Hier, muis bloed werd verzameld in de aanwezigheid van een anti-coagulant. De bloedplaatjes werden gezuiverd door iohexol gradiënt medium met behulp van lage snelheid centrifugeren. De bloedplaatjes werden geactiveerd met trombine om te onderzoeken of ze levensvatbaar waren. De kwaliteit van de gezuiverde bloedplaatjes werd geanalyseerd door stromings Cytometry en microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zuivering van bloedplaatjes van muis Blood
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De bloedplaatjes worden gezuiverd van geheel bloed om hun functionele eigenschappen te bestuderen, die van rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), en plasmaproteïnen vrij zouden moeten zijn. We beschrijven hier zuivering van bloedplaatjes uit muis bloed met behulp van drie-voudige meer iohexol gradiënt medium ten opzichte van het bloedmonster volume en centrifugeren in een swingende emmer rotor op 400 x g voor 20 min bij 20 ° c. De terugwinning/opbrengst van de gezuiverde bloedplaatjes was 18.2-38.5%, en de gezuiverde bloedplaatjes waren in een rustende staat, die geen significant aantal van RBC en WBC bevatten. De gezuiverde bloedplaatjes behandeld met trombine toonde tot 93% activering, met vermelding van hun levensvatbaarheid. We hebben bevestigd dat de gezuiverde bloedplaatjes voldoende zuiver zijn met behulp van flow flowcytometrische en microscopische evaluatie. Deze bloedplaatjes kunnen worden gebruikt voor genexpressie, activering, granule release, aggregatie, en adhesie assays. Deze methode kan worden gebruikt voor de zuivering van bloedplaatjes uit het bloed van andere soorten ook.
Inleiding
De bloedplaatjes zijn een component van bloed dat als initiator van bloed het klonteren als reactie op schade in het bloedvat functioneert. Zij verzamelen zich op de plaats van verwonding om de schipmuur1te stoppen. Bloedplaatjes zijn anucleate fragmenten van cytoplasma afgeleid van de megakaryocytes van het beenmerg onder invloed van thrombopoietin en voer de circulatie2. Ze worden beschouwd als metabolisch actief en kunnen sensing extracellulaire omgeving door het activeren van intracellulaire signalering Cascades die resulteren in bloedplaatjes verspreiden, aggregatie, en hemostatische plug vorming1<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muis bloedafname moet worden uitgevoerd met de juiste institutionele zorg voor dieren en het gebruik Comite goedkeuring.
Opmerking: Het bloedplaatjes zuiverings protocol wordt beschreven in een stroomdiagram in Figuur 1.
1. inzameling van bloed
- Voeg 25 µ L van 3,2% natrium citraat (pH 7,2) toe als anti-coagulant en 0,4 mM van Gly-Pro-ARG-Pro (GPRP) in een polypropyleen buis.
-
Verzamel ongeveer 200 µ L van het bloed van de C57BL/6 muis met behulp van retro-orbitale bloeden.
Nota: het bloed kan van om het even welk type van muis ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De samenvatting van de bloed plaat zuivering wordt beschreven in een stroomdiagram (Figuur 1). De stappen omvatten inzameling van bloed van muis gebruikend het retro-orbitale aftappen in aanwezigheid van een antistollings, toevoeging van bloedsteekproef op het iohexol gradiënt middel, centrifugeren in een slingerende emmer rotor bij 400 x g 20 min bij 20 °c. De kwaliteit van de gezuiverde bloedplaatjes werd geëvalueerd met microscopie en Stroom Cytometry na het bevlekken met antilic.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vaak worden bloedplaatjes geïsoleerd door lage snelheid centrifuges die bloedplaatjes-rijk plasma dat een aanzienlijk aantal bloedcellen, cellulaire puin, en plasma-eiwitten die kunnen interfereren met de biochemische en fysiologische analyses en behoeften bevat verdere reiniging21. Daarom is het belangrijk om een snelle en eenvoudige methode te gebruiken die zuivere bloedplaatjes zonder belangrijke verontreinigende stoffen kan opleveren. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft de zuivering van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een start-up financiering van Cincinnati Children's Research Foundation en een universiteit van Cincinnati pilot translationele Grant aan M.N. We willen graag de Cincinnati Children's Hospital Research flow Cytometry core bedanken voor hun diensten.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Marker voor activering van bloedplaatjes |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Centrifugebuisje |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Niet-catalogusartikel | Analyse van bloedplaatjes en vol bloed |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Buisjes voor flowcytometrie |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingrediënt voor kleurbuffer |
| FITC rat anti-muis CD41 | BD Biosciences | 553848 | Bloedplaatjesmarker |
| Flowcytometer | BD Biosciences | Niet-catalogusartikel | Analyse van bloedplaatjes en vol bloed |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Niet-catalogusartikel | Analyse van bloedplaatjes en vol bloed |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Voorkomen van bloedplaatjesklompvorming |
| Hematocriet capillaire buis | Fisher Scientific | 22-362566 | Capillaire buis voor bloedopname |
| Hemavet | Drew Scientific | Niet-catalogusartikel | Bloedcelanalysator |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Celtellingskamer |
| Isofluraan | Baxter | 1001936040 | Gebruikt voor anesthesie van muis |
| Microscoop (Olympus CKX41) | Olympus | Niet-catalogusartikel | Celmonitoring en telling |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradientmedium |
| PE rat anti-muis CD45 | BD Biosciences | 561087 | Wit bloedlichaampje marker |
| PE-Cy7 rat anti-muis TER 119 | BD Biosciences | 557853 | Rode bloedlichaampje marker |
| Pipettips 200 µL, brede hals | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Overbrengen van bloed en bloedplaatjesmonsters |
| Pipettips 1000 µL, brede hals | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Overbrengen van bloed en bloedplaatjesmonsters |
| Fosfaat bufferoplossing (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer voor wassen en verdunnen |
| Natriumchloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Fysiologische zoutoplossing |
| Natriumcitraat | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anticoagulans |
| Kleurbuffer | In-house | Niet-catalogusartikel | Was en verdunningsbuffer |
| Steriele water | In-house | Niet-catalogusartikel | Solvent |
| Centrifuge op tafel | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Centrifuge met draaiende emmerrotor |
| Trombiene | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Agonist voor activering van bloedplaatjes |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer voor Nycodenz-medium |
Referenties
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
