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Opgelost in water, voorraadconcentratie 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Opgelost in water, voorraadconcentratie 10%