Methodenartikel

Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

DOI:

10.3791/59821

⸱

26 september 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is het isoleren van mononucleaire cellen die zich in de lamina propria van de dikke darm bevinden door enzymatische vertering van het weefsel met collagenase. Dit protocol maakt een efficiënte isolatie van mononucleaire cellen mogelijk, wat resulteert in een enkelvoudige celsuspensie die op zijn beurt kan worden gebruikt voor robuuste immunophenotypering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De darm is de thuisbasis van het grootste aantal immuuncellen in het lichaam. De kleine en grote intestinale immuun systemen politie blootstelling aan exogene antigenen en moduleren reacties op krachtige microbieel afgeleide immuun stimuli. Om deze reden, de darm is een belangrijke doelsite van immuun disregulatie en ontsteking bij vele ziekten, met inbegrip van maar, niet beperkt tot inflammatoire darmziekten zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, transplantaat-versus-host ziekte (GVHD) na bot beenmergtransplantatie (BMT), en vele allergische en infectieuze aandoeningen. Murine modellen van gastro-intestinale ontsteking en colitis worden intensief gebruikt voor het bestuderen van GI complicaties en vooraf klinisch optimaliseren strategieën voor preventie en behandeling. Gegevens uit deze modellen via isolatie en fenotypische analyse van immuuncellen uit de darm is van cruciaal belang voor verder immuun begrip dat kan worden toegepast op het verzachten van gastro-intestinale en systemische inflammatoire aandoeningen. Dit rapport beschrijft een zeer effectief protocol voor de isolatie van mononucleaire cellen (MNC) van de dikke darm met behulp van een gemengde dichtheidsgradiënt interface op basis van silica. Deze methode reproduceert een significant aantal levensvatbare leukocyten, terwijl het contaminerende vuil minimaliseert, waardoor daaropvolgende immuunfenotyping door Flowcytometrie of andere methoden mogelijk is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel de gastro-intestinale (GI) tractus is voornamelijk gewijd aan de verwerking en reabsorptie van voedingsstoffen uit voedsel, het GI-tractus onderhoudt ook centrale rollen in de integriteit van de vasculaire, lymfatische, en zenuwstelsel en van tal van andere organen via het mucosale en submucosale immuunsysteem1. Het GI-immuunsysteem heeft een invloedrijke rol in zowel de gastro-intestinale en systemische gezondheid als gevolg van de constante blootstelling aan buitenlandse antigenen uit voedsel, commensale bacteriën, of binnenvallende pathogenen1,2. Zo moet het GI-immuunsysteem een delicaat evenwicht behouden waarin het niet-pathogene antigenen tolereert terwijl het adequaat reageert op pathogene antigenen1,2. Wanneer de balans van tolerantie en verdediging wordt verstoord, gelokaliseerde of systemische immuun disregulatie en ontsteking kan optreden resulterend in een groot aantal ziekten1,2,3.

De darm herbergt ten minste 70% van alle lymfoïde cellen in het lichaam4. De meeste primaire immunologische interacties betreffen ten minste één van de drie immuunstations in de darm: 1) Peyer's patches, 2) Intraepitheliale lymfocyten (IEL) en 3) lamina propria lymfocyten (LPL). Elk van deze bestaat uit een complex verbonden netwerk van immuuncellen die snel reageren op normale immuunproblemen in de darm5. Beperkt tot de stroma boven de Muscularis mucosae, de losjes gestructureerde lamina propria is het bindweefsel van het darm slijmvlies en omvat steigers voor de villus, de vasculatuur, lymfedrainage, en mucosale zenuwstelsel, evenals vele aangeboren en adaptieve immune deelverzamelingen6,7,8,9. LPL bestaat uit CD4+ -en CD8+ T-cellen in een geschatte verhouding van 2:1, plasmacellen en myeloïde Lineage cellen, waaronder dendritische cellen, mestcellen, eosinofielen en macrofagen6.

