Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo

8.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59800

⸱

31 augustus 2019

 ,  ,  ,  , 
1Organic and Medicinal Chemistry Division, CSIR-Indian Institute of Chemical Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In dit artikel

Samenvatting

Hier gepresenteerd is een protocol voor de spontane generatie van neuro sferen verrijkt in neurale voorlopercellen uit hoge dichtheid vergulde neuronen. Tijdens hetzelfde experiment, wanneer neuronen worden verguld met een lagere dichtheid, het protocol resulteert ook in langdurige primaire rat neuron culturen.

Samenvatting

Primaire neuron cultuur is een essentiële techniek op het gebied van de neurowetenschappen. Om diepere mechanistische inzichten in de hersenen te krijgen, is het essentieel om een robuust in vitro model te hebben dat kan worden misbruikt voor verschillende neurobiologie studies. Hoewel primaire neuron culturen (dat wil zeggen, lange termijn hippocampal culturen) hebben wetenschappers voorzien van modellen, het is nog niet de complexiteit van het hersen netwerk volledig vertegenwoordigen. In het kielzog van deze beperkingen, een nieuw model is ontstaan met behulp van neuro sferen, die een nauwere gelijkenis met het hersenweefsel draagt. Het huidige protocol beschrijft de beplating van hoge en lage dichtheid van gemengde corticale en hippocampal neuronen geïsoleerd van het embryo van embryonale dag 14-16 Sprague Dawley ratten. Dit maakt het mogelijk voor de generatie van neuro sferen en de lange termijn primaire neuron cultuur als twee onafhankelijke platforms om verdere studies uit te voeren. Dit proces is zeer eenvoudig en kosteneffectief, omdat het minimaliseert verschillende stappen en reagentia eerder beschouwd als essentieel voor neuron cultuur. Dit is een robuust protocol met minimale vereisten die kunnen worden uitgevoerd met haalbare resultaten en verder worden gebruikt voor een verscheidenheid aan studies met betrekking tot neurowetenschappen.

Inleiding

De hersenen is een ingewikkelde circuits van neuronale en niet-neuronale cellen. Al jaren proberen wetenschappers inzicht te verwerven in deze complexe machines. Om dit te doen, neurowetenschappers aanvankelijk toevlucht genomen tot verschillende getransformeerde zenuw-gebaseerde cellijnen voor onderzoeken. Echter, het onvermogen van deze klonale cellijnen om sterke synaptische verbindingen en goede axonen of dendrites te vormen hebben de wetenschappelijke belangstelling verschoven naar primaire neuron culturen1,2. Het meest opwindende aspect van de primaire neuron cultuur is dat het een kans creëert om levende neuronen3te observeren en te manipuleren. Bovendien, het is minder complex in vergelijking met zenuwweefsel, waardoor het een ideale kandidaat voor het bestuderen van de functie en het vervoer van verschillende neuronale eiwitten. Onlangs hebben verschillende ontwikkelingen op het gebied van microscopie, Genomics en proteomica nieuwe mogelijkheden voor neurowetenschappers opgeleverd om neuron culturen4te exploiteren.

Primaire culturen hebben neurowetenschappers toegestaan om de moleculaire mechanismen achter neurale ontwikkeling te verkennen, verschillende neurale signalerings trajecten te analyseren en een meer samenhangend begrip van Synapsis te ontwikkelen. Hoewel een aantal methoden hebben gerapporteerd culturen van primaire neuronen (meestal uit de hippocampal oorsprong5,6,7), een uniform protocol met een chemisch gedefinieerd medium dat de lange termijn cultuur van neuronen maakt is nog steeds nodig. Echter, neuronen verguld met een lage dichtheid worden meestal waargenomen, die niet overleven op lange termijn, waarschijnlijk te wijten aan het gebrek aan trofische ondersteuning8 die wordt geleverd door de aangrenzende neuronen en gliacellen. Sommige methoden hebben zelfs voorgesteld co-culturing van de primaire neuronen met gliacellen, waarbij de gliacellen worden gebruikt als een feeder Layer9. Echter, gliacellen vormen een heleboel problemen als gevolg van hun overmatige groei, die soms de neuronale groei10overschrijven. Vandaar, gezien de bovenstaande problemen, een eenvoudigere en meer kosteneffectieve primaire neurale cultuur protocol is vereist, die kan worden gebruikt door zowel neuro biologen en neuro chemici voor onderzoeken.

