Methodenartikel

Het induceren en karakteriseren van vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen

8.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59843

⸱

18 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, Sapienza University, 2Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, 5INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, 6Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het induceren van lever vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen met het vetzuur zout natriumoleaat en gebruiken we methoden voor de detectie en kwantificering van lipide accumulatie, inclusief coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO'S) microscopie, cytofluorimetrische analyse, olie rood O kleuring, en qPCR.

Samenvatting

Hepatische steatose vertegenwoordigt een metabole dysfunctie die voortvloeit uit een accumulatie van triglyceride-bevattende lipide druppeltjes in hepatocyten. Overmatige vetophoping leidt tot niet-alcoholische vette leverziekte (NAFLD), die mogelijk omkeerbaar is en kan evolueren naar niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH) en uiteindelijk cirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC). De moleculaire mechanismen die de accumulatie van lipiden in hepatocyten koppelen aan de progressie naar NASH, onomkeerbare leverbeschadiging, fibrose, cirrose en zelfs HCC blijven onduidelijk. Hiervoor zijn verschillende in vitro en in vivo modellen ontwikkeld om de pathologische processen te verheldigen die NAFLD veroorzaken. In de huidige studie beschrijven we een cellulair model voor de inductie van vesiculaire steatose van de lever die bestaat uit DMSO-gedifferentieerde humane hepatische HepaRG cellen behandeld met het vetzuur zout natriumoleaat. Inderdaad, natriumoleaat-behandelde HepaRG cellen accumuleren lipide druppeltjes in het cytoplasma en vertonen typische kenmerken van steatose. Dit in vitro menselijk model vertegenwoordigt een waardevol alternatief voor in vivo muizen modellen en de primaire menselijke hepatocyten. We presenteren ook een vergelijking van verschillende methoden voor de kwantificering en evaluatie van vetophoping in HepaRG cellen, waaronder olie rode O-kleuring, cytofluorimetrische Bodipy-meting, metabolische genexpressie analyse door qPCR en coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO'S) microscopie. CARS imaging combineert de chemische specificiteit van Raman-spectroscopie, een chemische analysetechniek die bekend staat in de toepassingen van materiaalwetenschappen, met de voordelen van hoge-snelheid, hoge-resolutie niet-lineaire optische microscopie om nauwkeurige kwantificering van lipide accumulatie en lipide druppel dynamiek. De invoering van een efficiënt in vitro model voor de inductie van vesiculaire steatose, naast een nauwkeurige methode voor de kwantificering en karakterisering van lipide accumulatie, kan leiden tot de ontwikkeling van vroege fase diagnose van NAFLD via de identificatie van moleculaire markers en het genereren van nieuwe behandelstrategieën.

Inleiding

Hepatische steatose wordt gedefinieerd als Intrahepatische vet accumulatie, binnen triglyceride-bevattende lipide druppeltjes, van ten minste 5% van de lever gewicht. Langdurige hepatische lipide-opslag is een potentieel omkeerbaar proces, echter, het kan leiden tot lever metabole dysfunctie, ontsteking en geavanceerde vormen van niet-alcoholische vette leverziekte (NAFLD), de overheersende oorzaak van chronische leverziekte in vele delen van de wereld1,2. Nafld is een multifactoriële ziekte die kan evolueren naar de agressievere niet-alcoholische Steatohepatitis (Nash), die op zijn beurt kan vorderen naar cirrose en, bij een klein percentage van de patiënten, tot hepatocellulair carcinoom (HCC)1,3. Er is momenteel geen goedgekeurde therapie beschikbaar als een specifieke behandeling voor nafld en de combinatie van dieet-en leefstijl modificaties blijft de pijler van nafld en Nash Management4,5,6.

De moleculaire mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van hepatische steatose in de pathogenese van NAFLD moeten nog steeds worden opgehelderd7. In deze context zijn Muismodellen ontwikkeld om de progressie van de ziekte van de menselijke steatose te bestuderen. Een groot aantal verschillende modellen bestaat, en elk heeft zijn voor-en nadelen, met inbegrip van genetische, nutritionele en chemisch geïnduceerde modellen combineren verschillende benaderingen. Genetisch gemodificeerde (transgene of knock-out) muizen ontwikkelen spontaan leverziekte. Opgemerkt moet echter worden dat deze mutaties zeer zeldzaam zijn bij mensen en dat het verwijderen of overexpressie van een enkel gen (bijv. ob/ob-muis) de etiologie van de multifactoriële menselijke ziekte niet nabootsen op moleculair niveau8,9. Evenzo, de ziekte verworven door muizen na dieet of farmacologische manipulatie kan niet nabootsen van de effecten van menselijke diëten in verband met de ontwikkeling van NAFLD in man8. Diermodellen hebben echter de ontwikkelingen in het begrip van NAFLD vergemakkelijkt en deze aanpak is momenteel de meest gebruikte strategie in laboratoriumonderzoek. Niettemin, de replicatie bij mensen van resultaten verkregen in diermodellen herhaaldelijk is mislukt, waardoor slechte vertaling in de kliniek10.