Er is een groeiende belangstelling voor het begrijpen van de immuun disregulatie en ontsteking van de darm als het betrekking heeft op verschillende ziektetoestanden. Dergelijke aandoeningen als de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa manifesteren alle verschillende niveaus van Colon ontsteking10,11,12. Bovendien kunnen patiënten met maligne of niet-maligne aandoeningen van het merg of het immuunsysteem die een allogene beenmergtransplantatie ondergaan (Allo-BMT) verschillende vormen van colitis ontwikkelen, waaronder 1) directe toxiciteit van conditionerings regimes vóór BMT, 2) infecties veroorzaakt door immunosuppressie na BMT en 3) Graft-versus-hostziekte (gvhd) die wordt aangedreven door donor-type T cellen die reageren op donor Allo-antigenen in de weefsels na BMT13,14,15. Al deze complicaties na BMT resulteren in significante veranderingen in het immuunmilieu van de darmen16,17,18. De voorgestelde methode maakt een betrouwbare beoordeling van de accumulatie van immune cellen in de muis Colon mogelijk en, wanneer toegepast op muriene ontvangers na BMT, vergemakkelijkt een efficiënte assay van zowel donor-als ontvangende immuuncel die betrokken zijn bij transplantatie tolerantie19 ,20. Extra oorzaken van ontsteking van de darm zijn maligniteiten, voedselallergieën, of verstoring van het microbioom van de darmen. Dit protocol biedt toegang tot de darm mononucleaire cellen van de dikke darm en, met wijzigingen, aan leukocyten van de dunne darm in een van deze preklinische Murine modellen.

Een PubMed zoeken met behulp van de zoektermen "darm en immune cel en isolatie" onthult meer dan 200 publicaties beschrijven methoden voor de spijsvertering van de dunne darm om immune cellen te extraheren. Echter, een soortgelijke literatuur zoeken naar Colon levert geen goed afgebakende protocollen specificeren isolatie van immune cellen van de dikke darm. Dit kan zijn omdat de dikke darm meer gespierde en interstitiële lagen heeft, waardoor het moeilijker om volledig te verteren dan de dunne darm. In tegenstelling tot bestaande protocollen, gebruikt dit protocol specifiek Collagenase E van Clostridium histolyticum zonder andere bacteriële collagenasen (Collagenase D/Collagenase I). We tonen aan dat, met behulp van dit protocol, de vertering van het Colon weefsel kan worden bereikt met behoud van de kwaliteit van geïsoleerde gut mononucleaire immuuncellen (MNC) zonder toevoeging van anti klonter reagentia zoals natrium versenate (EDTA), Dispase II, en deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Dit protocol is geoptimaliseerd om toe te staan reproduceerbare robuuste extractie van levensvatbaar MNC van de Murine Colon voor verdere gerichte studies en moet zich lenen voor de studie van immunologie van de dikke darm of (met modificaties) de dunne darm24, 25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle studies werden uitgevoerd onder onderzoeksprotocollen voor knaagdieren die werden beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami Miller school of Medicine, die voldoet aan de veterinaire normen vastgesteld door de American Association voor laboratoriumdieren Wetenschappen (AALAS).

1. voorbereiding van de oplossingen

  1. Zoals beschreven in tabel 1, bereid de Colon buffer, op silica gebaseerde dichtheids scheiding Media 100%, op silica gebaseerde dichtheids scheiding media 66%, op silica gebaseerde dichtheids scheiding media 44%, Collagenase E-spijsvertering buffer en FACS-buffer.
    1. Bereid de Colon buffer voor op de dag voorafgaand aan de procedure en bewaar deze 's nachts bij 4 °C.
    2. Bereid 100% dichtheid scheidings media op basis van silica de dag voorafgaand aan de procedure en opgeslagen op 4 °C, op kamertemperatuur de ochtend van de procedure om te ontdooien.
    3. Bereid 66% en 44% scheidings media op basis van silica in de ochtend van de isolatie, met behulp van kamertemperatuur 100% dichtheid scheidings media op basis van silica en Colon buffer.
    4. Meet de juiste hoeveelheid Clostridium histolyticum-afgeleide Collagenase E en bewaar bij-20 °c 's nachts voorafgaand aan de procedure. De volgende ochtend, oplossen in het juiste volume van de Colon buffer te afleiden Collagenase spijsvertering buffer. Voor alle incubaties met collagenase-Vergistings buffer op de dag van de procedure, Verwarm de oplossingen voor op 37 °C.
  2. Houd voor de hele Protocol stappen één centrifuge bij 20 °C en de rotatiesnelheid van 859 x g, met remmen geïnactiveerd (0 vertraging) bij gradiënt centrifugeren. Zet een andere op 4 °C en rotatiesnelheid van 859 x g, met de standaard vertraging, voor wasstappen.

