Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Samenvatting

Hier presenteren we een geautomatiseerde plasma-eiwit verteringsmethode voor massaspectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomische analyse. In dit protocol worden de vloeibare overdrachts- en incubatiestappen voor eiwitdenaturatie, reductie, alkylation en trypsine-spijsverteringsreacties gestroomlijnd en geautomatiseerd. Het duurt ongeveer vijf uur om een 96-well plaat met de gewenste precisie voor te bereiden.

Samenvatting

Monstervoorbereiding voor massaspectrometrieanalyse in proteomics vereist enzymatische dessplitsing van eiwitten in een peptidemengsel. Dit proces omvat talrijke incubatie- en vloeistofoverdrachtsstappen om denaturatie, reductie, alkylation en decolleté te bereiken. Het aanpassen van deze workflow aan een geautomatiseerd werkstation kan de efficiëntie verhogen en de variantiecoëfficiënten verminderen, waardoor betrouwbaardere gegevens worden verstrekt voor statistische vergelijkingen tussen steekproeftypen. We beschreven eerder een geautomatiseerde proteomische monstervoorbereidingsworkflow¹. Hier rapporteren we de ontwikkeling van een efficiëntere en beter gecontroleerde workflow met de volgende voordelen: 1) Het aantal stappen voor vloeibare overdracht wordt teruggebracht van negen naar zes door reagentia te combineren; 2) Pipettertijd wordt verminderd door selectieve tip pipetteren met behulp van een 96-positie pipetterkop met meerdere kanalen; 3) De potentiële doorvoer wordt verhoogd door de beschikbaarheid van maximaal 45 dekposities; 4) Volledige behuizing van het systeem zorgt voor een betere temperatuur- en milieucontrole en vermindert de kans op verontreiniging van monsters of reagentia; en 5) De toevoeging van stabiele isotopen gelabeldpeptiden, evenals β-galactosidase eiwit, aan elk monster maakt monitoring en kwaliteitscontrole mogelijk gedurende het hele proces. Deze hardware- en procesverbeteringen bieden een goede reproduceerbaarheid en verbeteren de intra-assay en inter-assay precisie (CV van minder dan 20%) voor op LC-MS gebaseerde eiwit- en peptidekificering. De volledige workflow voor het verteren van 96 monsters in een 96-well plaat kan worden voltooid in ongeveer 5 uur.

Inleiding

Massaspectrometrie (MS) op basis van eiwit en peptide kwantificering wordt steeds meer toegepast als een bioanalytisch instrument voor plasma-analyse in fundamenteel onderzoek en klinische laboratoria^2,3. De vereiste instrumentatie en informatica zijn snel gevorderd als MS is uitgegroeid tot de methode van keuze voor het kwantificeren van eiwitten of gemodificeerde eiwitten door zich te richten op specifieke peptide sequenties als gevolg van haar vermogen om honderden peptiden kwantificeren in een enkele MS run⁴. Monstervoorbereiding dient als basis voor elke proteomische analyse. Voorafgaand aan MS-analyse worden de eiwitten in een biologisch monster meestal gedenatureerd, gereduceerd, alkylaat, verteerd tot tryptische peptiden en gedezouten⁵. Alkylation blokkeert cysteïnen om ongecontroleerde modificaties te voorkomen en ervoor te zorgen dat alle cysteïnen dezelfde massa hebben. Vervolgens wordt trypsine toegevoegd om eiwitten te verteren tot peptiden. Elk van deze stappen vereist optimalisatie, en het hele proces wordt traditioneel handmatig uitgevoerd, waardoor de invoering van analytische fouten mogelijk is.

De traditionele biomarker ontwikkelingspijplijn bestaat uit twee belangrijke processen: shotgun proteomics voor wereldwijde eiwitontdekking om een diepgaande eiwitinventaris te creëren⁶ en gerichte proteomics voor verificatie en validatie gericht op high-precision en high-throughput eiwitkwantitatietie⁷. Ongeacht de MS-benadering is de monstervoorbereiding hetzelfde en draait het om enzymatische dekband van eiwitten in een peptidemengsel. Zoals voorgesteld door Van Eyk en Sobhani⁸, met een methode die het mogelijk maakt voor nauwkeurige, nauwkeurige en reproduceerbare analyse voor zowel ontdekking en gerichte testen is gewenst om effectief te verplaatsen ontdekking biomarkers naar klinische geïmplementeerde testen. Om dit te doen, zal automatisering van de voorbereiding van de steekproef nuttig zijn en de mogelijkheid bieden om de efficiëntie te verhogen tot een analyse met een hoge doorvoer. Handmatige methoden introduceren doorgaans analytische fouten die verder gaan dan aanvaardbare limieten die door de Food and Drug Administration (FDA) zijn gespecificeerd in de herziene Bioanalytical Method Validation Guidance, die biomarkers en diagnostiek^2,9bevat. De ontwikkeling van een snelle, zeer nauwkeurige en handsfree MS-eiwitmonsterbereidingsworkflow zal nodig zijn om biomarkeronderzoek te vergemakkelijken, waarvoor duizenden biologische monsters moeten worden voorbereid en geanalyseerd. MS monster voorbereiding heeft vele stappen waar fouten kunnen worden ingevoerd, en het proces is vervelend en tijdrovend.

In onze verbeterde methode werd een geautomatiseerd werkstation geprogrammeerd om alle noodzakelijke plasmamonsterbereidingsprocedures uit te voeren in een totaal van 6 stappen (figuur 1) om ervoor te zorgen: 1) nauwkeurige vloeistofoverdrachten; 2) de reactie wordt geïnitieerd en gestopt op een consistent tijdstip; 3) de reactie wordt uitgevoerd bij een gecontroleerde temperatuur (d.w.z. incubator); en 4) de reactie heeft eenvormig mengen voor alle reacties. We hebben ook het toevoegen van exogene kwaliteitscontrole eiwitten en interne normen (stabiele isotopen-gelabeldpeptide normen) om een kwaliteit en reproduceerbare doorvoer van LC-MS-gebaseerde eiwitten en peptide kwantificering in een 96-well formaat te garanderen. Inclusief reagensvoorbereiding, uren werktijd en in totaal 1.000.000 pipetterstappen zouden nodig zijn om 96 monsters in afzonderlijke buizen te verwerken. Automatisering vermindert de hands-on tijd en het aantal menselijke interacties.

