Zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in Streptococcus mutans

Samenvatting

Hier beschreven is een eenvoudige methode voor de zuivering van een genproduct in Streptococcus mutans. Deze techniek kan voordelig zijn bij de zuivering van eiwitten, met name membraan eiwitten en hoge moleculaire massa-eiwitten, en kan worden gebruikt met verschillende andere bacteriesoorten.

Samenvatting

De Elucidatie van de functie van een gen impliceert doorgaans een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild type stammen en stammen waarin het gen van belang is verstoord. Verlies van functie na genverstoring wordt vervolgens hersteld door exogene toevoeging van het product van het verstoorde gen. Dit helpt om de functie van het gen te bepalen. Een eerder beschreven methode omvat het genereren van een Gtfc gen-verstoorde Streptococcus mutans stam. Hier wordt een niet-veeleisende methode beschreven voor het zuiveren van het Gtfc -genproduct uit de nieuw gegenereerde S. mutans -stam na de verstoring van het gen. Het gaat om de toevoeging van een sequentie van polyhistidine-Coding aan het 3 ′ uiteinde van het gen van belang, waardoor eenvoudige zuivering van het genproduct met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie mogelijk is. Voor de genetische modificatie in deze methode zijn geen andere enzymatische reacties nodig dan PCR. Het herstel van het genproduct door exogene toevoeging na gendisruptie is een efficiënte methode voor het bepalen van de genfunctie, die ook kan worden aangepast aan verschillende soorten.

Inleiding

Analyse van de functie van een gen impliceert meestal een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild-type stammen tot stammen waarin het gen van belang is verstoord. Zodra de door het gen verstoorde stam wordt geproduceerd, maakt exogene toevoeging van het genproduct een functioneel herstel mogelijk.

De meest voorkomende methode voor het verkrijgen van gezuiverde genproducten die nodig zijn voor daaropvolgende restauratie testen is door heterologeuze expressie in Escherichia coli¹uit te voeren. Echter, de expressie van membraan eiwitten of hoge moleculaire massa eiwitten is vaak moeilijk met behulp....

Protocol

Opmerking: Generatie van S. mutans ∆gtfc, waarin de volledige coderende regio van het gtfc -gen wordt vervangen door SPC^r, moet worden voltooid voordat deze protocollen worden uitgevoerd. Raadpleeg het gepubliceerde artikel voor meer informatie over generatie⁵.

1. ontwerp van de primer

1. Bereid primers voor de bouw van S. mutans zijn-gtfc.
   Opmerking: De in dit Protocol gebruikte primer sequenties worden weergegeven in tabel 1. Two-Step Fusion PCR-methode voor de generatie va....

Resultaten

Figuur 3 toont de grootte van elke ampliconlengte voor Temp van de eerste PCR (Figuur 3a) en de tweede PCR (Figuur 3b). De grootte van elke ampliconlengte voor temp correspondeerde met de voorspelde grootte, zoals beschreven in tabel 1. Fig. 4a toont S. mutans kolonies getransformeerd met het tweede PCR product en verguld op de BHI agar platen m.......

Discussie

Het ontwerp van primers is de meest kritieke stap in het protocol. De sequenties van de gtfc-reverse en SPC^r-forward primers werden automatisch bepaald op basis van de sequenties van zowel het 3 ′ eindgebied van gtfc als het 5 ′ eindgebied van SPC^r. Elke primer bevat 24 complementaire basissen die coderen een GS linker en een zijn-tag-coding sequentie in hun 5 ' regio's. Verstoring van de inheemse regelgevings sequenties gelegen in de upstream flankerende regio's .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	Voor agarose gel elektroforese
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerob cultuur systeem
Anti-His-Tag monoklonaal antilichaam	MBL	D291-7	HRP-geconjugeerd
BCA eiwit assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Meetinstrument voor eiwitconcentratie
Brain heart infusion bouillon	Becton, Dickinson	237500	Bacterie cultuurmedium
CBB R-250	Wako	031-17922	Voor biofilm kleuring
Centrifugale ultrafiltratie unit	Sartorius	VS2032	Buffer vervanging en eiwitconcentratie
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatografische kolom	Bio-Rad	7321010	Voor IMAC
Dialyse membraan klem	Fisher brand	21-153-100
Dialysebuis	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	Hoge-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substraat	Bio-Rad	170-5060	Voor western blotting
EDTA (0,5 M pH 8,0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer bereiding
Elektroporatio kuvet	Bio-Rad	1652086	0,2 cm spleet
Elektroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr oplossing	Nippon Gene	315-90051	Voor agarose gel elektroforese
Gel band snijder	Nippon Genetics	FG-830
Gel extractie kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extractie uit agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	Voor SDS-PAGE en western blotting
Imidazol	Wako	095-00015	Binding buffer en elutie buffer bereiding
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperatuur instelling: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperatuur instelling: 37 °C
Membraan filter	Merck Millipore	JGWP04700	0,2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Bereiding van binding buffer en elutie buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Bereiding van binding buffer en elutie buffer
NaOH	Wako	198-13765	Bereiding van binding buffer en elutie buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammoniumsulfaat precipitatie
Ni-geladen hars	Bio-Rad	1560133	Voor IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Op bestelling
Eiwit standaard	Bio-Rad	161-0381	Voor SDS-PAGE en western blotting
Solvent filtratie apparaat	As One	FH-1G
Spectinomycine	Wako	195-11531	Antibiotica; gebruik bij 100 μg/mL
Steriele spuit filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0,22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock stam in het lab.		gtfC vervangen door spcr
Streptococus mutans UA159	Stock stam in het lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type stam
Sucrose	Wako	196-00015	Voor biofilm ontwikkeling
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	Voor agarose gel elektroforese
Thermische cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer bereiding