2. de dikke darm oogsten

  1. De muis euthanaseren via co2 verstikking gevolgd door een door aalac goedgekeurde bevestigingsmethode.
  2. Plaats de muis in rugligging en spuit de vacht met 70% ethanol. Met behulp van grote weefsel schaar, maak een verticale middenlijn incisie en bloot het intact peritoneum.
  3. Met behulp van fijne dissectie schaar, open het peritoneum. Gebruik de tang om de dunne darm naar een kant te bewegen en de aflopende dikke darm bloot te leggen. Trek een beetje omhoog op de aflopende dikke darm om het rectale gedeelte van de dikke darm maximaal bloot te stellen. Snijd het distale rectum diep in het bekken en ontleden en verwijder de gehele dikke darm als één eenheid, van het distale rectum tot de cecal-dop.
  4. Breng de dikke darm in 20 mL gekoelde Colon buffer in een polypropyleen buis van 50 mL.

3. het Colon schoonmaken

  1. Plaats de dikke darm op een vochtige papieren handdoek en extraheer de stevige ontlasting door milde druk toe te passen op de darmwand met het stompe uiteinde van een schaar of een tang.
  2. Plaats de Colon in een Petri schaaltje en spoel de darm met 10 mL gekoelde Colon buffer met een 10 mL spuit met 18 G botte vulnaald.
  3. Breng de dubbele punt over in een dubbele Colon buffer met een vochtige papieren handdoek en verwijder het mesenterie en vet met het scherpe uiteinde van de schaar.
  4. Plaats de Colon in een Petri schaaltje gevuld met 5-10 ml gekoelde Colon buffer roeren handmatig te wassen overgebleven Colon inhoud. Herhaal 2-3 keer.
  5. Snijd de dikke darm longitudinaal van zijn meer gespierde rectale uiteinde naar de proximale Colon (het genereren van een enkele rechthoekige open Colon stuk) in een Petri schaaltje gevuld met verse gekoelde Colon buffer. Gooi bestaande media weg en vul aan met een schone, gekoelde Colon buffer.
  6. Was de darm 3 keer door deze krachtig in de Petri schaal te zwengelen en de 5-10 mL gekoelde Colon buffer na elke wasbeurt te vervangen.
  7. Plaats het rechthoekige Colon weefsel op een papieren handdoek bevochtigd met de Colon buffer en snijd het door het horizontaal te snijden en vervolgens in kleine fragmenten (3 mm x 3 mm secties).
  8. Verzamel de dubbele punt fragmenten voorzichtig met behulp van fijne Tang in 20 mL gekoelde Colon buffer in een 50 mL polypropyleen conische buis.
  9. Was de dubbele punt fragmenten 3 keer, elke was in 20 mL Colon buffer, door krachtig wervelende de buis voor 30 s. tussen elke agitatie, laat de weefsel fragmenten te vestigen op de bodem van de buis. Decanteren of vacuüm aspireren de supernatant terwijl het voorkomen van weefsel fragment verlies in het aspiratie proces tussen elke wasbeurt.
    Opmerking: Het is niet nodig om de buis na elke wasbeurt te veranderen.

4. de spijsvertering van Collagenase 1

  1. Voeg 20 mL van de Collagenase-Vergistings buffer toe aan de gewassen Colon fragmenten in de polypropyleen conische buis van 50 mL.
  2. Plaats de gesloten 50 mL Tube bij 37 °C in een geïnineerd orbitaal shaker met de rotatiesnelheid ingesteld op 2 x g gedurende 60 min. Zorg ervoor dat de weefsel fragmenten constant in beweging zijn tijdens het schudden; Verhoog indien nodig de rotatiesnelheid stapsgewijs om er zeker van te zijn dat er geen weefsel fragmenten op de bodem van de buis komen te zitten.