Een primaire neuron cultuur is in wezen een vorm van 2D cultuur en vertegenwoordigt niet de plasticiteit, ruimtelijke integriteit, of heterogeniteit van de hersenen. Dit heeft aanleiding gegeven tot de noodzaak van een geloofwaardiger 3D-model genaamd neuro sferen11,12. Neuro sferen presenteren een nieuw platform aan neurowetenschappers, met een nauwere gelijkenis met de echte, in vivo hersenen13. Neuro sferen zijn niet-aanhankelijke 3D-clusters van cellen die rijk zijn aan neurale stamcellen (NSCs), neurale voorlopercellen (Npc's), neuronen en astrocyten. Ze zijn een uitstekende bron voor de isolatie van neurale stamcellen en neurale voorlopercellen, die kunnen worden gebruikt om differentiatie te bestuderen in verschillende neuronale en niet-neuronale kilometerstanden. Opnieuw, variabiliteit binnen neurosphere culturen geproduceerd met behulp van de eerder gerapporteerde protocollen presenteert een barrière voor de formulering van een uniforme neurosphere Culture protocol14.

Dit manuscript presenteert een protocol waarin het mogelijk is om zowel 2D-als 3D-platforms te genereren door de dichtheden van celplating te wisselen van een gemengde corticale en hippocampal-cultuur. Het is waargenomen dat binnen 7 dagen vrij-zwevende neuro sferen worden verkregen uit hoge dichtheid vergulde neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo, die bij verdere cultuur, vormen bruggen en interconnecties door middel van radiale glial-achtige extensies. Evenzo, in de lage dichtheid vergulde neuronen, een primaire neuron cultuur die kan worden gehandhaafd voor maximaal 30 dagen wordt verkregen door het wijzigen van het onderhouds medium twee keer per week.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures met betrekking tot dier werden goedgekeurd door de Commissie voor institutionele dierenethiek van het CSIR-Indisch Instituut voor chemische biologie (IICB/AEC/Meeting/apr/2018/1).

1. voorbereiding van het reagens en de media

  1. Poly-D-Lysine (PDL) oplossing: bereid PDL-oplossingen voor in concentraties van 0,1 mg/mL in gedeïoniseerd water en bewaar deze in 4 °C tot het gebruik.
  2. Dissociatie medium: tot 1 L steriel, gefilterd gedeïoniseerd water, de volgende componenten in de respectieve concentraties combineren: natriumchloride (8 mg/mL), kaliumchloride (0,4 mg/mL), kalium fosfaat monobasisch (0,06 mg/mL), D-glucose (1 mg/mL), dibasisch natriumfosfaat (0,479 mg/mL) en 1 M HEPES [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur; 10 mM]. Vortex alle componenten om het juiste mengen te helpen en op te slaan in 4 °C tot gebruik.
    Opmerking: gebruik het dissociatie medium in ijskoude vorm tijdens dissociatie, maar bij kamertemperatuur (RT) voor wassen en andere doeleinden.
  3. Plating medium: beplating medium bestaat uit het volgende: minimaal Essential medium (MEM) Eagle's met Earle's uitgebalanceerde zoutoplossing (BSS; 88,4%), D-glucose (0,6%), paarden serum (10%), en penicillaire/streptomycine (1%). Combineer de componenten in de respectievelijke verhoudingen en voer de procedure in een afzuigkap uit onder steriele omstandigheden.
    Opmerking: gebruik altijd vers bereid beplating medium om degradatie van een component te voorkomen.
  4. Onderhouds medium: bereid het onderhouds medium voor door het volgende te combineren in de respectieve verhoudingen: neurobasal medium (97%), 0,5 mM commercieel verkregen glutamine monster, B27 serum-vrij supplement (2%), en penicillaire/streptomycine (1%). Combineer de componenten in de respectievelijke verhoudingen en voer de procedure in een afzuigkap uit onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat alle onderdelen vers worden bereid.

2. voorbereiding van de dekstroken

  1. Neem een ronde glazen afdekplaat met een diameter van 12 mm en dompel deze in 1 M zoutzuur (HCl) gedurende 4 uur.
  2. Breng de afdek stroken in gedistilleerd water met behulp van een paar tang en zwenk het zachtjes om het zuur volledig te ontdoen.
  3. Breng de gewassen dekstroken over voor een extra reinigings ronde in een bekerglas met 100% ethanol.
  4. Voordat u de dekstroken gebruikt, droog ze goed in de laminaire kap door ze op tissuepapier te houden.