Protocol

1. Programmeren voor de geautomatiseerde vloeistofbehandelaar

1. Een nieuwe methode maken in het menu Bestand (Bestand | Nieuwe methode)
   LET OP: Voer de stappen in de gegeven volgorde uit. Het cursieve lettertype geeft tekst aan die moet worden getypt in de Biomek-software. Neem contact op met de auteurs voor informatie over pipettertechnieken en sjablonen.
2. Typ Stapvariabelen starten en hun waarden in de beginstap zoals vermeld in tabel 1.
3. Stel kolommen in voor selectieve tippipepetteren. Klik voor de stappen 1.3-1.7 op de stap Globaal instellen op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode.
   1. Stel met de stap Globale instellen de waarde =FirstColumn in op variabele FirstColumn_Global, waarde =LastColumn op variabele LastColumn_Global, waarde =LastColumn-FirstColumn+1 op variabele kolommenen waarde =Kolommen*8 op variabele Putten.
   2. Selecteer de scriptstap op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Typ het VB-script zoals aangegeven in figuur 2.
4. Het instellen van volumes voor mixen Set Global en oplossingen.
   1. Stel met de stap Globaal instellen de bijbehorende waarden in op de variabelen volumemix zoals weergegeven in tabel 2.
   2. Klik op de stap Als op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Typ onder voorwaarden Autosampler.
   3. Klik onder Vervolgensop de stap Globaal instellen op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode.
   4. Met de stap Globaal instellen stelt u waarde in =(MobilePhase*Kolommen)+10 op variabele MobilePhaseWell.
   5. Klik onder Anders op de stap Globaal instellen op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode.
   6. Met de stap Globaal instellen stelt u de waarde =0 in op variabele MobilePhaseWell
5. Begeleide Labware-installatie configureren (GLS)
   1. Klik op de stap Dekeditor op de werkbalk onder Hulpprogramma's. Maak een nieuw deck dat overeenkomt met de deck lay-out in figuur 3 en label het als Deck 1.
   2. Klik op de stap Begeleide instelling op de werkbalk onder Instellen en apparaten en sleep deze naar de methode. Sleep en laat de labwaretypen in de dekposities vallen zoals aangegeven in tabel 3. Vul daarna de tabbladen in de tabel in zoals weergegeven in tabel 3 en figuur 4 (De begeleide instelling instellen).
6. Procedure instellen voor het tellen van fooien
   1. Klik op de stap Procedure definiëren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Naamprocedure als TipCount.
   2. Klik op de scriptstap op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Typ het VB-script zoals aangegeven in figuur 5 (Tiptellingsscript).
   3. Klik op de stap Als op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode.
   4. Onder voorwaarden, typ TL5 = 0.
   5. Klik onder Vervolgensop de stap Labware verplaatsen op de werkbalk onder Setup en apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Verplaats labware van TL5 naar TR3. Klik op de stap Labware verplaatsen op de werkbalk onder Instellingen en apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Verplaats labware van TL2 naar TL5. Klik tot slot op de stap Labware verplaatsen op de werkbalk onder Setup en apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Verplaats labware van BC90 naar TL2.
7. Definitieprocedure voor incubator
   1. Klik op de stap Procedure definiëren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. De procedure van de naam als Incubator.
   2. Typ HalfTime als variabele naam en 1800 als standaardwaarde.
   3. Typ NextTemp als variabele naam en 22 als standaardwaarde.
   4. Typ temp als variabele naam en 60 als standaardwaarde.
   5. Klik op de stap Enhanced Move Labware op de werkbalk onder Setup en Apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Verplaats labware van P11 naar INHECO1.
   6. Klik op de stap Procedure uitvoeren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Naamprocedure als TipCount.
   7. Klik op de stap INHECO Incubate op de werkbalk onder Integraties en sleep deze naar de methode. Typ in INHECO1 voor gebruik van het apparaat op positie, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C en 3 voor °C van de doeltemperatuur. Selecteer de shake- en incubatieoptie en orbitale (met de klok mee)shakestijl. Voor instellingen typt u 1,00 mm van links naar rechts, 6,6 keer per seconde, 1,00 mm naar achteren en 6,6 keer per seconde.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat inheco Incubator-software is geïnstalleerd.
   8. Klik op de stap INHECO Incubate op de werkbalk onder Integraties en sleep deze naar de methode. Typ in INHECO1 voor gebruik van het apparaat op positie, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C en 3 voor °C van de doeltemperatuur. Selecteer de shake- en incubatieoptie en Orbital (Tegen de klok in)shakestijl. Typ voor instellingen 1,00 mm van links naar rechts, 6,6 keer per seconde, 1,00 mm naar voren en naar achteren met 6,6 keer per seconde.
   9. Klik op de stap Onderbreken op de werkbalk onder Setup en apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Pauzeer het hele systeem voor 1 s.
   10. Klik op de stap Procedure definiëren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. De procedure van de naam als Incubator.
   11. Klik op de stap INHECO Incubate op de werkbalk onder Integraties en sleep deze naar de methode. Typ in INHECO1 voor gebruik van het apparaat op positie, 1 voor Incubate voor, =NextTemp voor °C en 3 voor °C van doeltemperatuur.
8. Definieerprocedure voor Orbital.
   1. Klik op de stap Enhanced Move Labware op de werkbalk onder Setup en Apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Verplaats labware van P11 naar Orbital1.
   2. Klik op de stap Procedure uitvoeren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer procedure TipCount.
   3. Klik op de stap Apparaatactie op de werkbalk onder Setup en Apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer Device OritalShaker0, Command TimedShake. Voer Schudden snelheid 1000, Tijd om volle snelheid te bereiken 2, Tijd om te schudden 30.
   4. Klik op de stap Enhanced Move Labware op de werkbalk onder Setup en Apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Verplaats labware Orbital1 naar P11.