5. bereid op silica gebaseerde scheiding van media gradiënten

  1. Bereid 66% en 44% op silica gebaseerde dichtheids scheidings media, met behulp van 100% dichtheid scheidings media op basis van silica bij 20 °C (kamertemperatuur) en Colon buffer.
  2. Giet 5 mL 66% dichtheid scheidings media op basis van silica in elk van de 3 afzonderlijke polypropyleen buizen van 15 mL. Bereid 3 tubes per dikke darm. Dit vormt de hogere dichtheids basis van de verloop isolatie procedure, waarop de scheidings media met een lagere dichtheid zullen worden gelaagd om het scheidings verloop te creëren.
  3. Bewaren bij 20 °C tot gebruik.

6. verzameling van supernatant van de spijsvertering 1

  1. Verzamel alleen de supernatant met een serologische Pipet van 25 mL en filtreer het supernatant door een 40 μm porie filtratie weefsel celzeef in een schone polypropyleen conische buis van 50 mL, nadat Collagenase spijsvertering 1 is voltooid. Wees voorzichtig dat u geen bestaande weefsel fragmenten aspireren.
    Opmerking: Resterende zichtbare weefsel fragmenten in de buis behouden. Deze zullen tweede Collagenase-spijsvertering ondergaan (stap 8).

7. afschrikken Collagenase spijsvertering buffer

  1. Vul de polypropyleen buis van 50 mL volledig met gekoelde Colon buffer.
    Opmerking: Collagenase is actief bij 37 °C; Vandaar dat de gekoelde buffer dit enzym inactiveert.
  2. Centrifugeer de buis bij 4 °C bij 800 x g gedurende 5 min.
    1. Gooi het supernatant weg via vacuüm aspiratie. Spoel cellen met 25 mL verse Colon buffer en centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 minuten.
    2. Respendeer de pellet in minder dan 1 mL verse gekoelde Colon buffer.
    3. Plaats de polypropyleen conische buis van 50 mL op ijs.

8. de spijsvertering van Collagenase 2

  1. Herhaal stap 4 (spijsvertering 1) met de resterende weefsel fragmenten die van stap 6,1 worden bewaard.

9. weefsel aggregatie na de spijsvertering 2

  1. Spoel de weefsel fragmenten krachtig heen en weer tussen de buis en een spuit van 10 mL door een 18 G botte-end naald.
  2. Herhaal deze flush voor minimaal 7-8 complete passages, doorgaan tot er geen grove weefsel fragmenten of vuil zichtbaar zijn.

10. filter cellen

  1. Passeer de weefsel uitsplitsing suspensie via een 40 μm-Pore filtratie stof celzeef in een schone polypropyleen buis van 50 mL.
  2. Was de filtratie stof celzeef met 10 mL gekoelde Colon buffer om alle cellen die in het filter zijn verstrikt te herstellen.

11. afschrikken Collagenase spijsvertering

  1. Vul de polypropyleen conische buis van 50 mL op de velg met gekoelde Colon buffer.
    Opmerking: De temperatuur van de Colon buffer is van cruciaal belang om te zorgen voor het afschrikken van Collagenase-activiteit.
  2. Spin bij 4 °C en 800 x g gedurende 5 min.
  3. Gooi het supernatant weg via vacuüm aspiratie.
  4. Wassen door hersuspendiging in 25 mL verse gekoelde Colon buffer, gevolgd door centrifugeren bij 4 °c, 800 x g gedurende 5 min.
  5. Gooi het supernatant weg via vacuüm aspiratie.
  6. Zwembad de geresuspendeerde pellet van Collagenase spijsvertering 1 (stap 7) naar de bijbehorende buis uit stap 11,4.
  7. Herhaal stap 11,4 (wassen en centrifugeren).

12. op silica gebaseerde dichtheids scheiding media gradiënt scheiding

Opmerking: Voer stappen 12-18 zo snel mogelijk uit om een snelle demping van Collagenase-activiteit te garanderen.

  1. Volgende stap 11,7, respendeert elke pellet in 24 mL totaal van 44% silica-gebaseerde dichtheid scheidings media per dikke darm.
  2. Langzaam laag 8 mL van de media uit stap 12,1 op elk van de drie buizen bereid bij stap 5,2 (met 66% dichtheid scheiding media op basis van silica), met behulp van een 10 mL serologische pipet. Handhaaf een stabiele en langzame stroom van de 44% dichtheids scheidings media terwijl u het verloop in lagen plaatst om verstoring van de interface te voorkomen.
  3. Weeg alle buisjes in de centrifuge bakken zorgvuldig af met een weegschaal of een balans.
  4. Draai de buisjes 20 min bij 859 x g in een centrifuge zonder remmen bij 20 °c. Laat de rotors tot rust komen voordat u buizen verwijdert, zorg ervoor dat u de cellen niet verstoort in de gradiënt interface.