3. bereiding van poly-D-Lysine gecoate platen voor neuron cultuur

  1. Neem 2 24 goed platen: een voor hoge dichtheid plating en een andere voor lage dichtheid beplating. Open de steriele pakketten alleen in de laminaire kap.
  2. Breng de 12 mm steriele glazen afdekplaten in de 24-pits.
  3. Giet 300 μL PDL-oplossing (0,1 mg/mL in gedeïoniseerd water) in elke put, zodat deze volledig het oppervlak van de dekstroken bedekt.
  4. Wikkel de platen met aluminiumfolie om uitdroging te voorkomen en houd het 's nachts in de CO2 -incubator.
  5. De volgende dag (voor het beplating), aspireren de PDL oplossing en was goed met 300 μL steriel gedeïoniseerd water twee tot drie keer.
  6. Voeg 200 μL vers bereide beplating medium toe en keer de platen terug naar de incubator tot het beplating.

4. verwijdering en onthoofding van de foetus

Opmerking: Steriliseer alle chirurgische instrumenten verpakt in aluminiumfolie in een autoclaaf bij 121 °C (15 psi) gedurende 30 min. Dit omvat een paar stompe-end schaar, Tang, fijne Tang, twee fijne schaar, en een slagader Tang voor de gehele procedure.

  1. Voor het genereren van neuronen en neuro sferen, gebruik een getimede-zwangere Sprague Dawley rat en markeer de dag met vaginale plug detectie als E0.
    Opmerking: de cultuur moet worden uitgevoerd tussen E14-e16.
  2. Op de dag van de cultuur, plaats een steriele glazen Petri plaat op ijs en vul hem met de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van Cold Hank.
  3. Anesthetiseer een E14-e16 zwangere rat met een intraperitoneale (i.p.) injectie van 90 mg ketamine/kg lichaamsgewicht en 10 mg xylazine/kg, dan offeren door het uitvoeren van cervicale dislocatie.
    Opmerking: ratten kunnen ook worden geëerd door een overdosis van pentobarbital of overdosering van ketamine met xylazine of diazepam.
  4. Steriliseer de buik van de moeder door het spuiten van 70% ethanol en maak een V-vormige snede in de buikstreek met behulp van steriele Tang en een paar stompe-end schaar.
  5. Neem de embryonale zakjes voorzichtig op de Petri plaat met koude HBSS-oplossing.
    Opmerking: gebruik niet dezelfde Tang en schaar die alleen voor de huid zijn gebruikt, omdat dit de inwendige organen zal verontreinigen. Gebruik een andere set schaar/Tang voor de inwendige organen.
  6. Neem de embryo's uit de embryonale zakjes in verse, koude HBSS.
  7. Onthapitate het hoofd met steriele schaar.

5. verwijdering van de hersenen en dissectie van de cortex met Hippocampus

  1. Vul voordat u begint 90 mm steriele Petri schaaltjes met koude, steriele HBSS.
  2. Breng de koppen in de steriele gerechten met behulp van steriele, stompe-ended dressing Tang.
  3. Houd onder de stereomicroscoop het hoofd van de snuit regio met steriele, geserkestreerde Tang en verwijder de hersenen door de huid en de schedel open te snijden.
  4. Verzamel alle embryo hersenen op dezelfde manier in de HBSS-oplossing.
  5. Verwijder alle hersenvliezen van de hemisferen en de buik door het vasthouden van de hersenstam.
  6. Verwijder voorzichtig de intacte hemisferen die lijken op champignon caps die de hippocampus en cortex bevatten.
  7. Verzamel de hemisferen met cortex en intact Hippocampus in een conische buis van 15 mL met 10 mL dissociatie medium.