9. Het opzetten van de eerste mix
   1. Klik op de stap Tip selecteren op de werkbalk onder Stappen voor vloeistofverwerking en sleep deze naar de methode. Selecteer positie TL4 opnieuw rangschikken.
   2. Klik op de stap INHECO Incubate op de werkbalk onder Integraties en sleep deze naar de methode. Typ in INHECO1 voor gebruik van het apparaat op de plaats, 1 voor Incubeering voor, 60 voor °C en 3 voor °C van doeltemperatuur.
   3. Klik op de lusstap op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode in de stap Tip selecteren. Typ col as variable =FirstColumn as Start, =LastColumn as End, en 1 as Increment.
   4. Klik op de stap Tips voor laden met tips selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze binnen lusstap naar de methode. Selecteer BC90-tips, TL5-locatie en TL2-back-uptips locatie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Enkele kolom(en) en typ in 1.
   5. Klik op de stap Tips selecteren op de werkbalk onder Vloeistofverwerkingsstappen en sleep deze binnen lusstap naar de methode. Selecteer BCDeep96Round Labware Type en Reagent Plate Position. Typ in volume =FirstMix, Aanzuigen bij kolom 1 en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
   6. Klik op de stap Tips uitdelen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze binnen lusstap naar de methode. Selecteer BCDeep96Round Labware Type en Reagent Plate Position. Typ in volume =FirstMix, afzien bij kolom =col en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
   7. Klik op de stap Tips uitladen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze binnen lusstap naar de methode. Selecteer Uitrijtips voor TR1.
10. Het instellen van de monsters
    1. Klik op de stap Als op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Typ SamplePlate als voorwaarde.
    2. Klik onder Vervolgensop de stap Tips voor laden selecteren op de werkbalk onder Stappen voor vloeistofverwerking en sleep deze naar de methode. Selecteer BC90-tips, TL5-locatie en TL2-back-uptips locatie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Enkele kolom(en) en typ in =tipkolommen.
    3. Klik op de stap Tips als piraat selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen die tijd. Selecteer Greiner96RoundPS Labware Type en Samples Position. Tekst in volume =Voorbeeld, Aanzuigen bij kolom =Eerste Kolom en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    4. Klik op de stap Tips uitdelen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen die tijd. Selecteer bcdeep96round labwaretype en reactieplaatpositie. Type in volume =Voorbeeld, afzien bij kolom = Eerste Kolom en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    5. Klik op de stap Tips uitladen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen die tijd. Selecteer Uitrijtips voor TR1.
    6. Klik na het einde van de stap Als op de stap Procedure uitvoeren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer procedure Incubator. Typ HalfTime als variabele naam en 1800 als standaardwaarde. Typ NextTemp als variabele naam en 22 als standaardwaarde. Typ temp als variabele naam en 60 als standaardwaarde.
11. Het opzetten van het Cysteine blok
    1. Klik op de lusstap op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode in de tipstap Selecteren. Typ col as variable =FirstColumn as Start, =LastColumn as End en 1 as Increment.
    2. Klik onder Lusop de stap Tips voor laden selecteren op de werkbalk onder Stappen voor vloeistofverwerking en sleep deze naar de methode. Selecteer BC90-tips, TL5-locatie en TL2-back-uptips locatie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Enkele kolom(en) en typ in 1.
    3. Klik op de stap Tips selecteren op de werkbalk onder Vloeistofverwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer BCDeep96Round Labware Type en Reagent Plate Position. Typ in volume =CysteineMix, aanzuigen bij kolom 2 en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    4. Klik op de stap Tips uitdelen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer bcdeep96round labwaretype en reactieplaatpositie. Type in volume = CysteineMix, afzien bij kolom = col en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    5. Klik op de stap Tips uitladen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen die tijd. Selecteer Uitrijtips voor TR1.
    6. Klik na het einde van de lus Als op de stap Procedure uitvoeren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer procedure Incubator. Typ HalfTime als variabele naam en 300 als standaardwaarde. Typ NextTemp als variabele naam en 43 als standaardwaarde. Typ temp als variabele naam en 25 als standaardwaarde.
12. De tweede mix instellen
    1. Klik op de lusstap op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode in de tipstap Selecteren. Typ col as variable =FirstColumn as Start, =LastColumn as End en 1 as Increment.
    2. Klik onder lus op de stap Tips voor laden selecteren op de werkbalk onder Liquid Handling Steps en sleep deze naar de methode. Selecteer BC90-tips, TL5-locatie en TL2-back-uptips locatie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Enkele kolom(en) en typ in 1.
    3. Klik op de stap Tips selecteren op de werkbalk onder Vloeistofverwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer BCDeep96Round Labware Type en Reagent Plate Position. Typ in volume =SecondMix, Aanzuigen bij kolom 3 en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    4. Klik op de stap Tips uitdelen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer bcdeep96round labwaretype en reactieplaatpositie. Type in volume = SecondMix, Dispense at column = col en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    5. Klik op de stap Tips uitladen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen die tijd. Selecteer Uitrijtips voor TR1.
    6. Klik na het einde van de lus als de lus op de stap Procedure uitvoeren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer procedure Orbital.
    7. Klik op de stap Onderbreken op de werkbalk onder Setup en apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Pauzeer het hele systeem voor 1 s.
13. Trypsin-toevoeging instellen