Daarom kunnen in vitro modellen van NAFLD een fundamentele rol spelen in het verhelderend maken van de moleculaire mechanismen van NAFLD progressie, en ze vertegenwoordigen een waardevol hulpmiddel om een groot aantal verbindingen te schermen. Primaire celculturen, vereeuwigd cellijnen en lever biopsieën zijn uitgebreid gebruikt voor onderzoeksdoeleinden11. Primaire menselijke hepatocyten nauw lijken op menselijke klinische voorwaarden, maar er is een beperkt aantal donoren, en primaire celculturen vertonen slechte reproduceerbaarheid als gevolg van de variabiliteit van de cellen. Deze observaties, samen met ethische en logistieke kwesties, hebben geresulteerd in het gebruik van menselijke primaire hepatocyten wordt beperkt12. Dus, hepatische cellijnen vertegenwoordigen een handig alternatief, met een aantal essentiële voordelen ten opzichte van de primaire cultuur, als hepatische cellijnen groeien gestaag, hebben een bijna onbeperkte levensduur, en hebben een stabiel fenotype. Bovendien, cellijnen zijn gemakkelijk toegankelijk en de cultuur voorwaarden van hepatische cellijnen zijn eenvoudiger dan die van primaire hepatocyten en zijn gestandaardiseerd tussen verschillende laboratoria.

Hier beschrijven we in detail een in vitro cel-gebaseerd model van lever vesiculaire steatose, vertegenwoordigd door hepatische gedifferentieerde HepaRG cellen behandeld met het vetzuur natriumoleaat. De HepaRG cellijn werd opgericht van een vrouwelijke patiënt beïnvloed door hepatitis C infectie en een Edmondson Grade I goed gedifferentieerde lever tumor14. De HepaRG-cellijn is een humane bipotente voorlopercellen die kunnen differentiëren bij blootstelling aan 2% dimethylsulfoxide (DMSO) in de richting van twee verschillende fenotypes van de cel: biliaire-achtige en Hepatocyt-achtige. Gedifferentieerde HepaRG cellen (dHepaRG) delen sommige functies en eigenschappen met volwassen hepatocyten en bezitten de mogelijkheid om stabiel lever-specifieke genen zoals albumine, AldolaseB, cytochroom P450 2E1 (CYP2E1), en cytochroom P450 3A4 (CYP3A4)13 (stap 3). Behandeling van dheparg cellen met het vetzuur zout natriumoleaat (250 μM) voor 5 dagen leiden tot de generatie van cytoplasmatische lipide druppeltjes, nabootsen van de effecten van vette lever14,15,17,18 ( stap 4). Accumulatie van lipide druppeltjes kan gemakkelijk worden gedetecteerd door olie rood O kleuring (stap 5), een lysochroom vetoplosbare kleurstof die neutrale triglyceriden en lipiden rood-oranje vlekken. Om efficiënt kwantificeren lipiden in vette dHepaRG, hier illustreren we cytofluorimetrische analyse na kleuring met 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-Bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (stap 6), een lipofiele fluorescerende sonde die lokaliseert aan intracellulaire lipide lichamen en is gebruikt voor het labelen van lipide druppels19. Bovendien laten we hier zien hoe de steatose te evalueren door kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) (stap 7) genexpressie deregulering van verschillende metabole genen in dHepaRG cellen. Om de accumulatie van lipide druppeltjes na de behandeling met natriumoleaat verder te karakteriseren en te kwantificeren, voerden we coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO'S) microscopie (stap 8), een innovatieve techniek die de visualisatie en kwantificering van lipide druppeltjes zonder labeling20,21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van de kweek media en reagentia

  1. Prolifererend medium: supplement William's E medium met GlutaMAX, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicileen/streptomycine, 5 μg/mL insuline en 0,5 μM hydrocortison hemisuccinaat.
  2. Differentiatie medium: supplement William's E medium met GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicileen/streptomycine, 5 μg/mL insuline, 50 μM hydrocortison hemisuccinaat en 2% DMSO.
  3. Vries medium: supplement prolifererend medium met 10% DMSO.
  4. Natriumoleaat: oplossen in 99% methanol bij een concentratie van 100 mM, roer O/N en bewaar bij-20 °C.
  5. Oil Red O: bereid een stamoplossing voor. Weeg 0,35 g olie rood O af en los op in 100 mL isopropanol. Roer O/N, filter (0,2 μm), en bewaar bij RT. bereid een werkoplossing voor: Meng 6 mL olie Red O Stock oplossing met 4 mL ddH2o. Laat zitten op kamertemperatuur (RT) voor 20 min, en vervolgens filteren met een 0,2 μm filter. Juiste filtratie wordt sterk aanbevolen voor succesvolle kleuring om achtergrond te vermijden.
  6. Bodipy (505/515): Los Bodipy (505/515) Dye op in DMSO bij een voorraad concentratie van 100 μM, Bewaar bij-20 °C in het donker en gebruik dit bij een uiteindelijke concentratie van 100 nM.
  7. Verkrijg transparante glazen bodem gerechten voor AUTO'S experimenten.