6. dissociatie van corticale en hippocampale weefsel in enkelvoudige neuronen

  1. Laat de verzamelde weefsels te vestigen en aspireren het dissociatie medium, waardoor 5%-10% van medium in het.
  2. Voeg 10 mL vers dissociatie medium toe aan het weefsel en herhaal stap 6,1 tweemaal.
  3. Voeg 4,5 mL dissociatie medium en 0,5 mL 0,25% (1x) trypsine EDTA (ethyleen diamine tetraacetaat) oplossing toe.
  4. Houd het weefsel gedurende 20 minuten in de incubator bij 37 °C, zodat de spijsvertering doorgaat.
  5. Zuig het medium op en voeg opeenvolgend 10 mL dissociatie-en beplating medium toe aan de verteerde weefsels.
  6. Laat de verteerde weefsels te vestigen en aspireren de dissociatie medium. Voeg 2,5 mL beplating medium toe en giet in de basis van een 90 mm steriele schaal.
  7. De verteerde weefsels in de hoek bodem van de schaal met een pipetpunt van 1.000 μL tritureren om het minimale volume te bezetten.
  8. Passeer de verkregen celsuspensie via de celzeef van 70 μm, met uitzondering van stukjes weefsel.
  9. Bepaal de dichtheid van levensvatbare cellen met behulp van de trypan Blue Dye-uitsluitings methode en Tel het aantal cellen in een geautomatiseerd cellen teller.
    1. Voor trypan Blue Dye uitsluitings methode, neem 10 μL van de celsuspensie en 10 μL van 0,4% trypan blauwe vlek, meng grondig, en voeg 10 μL van het mengsel in een van de twee ingesloten kamers van de wegwerp kamer dia's.
    2. Plaats de dia met het mengsel in de celteller en haal de meting op.
      Opmerking: de trypan Blue Dye uitsluitings methode is gebaseerd op het principe dat levende cellen (als gevolg van hun intacte membranen) trypaanse blauwe kleurstof uitsluiten en dus een duidelijk cytoplasma vertonen, in vergelijking met een niet-levensvatbare cel die gemakkelijk trypan blauw zal innemen en blauw zal verschijnen in kleur15.
  10. Verdun het aantal cellen dat is verkregen op plaat 1,5 x 105 cellen/ml voor hoge dichtheid en 20.000 cellen/ml voor lage dichtheid in twee afzonderlijke buisjes die 30 ml elk van het beplating medium bevatten.
  11. Aspirate het eerder toegevoegde beplating medium van elke put en plaat 500 μL cellen gedispergeerd in plating medium in elke put.
  12. Daarna retourneer de platen naar de incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor 4 uur.
  13. Onderzoek de cellen voor hechting onder de Microscoop 4 h na het bekleden.
  14. Als de cellen in beide platen goed worden nageleefd, vervang dan het medium in elk goed met 500 μL vers onderhouds medium en incuberen bij 37 °C.
  15. Cultuur deze neuronen geteeld bij lage dichtheid voor 30 dagen door het veranderen van het onderhouds medium 2x per week.
  16. Cultuur de neuro sferen verkregen uit de met hoge dichtheid geplateerde neuronen in hetzelfde onderhouds medium door ze over te brengen naar de ultra-lage bevestigings platen.
  17. Karakteriseren de neuronen en de neuro sferen door ze te immunokleuring met belangrijke markers. Voor immunocytochemie, eerste fix de cellen/neurospheres met behulp van 4% formaldehyde voor 30 min op de plaat zelf, vervolgens permeabilize de cellen met 0,1% niet-ionische wasmiddel gedurende 10 min.
  18. Voeg primaire antilichamen toe voor beide neuronen (anti-Tuj1, GFAP, O4, tau) en neuro sferen (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 1:300 concentraties en incuberen 's nachts bij 4 °C16.
    Opmerking: de Tuj1 (klasse III β-tubulin) en tau zijn positieve markers voor de primaire neuronen, terwijl GFAP (glial fibrillair zuur eiwit) en O4 (oligodendrocyte marker) negatieve markers zijn voor primaire neuronen17,18. In het geval van neuro sferen, Tuj1, GFAp en nestin dienen allemaal als positieve markers19,20.
  19. De volgende dag de cellen met PBS één of twee keer wassen en passende secundaire antilichamen in PBS toevoegen bij 1:600-concentraties bij RT gedurende 2 uur.
    Opmerking: de anti-muis of anti-konijn secundaire antilichamen worden geselecteerd afhankelijk van de gastheer soorten van het primaire antilichaam toegevoegd. Er moet in gedachten worden gehouden dat de secundaire antilichamen moeten worden geconjugeerd aan fluorescentie derivaten die geschikt zijn voor fluorescentiemicroscopie doeleinden.
  20. Was de cellen een of twee keer opnieuw met PBS.
    1. Voer kern kleuring van de cellen uit met Hoechst 33258 (1 mg/mL stockoplossing in gedeïoniseerd water). Bereid 0,1% Hoechst oplossing in PBS uit de stockoplossing en voeg deze toe aan de cellen.
    2. Inincuberen de cellen met 0,1% Hoechst oplossing voor 30 min, dan weer wassen met PBS.