    1. Klik op de lusstap op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode in de tipstap Selecteren. Typ col as variable =FirstColumn as Start, =LastColumn as End en 1 as Increment.
    2. Klik onder Lusop de stap Tips voor laden selecteren op de werkbalk onder Stappen voor vloeistofverwerking en sleep deze naar de methode. Selecteer BC90-tips, TL5-locatie en TL2-back-uptips locatie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Enkele kolom(en) en typ in 1.
    3. Klik op de stap Tips selecteren op de werkbalk onder Vloeistofverwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer BCDeep96Round Labware Type en Reagent Plate Position. Typ in volume =Trypsin, Aanzuigen bij kolom 4 en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    4. Klik op de stap Tips uitdelen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode binnen de lus. Selecteer bcdeep96round labwaretype en reactieplaatpositie. Typ in volume =Trypsin, Dispense at column = col en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    5. Klik op de stap Tips uitladen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen die tijd. Selecteer Uitrijtips voor TR1.
    6. Klik na het einde van de lus Als op de stap Procedure uitvoeren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer procedure Incubator. Typ HalfTime als variabele naam en 3600 als standaardwaarde. Typ NextTemp als variabele naam en 25 als standaardwaarde. Typ temp als variabele naam en 43 als standaardwaarde.
    7. Klik op de stap INHECO Incubate op de werkbalk onder Integraties en sleep deze naar de methode. Zorg ervoor dat INHECO Incubator-software is geïnstalleerd. Typ in INHECO1 voor gebruik van het apparaat op de plaats, 1 voor Incubeeren voor, 25 voor °C en 5 voor °C van doeltemperatuur.
14. Blussen instellen
    1. Klik op de lusstap op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode in de stap Tip selecteren. Typ col as variable =FirstColumn as Start, =LastColumn as End en 1 as Increment.
    2. Klik onder Lusop de stap Tips voor laden selecteren op de werkbalk onder Stappen voor vloeistofverwerking en sleep deze naar de methode. Selecteer BC90-tips, TL5-locatie en TL2-back-uptips locatie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Enkele kolom(en) en typ in 1.
    3. Klik op de stap Tips selecteren op de werkbalk onder Vloeistofverwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer BCDeep96Round Labware Type en Reagent Plate Position. Typ in volume =Quench, Aanzuigen bij kolom 5 en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    4. Klik op de stap Tips uitdelen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer bcdeep96round labwaretype en reactieplaatpositie. Typ in volume =Quench, Dispense at column = col en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    5. Klik op de stap Tips uitladen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, in Dan. Selecteer Uitrijtips voor TR1.
    6. Klik na het einde van de lus als de lus op de stap Procedure uitvoeren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer procedure Orbital.
    7. Klik op de stap Onderbreken op de werkbalk onder Setup en apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Pauzeer het hele systeem voor 1 s.
    8. Klik op de stap Onderbreken op de werkbalk onder Setup en apparaatstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer Het hele systeem onderbreken en dit bericht weergeven. Typ het bericht 'Doorgaan na centrifugatie'.
15. Het instellen van de plaat voor Autosampler
    1. Klik op de stap Als op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode in de stap Tip selecteren. Typ Autosampler als voorwaarde.
    2. Klik onder Vervolgensop de lusstap op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Typ col as variable =FirstColumn as Start, =LastColumn as End en 1 as Increment.
    3. Klik onder Lusop de stap Tips voor laden selecteren op de werkbalk onder Stappen voor vloeistofverwerking en sleep deze naar de methode. Selecteer BC230-tips, TL6-locatie en TL2-back-uptips locatie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Enkele kolom(en) en typ in 1.
    4. Klik op de stap Tips selecteren op de werkbalk onder Vloeistofverwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer BCDeep96Round Labware Type en Reagent Plate Position. Typ in volume =MobilePhase, Aanzuigen bij kolom 6 en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    5. Klik op de stap Tips uitdelen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer Bio_RadPCR96 Labware Type en Autosampler Plate Position. Typ in volume =MobilePhase, Dispense at column = col en row 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    6. Klik op de stap Tips uitladen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, in Dan. Selecteer Uitrijtips voor TR1.
    7. Klik na het einde van de lus Als op de stap Procedure uitvoeren op de werkbalk onder Besturingselementstappen en sleep deze naar de methode. Selecteer procedure TipCount.
    8. Klik op de stap Tips voor laden met tips selecteren op de werkbalk onder Stappen voor vloeibare afhandeling en sleep deze naar de methode. Selecteer BC90-tips, TL5-locatie en TL2-back-uptips locatie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Enkele kolom(en) en typ in =tipkolommen.
    9. Klik op de stap Tips selecteren op de werkbalk onder Vloeistofverwerkingsstappen en sleep deze naar de methode binnen de lus. Selecteer bcdeep96round labwaretype en reactieplaatpositie. Typ in volume =DigestTransfer, Aangezogen bij kolom =eerste kolom en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    10. Klik op de stap Tips uitdelen selecteren op de werkbalk onder Vloeibare verwerkingsstappen en sleep deze naar de methode, binnen de lus. Selecteer Bio_RadPCR96 Labware Type en Autosampler Plate Position. Typ in volume =MobilePhase, Dispense at column =FirstColumn en rij 1. Selecteer een geoptimaliseerde techniek in het vervolgkeuzemenu van de techniek.
    11. Klik op de stap Tips uitladen selecteren op de werkbalk onder Stappen voor vloeibare afhandeling en sleep deze naar de methode binnen Dan. Selecteer Uitrijtips voor TR1. De stap Selecteer tips eindigt hier.
    12. Sla de methode op en geef de naam.