13. Verzamel mononucleaire cellen uit de gradiënt interface

  1. Visualiseer de gradiënt interface (in de buurt van de 5 mL markering), waar meestal een 1-2 mm dikke witte band (met MNC) aanwezig is.
    Opmerking: Een witte band kan wel of niet worden weergegeven. Echter, MNC zal zijn op deze interface en moet Cloud de duidelijkheid van de gradiënt interface.
  2. Vacuüm aspireren en gooi de Top 7 mL van de bovenste gradiënt om gemakkelijker pipet toegang tot de interface te maken.
  3. Met behulp van continue handmatige zuigkracht en stabiele roterende pols beweging, verzamelt u de interface laag van cellen in een schone polypropyleen conische buis van 50 mL. Verzamelen totdat de interface tussen de 2 gradiënten duidelijk is en refractile (vrij van cellen).
  4. Vul de opvang buis met 50 mL gekoelde FACS buffer. Spin bij 4 °C, 800 x g gedurende 5 min.
  5. Aspireren de supernatant via vacuüm aspiratie en respenderen de pellet in 1 mL FACS buffer.
  6. Tel de cellen op een hemocytometer bij een verdunning van 1:2 met behulp van geschikte dode celuitsluitings methoden.
  7. Ga verder met FACS kleuring of andere assays met vers geïsoleerde Colon MNC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het werken met Murine Colon ziekte modellen, het is nuttig om te kunnen zowel kwantificeren en kwalitatief beoordelen, onder de MNC van de dikke darm, meerdere immuuncelsubgroepen betrokken bij het ontstekingsproces. De eencellige suspensie van MNC verkregen door toepassing van dit protocol vergemakkelijkt dergelijke fenotypische karakterisering op een robuuste en reproduceerbare manier. Als een bewijs van principe voor de toepassing van deze isolatiemethode onder diverse experimentel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit visuele protocol beschrijft goed getolereerde methoden voor de isolatie van Colon mononucleaire cellen, waaronder lamina propria lymfocyten (LPL). Gezien het feit dat dit protocol is geoptimaliseerd in de evaluatie van ernstige post-transplantatie muis colitis modellen waar inflammatoire cytokines en weefsel letsel lenen zich voor een slechte levensvatbaarheid van teruggewonnen MNC, we verwachten dat deze methoden kunnen worden vertaald naar andere toepassingen die fenotypische analyse van Colon MNC vereisen. Deze om...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door subsidies #1K08HL088260 en #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), en de Batchelor Foundation voor pediatrisch onderzoek (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 en BALB/c muizen die in deze studie werden gebruikt, werden ofwel gefokt in onze faciliteit of geleverd door Jackson Labs of Taconic.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
60 mm Petri DishThermo Scientific150288
1x PBSCorning21-040-CV
10x PBSLonza BioWhittakerBW17-517Q
10 mL Disposable Serological PipetteCorning4100
10 mL SyringeBecton Dickinson302995
15 mL Non-Sterile Conical TubesTruLineTR2002
18 G Blunt NeedleBecton Dickinson305180
25 mL Disposable Serological PipetteCorning4250
40 μm pore size Cell StrainerCorning352340
50 mL Falcon TubeCorning21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA4503-1KG
Fixation BufferBiolegend420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticumSigmaC2139
EDTA, 0.5 M Sterile SolutionAmrescoE177-500ML
Fetal Bovine SerumThermo /Fisher Scientific -HyCLoneSV30014.03
HEPESGE Healthcare-HyCloneSH30237.01
PercollGE Healthcare-Life Sciences1708901
RPMI MediumCorning17-105-CV
Sodium AzideVWR Life Science Amresco97064-646
Trypan BlueLonza BioWhittaker17-942E

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114(2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van de muizencoloncollagenase E digestiescheiding via dichtheidsgradi ntflowcytometrie analysefiltratie met celzeefincubatie op orbitale schudmachinewassen met FACS bufferfenotypering van immuuncellenbeenmergtransplantatie

Gerelateerde artikelen