  21. Voeg 20 μL PBS (of afdekmedium) op de dia toe en monteer de Afdeklijst langzaam met de gekleurde cellen over het gebied van de dia die PBS bevat. Sluit de marges van de dekslip af met dibutylftalaatpolystyreen xyleen (DPX).
  22. Uitvoeren van Imaging van de vaste cellen onder een microscoop bij 10x en 40x vergroting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit protocol is een eenvoudige strategie opgehelderd waarin variabele celplating dichtheden van twee verschillende neurale screenings platforms worden verkregen. Figuur 1a,B illustreert de hechting van cellen na 4 h van het beplating van de neuronen in respectievelijk hoge en lage dichtheid vergulde cellen. Bij het observeren van de juiste hechting van de neuronen zoals weergegeven in Figuur 1, werd het beplat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft dat hoe door het veranderen van de celplating dichtheden van primaire neuronen, twee variabele neuronale platformen worden verkregen. Hoewel dit een eenvoudige methode is, moet elke stap nauwgezet worden uitgevoerd om de gewenste resultaten te bereiken. Andere voorgaande methoden hebben ofwel gemeld op lange termijn primaire neuron culturen of neurosphere culturen. De meeste primaire neuron cultuur protocollen hebben betrokken de kweek van hippocampal neuronen voor 3-5 weken, maar de meeste hebben...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken CSIR-IICB Animal Facility. G. D. Bedankt ICMR, J. K. en V. G. Thank DST INSPIRE, en D. M. Thanks DBT, India voor hun Fellowships. S. G. erkent SERB (EMR/2015/002230) India om financiële steun te verlenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-GFAPAbcamAB7260
Anti- NestinAbcamAB92391
Anti-O4MilliporeMAB345
Anti-TauAbcamAB76128
Anti-Tuj1MilliporeMAB1637
B27 Serum Free Supplement Gibco17504-044
Cell CounterLife technologiesCountess II FL
CO2 IncubatorEppendorfGalaxy 170 R
D-glucose SDFCL38450-K05
EthanolMerck Millipore100983
Fluorescence MicroscopeOlympusIX83 Model
FormaldehydeSigma Aldrich47608
GlutaMax-I SupplementGibco35050-061
GtXMs IgG FluorMilliporeAP1814
GtXMs IgG (H+L)MilliporeAP124C
HEPESSRL16826
Hoechst 33258Calbiochem382061
Horse Serum HiMediaRM10674
Hydrochloric AcidRankemH0100
Laminar HoodBioBaseBBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS Sigma AldrichM-2279
MicroscopeDewinterVictory Model
Neurobasal Medium Gibco21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)BD Falcon353047, 352350 and 3471
90 mm PetridishesHimediaPW001
Penicillin/Streptomycin Gibco15140-122
Poly-D-LysineMilliporeA.003.E
Potassium Chloride Fisher ScientificBP366-500
Potassium Phosphate Monobasic MerckMI6M562401
Sodium Chloride Qualigem15918
Sodium Phosphate Dibasic MerckMI6M562328
StereomicrosopeDewinterZoomstar Model
Triton-X 100SRL2020130
Trypan Blue SolutionGibco15250-061
0.25 % Trypsin-EDTAGibco25200-072

Referenties

  1. Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
  2. Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
  3. Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
  4. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
  5. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
  6. Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797(2016).
  7. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703(2014).
  8. Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
  9. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  10. Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
  11. Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
  12. Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
  13. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  16. Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
  17. Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
  18. Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  19. Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
  20. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
  21. Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449(2014).
  22. Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
  23. Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
  24. Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467(2015).
  25. Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
  26. Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Generatie van neurosferenprimaire neuronencultuurcorticale hippocampale neuronencelplatingsdichtheidtrypsine-EDTA-verteringtrypaanblauw-levensvatbaarheidMTT-assay-levensvatbaarheidkarakterisering via immunovleuringHoechst 33258-kernen
Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.