2.

1. Breng 5 μL gepoold gezond menselijk plasma over in een Polypropyleen, 96-Round Deep Well Plate.
   OPMERKING: Zie materiaaltafel voor reagentia en benodigdheden die in dit protocol worden gebruikt. TPCK Treated Trypsin werd gekocht en trypsine tot substraat verhouding en incubatietijd werd specifiek geoptimaliseerd. Als een andere graad trypsine wordt gebruikt, zoals sequentiekwaliteit recombinant trypsine, moet het enzym tot substraat verhouding en incubatietijd worden getest en geoptimaliseerd.

3. Werkwijze

1. Dubbelklik op het softwarepictogram.
2. Selecteer op het tabblad Methode de optie Alle assen start om de automatische vloeistofhandler te oriënteren en voor te bereiden. Zorg ervoor dat alle werkstationsspuiten geen zichtbare luchtbellen bevatten.
3. Selecteer Onder Bestandde optie Openen | Methode.
4. Selecteer de methode (Figuur 6).
5. Start de methode door op het groene driehoekvormige pictogram Uitvoeren te klikken.
6. Als u een autosamplerplaat aan het einde van de methode wilt laten voorbereiden, voert u de waarde 'waar' in de prompt Van een waarde invoeren die u wilt gebruiken voor 'Autosampler' en klikt u op OK. Als een autosamplerplaat niet wordt voorbereid, voert u de waarde 'false' in en klikt u op OK.
7. Voer de waarde '1' in de prompt Van een waarde invoeren in die u wilt gebruiken voor 'eerste kolom' en klik op OK.
8. Voer de waarde '12' in de prompt Een waarde invoeren in die u wilt gebruiken voor 'laatste kolom', en klik op OK.
   OPMERKING: Deze stap en stap 4.7 vertellen het werkstation om een vertering uit te voeren op 12 kolommen van een 96-put plaat, wat resulteert in alle putten van de plaat wordt gebruikt voor de spijsvertering
9. Als een monsterplaat wordt gebruikt met monstervolumes van ten minste 20 μL, voert u de waarde 'waar' OKin de prompt Van een waarde invoeren die u wilt gebruiken voor 'SamplePlate'. Als een monsterplaat niet wordt gebruikt, voert u de waarde 'false' in en klikt u op OK.
   OPMERKING: Als een monsterplaat niet wordt gebruikt, voegt u 5 μL monster toe aan elke overeenkomstige put van de reactieplaat.
10. Volg de aanwijzingen in het venster Begeleide Labware-installatie en klik op Doorgaan.
    OPMERKING: In het volgende venster wordt de indeling beschreven voor de voorbereiding van de "Reagent Plate" (figuur 7, aanvullende tabel 1). De volgende volumes worden in elk van de 8 putten van een enkele kolom in de 1 mL Deep Round 96-well plaat opgenomen:
    Kolom 1: 540 μL reactiemix 1.
    Kolom 2: 50 μL Cysteïneblok.
    Kolom 3: 730 μL reactiemix 2.
    Kolom 4: 130 μL trypsine.
    Kolom 5: 130 μL Quench Solution.
    Kolom 5: 1090 μL mobiele faseoplossing (Als de gebruiker 'true' in stap 6 heeft ingevoerd).
11. Klik op Volgende en in het volgende venster wordt het minimumvolume (20 μL) beschreven dat in de monsterplaat moet worden opgenomen. Als de gebruiker de waarde 'vals' heeft ingevoerd voor de prompt waarbij de monsterplaat betrokken is (stap 9), wordt de gebruiker gevraagd om 5 μL monster toe te voegen aan de reactieplaat.
12. Klik op Volgende.
    OPMERKING: Het volgende venster laat zien dat een lege tipbox van 90 μL op het automatische vloeistofhandlerdek moet worden geplaatst.
13. Klik nogmaals op Volgende, het dek van de automatische vloeistofhandler zoals gespecificeerd en geïllustreerd (figuur 8), inclusief de Reagent Plate, de Reactieplaat, de monsterplaat, de Autosamplerplaat, 6 volledige 90 μL tipboxen, een lege 90 μL tipbox en een volledige tipbox van 230 μL.
14. Klik op Voltooien om de methode te starten.
    OPMERKING: Na het klikken op Voltooienkan de gebruiker niet in de automatische vloeistofhandler komen. Dit zal 'breken het lichtgordijn' van de machine en stop de vloeistof handler als een voorzorgsmaatregel.
15. Haal bij de prompt Verder na centrifugeren de reactieplaat op en centrifugeer deze gedurende 30 minuten bij 3.000 tpm.
16. Nadat de centrifugering is voltooid, geeft u de reactieplaat terug naar de automatische vloeistofhandler naar de positie waarin deze zich bevond vóór de centrifugering en klikt u op Doorgaan.
    OPMERKING: De automatische vloeistofhandler stopt opnieuw wanneer de methode is voltooid. Als de gebruiker voor stap 6 'true' heeft ingevoerd, kan de Autosamplerplaat van het werkstation worden verwijderd en in de autosampler van een vloeistofchromatografie-instrument worden geplaatst voor analyse.

4. LC-MSMS

1. Peptiden oplossen op een hplc met hoge stroom bestaande uit een C18 2,1 mm x 100 mm, 3,5 μm kolom met een stroomsnelheid van 0,25 mL/min en geanalyseerd inline op een drievoudige quadrupole massaspectrometer.
   OPMERKING: Na peptide spijsvertering, de gerichte LC-MSMS methode om peptiden te kwantificeren van robotgeprepareerde monsters wordt beschreven in detail¹ na een korte beschrijving van LC-MSMS.
2. Stel de temperatuur van de kolomoven in op 40 °C. Gebruik buffer A (2% ACN, 98% water, 0,1% mierenzuur) en buffer B (95% ACN, 5% water, 0,1% mierenzuur) als de twee mobiele fasen.
3. Equilibrate de kolom met 5% B gedurende 5 minuten na het laden. Los de peptiden over 30 minuten met een lineaire 5% tot 35% gradiënt van buffer B.
   1. Recycle de kolom voor het laden van het volgende monster door het wassen met 98% B gedurende 10 minuten en vervolgens 5% B gedurende 5 minuten.
   2. Voor de on-line omleiding, leidt de post-kolom eluent om afval voordat het de ionenbron met behulp van een twee-fase schakelklep.
4. De MRM-gegevens verwerken.

Resultaten

De geautomatiseerde proteomics monster voorbereiding workflow op het geautomatiseerde werkstation werd aangepast van onze vorige geautomatiseerde protocol met een robuuste LC-SRM-MS acquisitie methode¹ voor albumine, de geselecteerde plasma-eiwit, en β-galactosidase (β-gal), een exogene eiwit dat wordt gebruikt voor kwaliteitscontrole. Na verwerking werden de samples uitgevoerd op een drievoudige quadrupole LC-MS in een SRM-test gericht op serumalbumine, β-galactosidase. De variatiecoëfficiënt (CV) van het SRM-signaal voor elke overgang werd gebruikt om de reproduceerbaarheid van het geautomatiseerde spijsverteringsprotocol te controleren.

