Hier gepresenteerd is een protocol voor de spontane generatie van neuro sferen verrijkt in neurale voorlopercellen uit hoge dichtheid vergulde neuronen. Tijdens hetzelfde experiment, wanneer neuronen worden verguld met een lagere dichtheid, het protocol resulteert ook in langdurige primaire rat neuron culturen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Primaire neuron cultuur is een essentiële techniek op het gebied van de neurowetenschappen. Om diepere mechanistische inzichten in de hersenen te krijgen, is het essentieel om een robuust in vitro model te hebben dat kan worden misbruikt voor verschillende neurobiologie studies. Hoewel primaire neuron culturen (dat wil zeggen, lange termijn hippocampal culturen) hebben wetenschappers voorzien van modellen, het is nog niet de complexiteit van het hersen netwerk volledig vertegenwoordigen. In het kielzog van deze beperkingen, een nieuw model is ontstaan met behulp van neuro sferen, die een nauwere gelijkenis met het hersenweefsel draagt. Het huidige protocol beschrijft de beplating van hoge en lage dichtheid van gemengde corticale en hippocampal neuronen geïsoleerd van het embryo van embryonale dag 14-16 Sprague Dawley ratten. Dit maakt het mogelijk voor de generatie van neuro sferen en de lange termijn primaire neuron cultuur als twee onafhankelijke platforms om verdere studies uit te voeren. Dit proces is zeer eenvoudig en kosteneffectief, omdat het minimaliseert verschillende stappen en reagentia eerder beschouwd als essentieel voor neuron cultuur. Dit is een robuust protocol met minimale vereisten die kunnen worden uitgevoerd met haalbare resultaten en verder worden gebruikt voor een verscheidenheid aan studies met betrekking tot neurowetenschappen.
Inleiding
De hersenen is een ingewikkelde circuits van neuronale en niet-neuronale cellen. Al jaren proberen wetenschappers inzicht te verwerven in deze complexe machines. Om dit te doen, neurowetenschappers aanvankelijk toevlucht genomen tot verschillende getransformeerde zenuw-gebaseerde cellijnen voor onderzoeken. Echter, het onvermogen van deze klonale cellijnen om sterke synaptische verbindingen en goede axonen of dendrites te vormen hebben de wetenschappelijke belangstelling verschoven naar primaire neuron culturen1,2. Het meest opwindende aspect van de primaire neuron cultuur is dat het een kans creëert om levend....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures met betrekking tot dier werden goedgekeurd door de Commissie voor institutionele dierenethiek van het CSIR-Indisch Instituut voor chemische biologie (IICB/AEC/Meeting/apr/2018/1).
1. voorbereiding van het reagens en de media
- Poly-D-Lysine (PDL) oplossing: bereid PDL-oplossingen voor in concentraties van 0,1 mg/mL in gedeïoniseerd water en bewaar deze in 4 °C tot het gebruik.
- Dissociatie medium: tot 1 L steriel, gefilterd gedeïoniseerd water, de volgende componenten in de respectieve concentraties combineren: natriumchloride (8 mg/mL), kaliumchloride (0,4 mg/mL), kalium fosfaat monobasisch (0....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit protocol is een eenvoudige strategie opgehelderd waarin variabele celplating dichtheden van twee verschillende neurale screenings platforms worden verkregen. Figuur 1a,B illustreert de hechting van cellen na 4 h van het beplating van de neuronen in respectievelijk hoge en lage dichtheid vergulde cellen. Bij het observeren van de juiste hechting van de neuronen zoals weergegeven in Figuur 1, werd het beplat.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft dat hoe door het veranderen van de celplating dichtheden van primaire neuronen, twee variabele neuronale platformen worden verkregen. Hoewel dit een eenvoudige methode is, moet elke stap nauwgezet worden uitgevoerd om de gewenste resultaten te bereiken. Andere voorgaande methoden hebben ofwel gemeld op lange termijn primaire neuron culturen of neurosphere culturen. De meeste primaire neuron cultuur protocollen hebben betrokken de kweek van hippocampal neuronen voor 3-5 weken, maar de meeste hebben.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken CSIR-IICB Animal Facility. G. D. Bedankt ICMR, J. K. en V. G. Thank DST INSPIRE, en D. M. Thanks DBT, India voor hun Fellowships. S. G. erkent SERB (EMR/2015/002230) India om financiële steun te verlenen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Referenties
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