We hebben de reagenstoevoeging en mengstappen geautomatiseerd voor een vertering van 5 μL plasmamonsters met een 2 uur durende trypsine-incubatie van 2 uur op het dek. Om de reproduceerbaarheid te bepalen, werd 5 μL van een plasmapool gepipetiseerd in meerdere putten van een reactieplaat met een meerkanaalshoofd (96 pin). Om te controleren op consistentie, voegden we β-gal eiwit toe voor de reductie- en alkylation reacties. De geautomatiseerde proteomics monster voorbereiding workflow werd getest met een robuuste LC-SRM-MS acquisitie methode met inbegrip van albumine, de hoogste overvloed plasma-eiwit, en β-gal eiwit, gebruikt voor kwaliteitscontrole. Drie β-gal peptiden en twee albumine peptiden werden gemonitord van verwerkte plasmaalbumine-eiwitten en verrijkte β-galeiwitten (Tabel 4).

In een poging om tijd te besparen en de procedure te vereenvoudigen, hebben we de vloeistofoverdrachtsstappen van het toevoegen/mengen/uitbroeden van reagens en reactiemengsel met het werkstation teruggebracht van een workflow in negen stappen naar een workflow in zes stappen (figuur 1). De totale proteomische workflow bestond uit twee experimentele componenten: geautomatiseerde monstervoorbereiding en LC-MS/MS. Ten eerste evalueerden we de precisie van LC-MS/MS SRM-gegevensverwerving door acht opeenvolgende injecties uit dezelfde spijsverteringsput van de autosamplerplaat. De nauwkeurigheid van de geautomatiseerde workflow voor monstervoorbereiding werd berekend door het percentage variantiecoëfficiënt (%CV) van de totale proteomische SRM-workflow minus%CV van de LC-MS/MS(figuur 9B). Met de gestroomlijnde plasmavergistingsprocedure op het geautomatiseerde werkstation was de experimentele precisie van geautomatiseerde monsterbereiding minder dan 11,4% voor exogene gespikede β-galeiwitten (gemiddeld 10,0%) en minder dan 14,9% voor het meest voorkomende menselijke serumalbumine (9,9% als gemiddelde) (Figuur 9). Zoals verwacht werden goede signaalintensiteiten waargenomen voor zowel menselijke serumalbumine als β-galeiwitten(figuur 9C).

Voor elke pipetter- en vloeistofoverdrachtstap werden de technieken specifiek geoptimaliseerd. Om de precisie van vloeibare overdrachtsstappen te controleren, hebben we stabiele isotopen-gelabelde (SIL) peptidenormen voor endogene menselijke serumalbumine-eiwit en exogene β-gal-eiwit in drie onafhankelijke reagensoverdrachtstappen: Reaction Mix 1, Cysteine Blocker en Reaction Mix 2(figuur 10). MRM-signalen van deze vijf SIL peptiden werden verkregen om de precisie van geautomatiseerde vloeistofoverdrachtstappen te controleren. De gemiddelde %CV voor peptiden, DDNPNLPR^, en GDFQFNISR^ (^ vertegenwoordigt het N15 gelabeldaminozuur) van Reaction Mix 1 stap varieerde van 1,8% tot 11,2%. De gemiddelde %CV van één peptide (IDPNAWVER^) van de Stap Cysteine Blokker varieerde van 6,6 tot 8,8%. Het gemiddelde %CV van twee peptiden (WVGYGQDSR^ en LVNEVTEFAK^) varieerde van 6,2% tot 11,9% (figuur 10).

Om de geautomatiseerde proteomics monsterbereidingsworkflow te valideren, evalueerden we reproduceerbaarheid over meerdere eiwitten en meerdere dagen voor menselijk serumalbumine, exogene β-gal en 40 extra plasma-eiwitten. We verwerkten 21 repliceren monsters (gepoold normaal menselijk plasma), goed locatie weergegeven in figuur 11A, op drie verschillende dagen. Intra-day CV's werden berekend op basis van 21 putten die op dezelfde dag werden voorbereid. De gemiddelde intra-day %CV's voor 40 eiwitten varieerden van 4% tot 20% (Figuur 11B). Om het randeffect van de op plaat gebaseerde geautomatiseerde werkstroom te evalueren, is %CV berekend op basis van specifieke putten binnen aangewezen kolommen en rijen(figuur 12A voor kolom en rijkaart). Mrm-signalen intensiteiten waren vergelijkbaar in alle kolom en rij configuraties met %CV variërend van 3% - 22% (Figuur 12B).

Samengevat levert de geoptimaliseerde geautomatiseerde workflow 96 gelijkmatig verwerkte monsters op in minder dan vijf uur met uitstekende experimentele precisie. Voor compatibiliteit met een geautomatiseerde workflow hebben we reagentia geselecteerd die verwaarloosbare niet-specifieke bijwerkingen hebben, stabiel zijn in omgevingslicht, LC-MS/MS-vriendelijk zijn en kunnen worden opgeslagen als bevroren aliquots.

Figuur 1: Schema van de werkstroom voor de voorbereiding van de steekproef. De belangrijkste 6 stappen voor vloeistofoverdracht worden vermeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Tip laden Script. De VB Script details worden hier weergegeven. Het script geeft de voorwaarden voor het laden van de tenpert. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Automatische indeling van het werkstationdek. Het deck bestaat uit 1x1 ALP's, Tip Loading ALPs, Trash, Tip wash, Peltier en een incubator. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Eigenschappen van de reagensplaat. Getoond zijn eigenschappen die nodig zijn voor de Reagent Plate labware wanneer geopend met behulp van de Guided Labware Setup. Selecteer de overeenkomstige kolom en typ de variabelen zoals aangegeven in de figuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Tip tellen script. Dit script helpt om het aantal tips op het dek bij te houden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Overzicht van de methode voor het verteren en aliquoting plasmamonsters. Stappen voor reagensberekeningen, labware-setup en vloeibare manipulaties in de methode van de vloeibare handler. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Indeling van de reagensplaat. Getoond zijn de chemische reagentia die nodig zijn voor plasma spijsvertering en autosampler voorbereiding en verdeeld over de reagens plaat labware. Dit cijfer is gewijzigd van een technische noot¹⁰. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: Lay-out voor de labware op het dek van het geautomatiseerde werkstation. Getoond is de deklay-out voor de plasma vertering methode voor de vloeibare handler. Dit cijfer is gewijzigd van een technische noot¹⁰. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 9: De nauwkeurigheid van de totale proteomische workflow bestaat uit workstation CV en gerichte LC MS/MS CV.
Vijf peptiden van β-gal en albumine werden gemonitord, de chromatogrammen en peptide retentietijd voor elk peptide wordt getoond(A), Precisie werd bepaald uit 30 putten/ monsters verwerking representatief experiment, CV's% voor totale proteomische workflow, LC MS / MS analyse en geautomatiseerde monster verwerking werden berekend (B). Over het algemeen vertoonden de verteerde peptiden goede signalen varieerden van 1x10⁵ tot 1x10⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 10: Bepaling van de precisie voor vloeistofoverdrachtstappen. Synthetische peptiden werden verrijkt in stapspecifieke reagentia, en geautomatiseerde vloeistofoverdracht werd bepaald door het totaal%CV. Van 30 putten / monsters experiment minus% CV LC MSMS (bepaald door 8 herhalen LC MSMS injecties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 11: Meerdaagse reproduceerbaarheid van geautomatiseerde proteomische monsterbereidingsworkflow met 42 eiwit-MRM-analyse. (A) Reactieplaat kaart voor elk van de drie dagen is hier te zien, 5 μL plasma werd toegevoegd aan elk van 21 putten. 3 putten ontvangen 5 ul water werden gebruikt als negatieve / blanco controles. (B) De gemiddelde intensiteit van 190 overgangen bestaat uit 75 peptiden en 42 eiwitten (links) en%CV voor elke MRM-overgang werd berekend op basis van 21 putten spijsvertering voor elke dag (rechts). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 12: Reproduceerbaarheid van specifieke locaties van putten (positie van kolommen en rijen). (A) De locatie Kolommen en Rijen met een plaatkaart wordt hier weergegeven. (B) Kolom en rij locatie specifieke MRM signalen van gemiddelde intensiteiten van gespecificeerde putten (links) en cv% (rechts) van een enkele plaat spijsvertering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 13: Screenshot van de techniek editor. Definieer voor elke Pipetting-sjabloon de eigenschappen van vloeistofniveaudetectie, stolseldetectie, piercing, vloeibaar type, algemeen, aanzuigen, afzien, mix en kalibratie. De sjabloon en technieken die in dit protocol worden gebruikt,worden weergegeven in Aanvullende tabel 2 ). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Variabele	Variabele	Waarde	Beschrijving
Autosampler	Booleaanse	Waar	Autosampler gebruiken
Betagal Betagal	Geheel getal	5	Betagal volume
BG1 BG1	Geheel getal	0.8	BG1-volume
BG2 BG2	Geheel getal	0.8	BG2-volume
BG3	Geheel getal	0.8	BG3-volume
CysteinBlocker CysteinBlocker	Geheel getal	1.25	Cysteïne blokkervolume
CysteïneBuffer	Geheel getal	0.45	Cysteïne buffervolume
Denatureringsmiddel	Geheel getal	5	Denaturant volume
DigestTransfer	Geheel getal	10	Het overdrachtsvolume van de samenvatting
Eerste buffer	Geheel getal	25.9	Eerste buffervolume
Eerste kolom	Geheel getal	1	Eerste kolom
HSA1 HSA1	Geheel getal	0.8	HSA1-volume
HSA2 HSA2	Geheel getal	0.8	HSA2-volume
laatstekolom	Geheel getal	12	Laatste kolom
MobileFase	Geheel getal	90	Mobiel fasevolume
Doven	Geheel getal	10	Kolom Uitlessen
ReducingAgent	Geheel getal	5	Agentkolom verkleinen
Monster	Geheel getal	5	Voorbeeldkolom
SamplePlate (sampleplaat)	Booleaanse	Waar	Monsterplaat gebruiken
Tweede Buffer	Geheel getal	58.4	Tweede buffervolume
Trypsin	Geheel getal	10	Trypsine-kolom

Tabel 1: Stappenvariabelen starten

Waarde	Variabele
=FirstBuffer+Denaturant+ReducingAgent+Betagal+BG1+HSA1	FirstMix FirstMix
=CysteineBlocker+CysteineBuffer+BG2	CysteïneMix
=SecondBuffer+BG3+HSA2	SecondMix
=(FirstMix*Kolommen)+30	FirstMixWell FirstMixWell
= (CysteineMix*Kolommen)+20	CysteineWell CysteineWell
=(SecondMix*Kolommen)+10	SecondMixWell SecondMixWell
=(Trypsin*Kolommen)+10	TrypsinWell TrypsinWell
=(Quench*Kolommen)+10	QuenchWell QuenchWell
=(FirstMixWell*8)+100	FirstMixStock FirstMixStock
=CysteineWell*8+20	CysteïneMixStock
=(SecondMixWell*8)+100	SecondMixStock

Tabel 2: Variabelen voor volumemix

Type	Naam	Positie	Diepte	Eigenschappen	Gebruiken?
BCDeep96Round	Reagensplaat	P5	1(boven)	#	=niet SamplePlate
BCDeep96Round	Reagensplaat	P5	1(boven)	#	=SamplePlate
BCDeep96Round	Reactieplaat	P11	1(boven)		Waar
Bio_RadPCR96*	Monsters	P9	1(boven)		=SamplePlate
Bio_RadPCR96*	Autosamplerplaat	P10	1(boven)		=Autosampler
BC90	Lege		1(boven)		Waar
BC90			1(boven)		Waar
BC90			1(boven)		Waar
BC230			1(boven)		=Autosampler
BC90			1(boven)		=Kolommen>1
BC90			1(boven)		=Kolommen>3
BC90			1(boven)		=Kolommen>5
BC90			1(boven)		=Kolommen>7
BC90			1(boven)		=Kolommen>9
Opmerking: *: Komt overeen met de 96 goed Bio-Rad plaat. #: Klik op eigenschappen en voer vervolgens de volumevariabelen in zoals aangegeven in figuur 6.

Tabel 3: De begeleide installatie instellen

Eiwit ID	Peptidesequentie	Q1 Massa (Da)	Q3 Massa (Da)	Tijd (min)	Fragment Ion	Potentieel declustering	Botsingsenergie	Collision Cell Exit Potentieel
sp| P00722| BGAL_ELOCI	GDFQFNISR	542.3	262.1	19.7	+2y2	61	21	8
		542.3	636	19.7	+2y5	61	25	12
		542.3	764.2	19.7	+2y6	61	25	18
	IDPNAWVER	550.3	436.1	18.1	+2y7+2	61	23	8
		550.3	871.2	18.1	+2y7	61	25	18
		550.3	774.2	18.1	+2y6	61	33	8
	WVGYGQDSR	534.3	782.1	12.1	+2y7	51	25	6
		534.3	562.1	12.1	+2y5	51	27	6
		534.2	505.2	12.1	+2y4	90	25	8
sp| P02768| ALBU_HUMAN	DDNPNLPR DDNPNLPR	470.8	596.2	9.2	+2y5	61	27	16
		470.8	499.3	9.2	+2y4	61	27	18
		470.8	710.4	9.2	+2y6	61	27	18
	LVNEVTEFAK (LVNEVTEFAK)	575.3	694.4	18.2	+2y6	73.1	29.6	18
		575.3	937.5	18.2	+2y8	73.1	29.6	18
		575.3	823.4	18.2	+2y7	73.1	29.6	18

Tabel 4: MRM-parameters

Aanvullende tabel 1: Reagent plaat Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Protocolsjabloon Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Monsterverwerking voor massaspectrometrie vereist eiwitdenaturatie, reductie en alkylation om cysteïnes te blokkeren en trypsine-spijsvertering om eiwitten in peptiden te splijten. Elke chemische of enzymatische reactie moet op een bepaald tijdstip worden gestart en uitgevoerd op een gecontroleerde temperatuur, en elke stap in het proces omvat meerdere vloeistofoverdrachtsstappen waarbij experimentele variatie kan worden geïntroduceerd. Geautomatiseerde monsterverwerking biedt een oplossing voor dit dilemma. De momenteel beschikbare vloeistofbehandelingssystemen hebben de mogelijkheid om reagentia in 96-putplaten over te brengen met een nauwkeurigheid en precisie van minder dan 5%, afhankelijk van het gebruikte hoofd- en tiptype, en om monsters uit te broeden, met schudden indien gewenst, bij gecontroleerde temperaturen variërend van 14 °C tot 70 °C. We gebruikten een geautomatiseerde vloeistofhandler om plasma te verwerken voor SRM-testen in een 96-well formaat.

Er zijn vele duizenden protease decolleté sites binnen de complexe mengsels van eiwitten in serum, plasma, en andere biologische monsters; en elk van deze eiwitten heeft unieke eigenschappen die de toegankelijkheid van de decolletésite en de stabiliteit van de resulterende peptiden beïnvloeden. Het is daarom onmogelijk om een monsterverwerkingsprocedure te ontwerpen die optimaal is voor elk eiwit. Het beste alternatief is om zo consistent mogelijk te zijn.

Om consistentie te bereiken, hebben we elke pipetterstap geoptimaliseerd die door de geautomatiseerde vloeistofhandler wordt uitgevoerd. We hebben eerst rekening gehouden met het vereiste volume en beperkingen opgelegd door het type van de vloeistof (plasma, waterig of organisch) en overeenkomstige eigenschappen (viscositeit, cohesie en volatiliteit), hardware (werkstation pipetteren-kop en plaat-grijpen armen), en labware. Vervolgens hebben we gevarieerd de snelheid en trailing luchtspleet voor aspiratie, de snelheid en blowout volume voor het verstrekken, en de kracht en de duur van het mengen, terwijl de integratie van een tip touch na aspiratie en / of het verstrekken, indien nodig, om vloeistof vast te houden aan de buitenkant van de tips (Figuur 13, Aanvullende tabel 1). Een uniek SIL peptide, vooraf gescreend op stabiliteit, werd in elk reagens geprikt om het mogelijk te maken om de precisie van elke vloeistofbehandelingsstap te controleren. Na optimalisatie waren de proces-cv's voor de meeste overgangen minder dan 10%, wat een goede reproduceerbaarheid aantoonde met het geautomatiseerde werkstation (figuur 9, figuur 10, figuur 11 en figuur 12).

De geautomatiseerde workflow die hier wordt gepresenteerd, voorziet in consistente enzymatische spijsvertering met verbeterde reproduceerbaarheid en doorvoer in vergelijking met handmatige methoden (figuur 9, figuur 10). Deze aanpak belooft de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van biomarkerdetectie en -validatie door massaspectrometrie te verbeteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
A Gepoold gezond menselijk plasma	Bioreclamation Inc.		menselijk plasma getest in het manuscript
Acetonitril, HPLC-kwaliteit	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	LC MS/MS-oplosmiddel
B-Galactosidase Recombinant van E.Coli	Sigma-Aldrich	G3153-5MG	exogeen controle-eiwitten.
Biomek i7 Geautomatiseerde werkstation	Beckman Coulter, Inc.		De proteomische monstervoorbereidingswerkstation: Biomek geautomatiseerde werkstations zijn niet bedoeld of gevalideerd voor gebruik in de diagnose van ziekten of andere aandoeningen
Biomek i-Series Tips 230µL Niet-Steriel	Beckman Coulter, Inc.	B85903	Tips, i7-verbruiksartikel
Biomek i-Series Tips 90µL Niet-Steriel	Beckman Coulter, Inc.	B85881	Tips, i7-verbruiksartikel
FG, Kit Trypsine TPCK	Sciex	4445250	Trypsine gebruikt bij vertering
Hard-Shell 96-Well PCR-platen, laag profiel, dunne wand, met rand, groen/helder	Bio-Rad	#hsp9641	Autosamplerplaat
Octyl B-D-Glucopyranoside	Sigma-Aldrich	O9882-5G	Detergent gebruikt bij vertering
Polypropyleen, 96-ronde Deep Well Plates Steriel	Beckman Coulter, Inc.	267007	Reagens- en verteringsplaat
Prominence UFLCXR HPLC-systeem	Shimadzu, Japan		High flow LC-systeem
QTRAP 6500	SCIEX		Massaspectrometer
Water, HPLC-kwaliteit	Thermo Fisher Scientific	W54	LC MS/MS-oplosmiddel
Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm	Waters	186003564	LC MSMS-kolom