2. ontdooien, amplificatie en Cryopreservering van HepaRG cellen

  1. Ontdooien stikstof cryopreserved HepaRG cellen door het onderdompelen van een partij in een 37 ° c bad tot ontdooid. Selecteer een lage doorgang batch (< 20). HepaRG cellen zijn commercieel beschikbaar.
  2. Breng de cellen snel over in een buis van 15 mL die 10 mL prolifererend medium bevat en Centrifugeer gedurende 5 min (200 x g, 4 °c).
  3. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met 5 mL prolifererend medium.
  4. Tel de cellen en Verdun met het oog op plaat 2,5 x 104 cellen/cm2.
  5. Vernieuw het medium elke 2 of 3 dagen. Cellen vermenigvuldigen met een verdubbelingstijd van ongeveer 24 uur.
  6. Ontkoppel heparine cellen wanneer bij 80% confluentie door 3-5 min incubatie met trypsine oplossing 0,05%. Verzamel de cellen in het prolifererende medium en Centrifugeer gedurende 5 min (200 x g, 4 °c).
  7. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met 5 mL prolifererend medium.
  8. Tel de cellen en Verdun met het oog op plaat 2,5 x 104 cellen/cm2.
  9. In dit stadium versterkt u de cellen door stappen 2.5-2.8 te herhalen om een passend aantal cellen te bereiken om experimenten te starten, of invriezen zoals in stap 2,10.
  10. Om invriezen heparine cellen, loskoppelen van de cellen 24 h na het bekleden met 3-5 min incubatie met trypsine oplossing 0,05%. Verzamel de cellen in het prolifererende medium en Centrifugeer gedurende 5 min (200 x g, 4 °c). Gooi het supernatant weg, regeer de cellen in 1 ml/batch Vries medium, 1,5 x 106 cellen/batch en invriezen de batches in vloeibare stikstof.

3. differentiatie van HepaRG cellen (dag 0 – 21) (Figuur 1A)

  1. Dag 0. Zaad HepaRG cellen bij lage dichtheid (2,5 x 104 cellen/cm2) in cultuur behandelde gerechten met een passende hoeveelheid proliferatie medium (Figuur 1B). Voor elke bepaling moeten twee gerechten worden geplateerd (olie rode O-kleuring, FACS-analyse, qPCR): één voor controle cellen en één voor OLEAAT-behandelde cellen. Als het uitvoeren van AUTO'S metingen (stap 8), zaai de cellen parallel in transparante glazen bodem gerechten. Als een controle, oogst één onbehandeld gerecht (prolifererende cellen dag 0) voor het uitvoeren van genexpressie analyse van differentiatie marker genen (zie stap 3,6).
  2. Dag 2 en dag 4. Verander het medium met de juiste hoeveelheid proliferatie medium en laat de cellen groeien tot samenvloeiing.
  3. Dag 7. Cellen moeten 100% Confluent Health zijn (Figuur 1C). Was de cellen één keer met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder 1x PBS en voeg een geschikte hoeveelheid differentiatie medium toe.
  4. Dag 8, 9, 12, 15, 18.  Was de cellen één keer met 1x PBS. Verwijder 1x PBS en voeg een geschikte hoeveelheid differentiatie medium toe.
  5. Dag 21. Observeer HepaRG cellen onder een microscoop en zorg ervoor dat de cellen confluente gedifferentieerde culturen zijn (Figuur 1D).
  6. Als een controle, oogst een controle schotel (gedifferentieerde cellen dag 21) voor het uitvoeren van genexpressie analyse (stap 7) van differentiatie marker genen (Figuur 1E).
  7. Op dag 21, gedifferentieerde HepaRG cellen kunnen worden cryopreserved in vloeibare-stikstof.

4. inductie van vesiculaire steatose (dag 21 – 26)

  1. Dag 21. Verdund natriumoleaat (100 mM) met een geschikt volume volledig differentiatie medium tot een eindconcentratie van 250 μM (1:400). Voeg 99% methanol 1:400 (hetzelfde volume als die van natriumoleaat) toe aan een ander deel van het differentiatie medium om de behandeling van het voertuig te controleren. (Bijvoorbeeld: Voeg 25 μL natriumoleaat toe aan 10 mL medium en voeg parallel 25 μL van 99% methanol toe aan 10 mL medium). Was de cellen één keer met 1x PBS en voeg een voertuig of natriumoleaat medium toe.
  2. Dag 23 en dag 25. Verander het medium met de juiste hoeveelheid vers bereid medium zoals in stap 4,1.
  3. Dag 26. Observeren door optische Microscoop dat lipide druppeltjes accumuleren in de natriumoleaat behandelde cellen en zijn gemakkelijk zichtbaar als doorschijnende druppels in het cytoplasma zoals in Figuur 2A.

5. evaluatie Vanlipide overbelasting en steatose inductie: olie rood O kleuring

  1. Was de cellen één keer met 1x PBS en verwijder 1x PBS volledig.
  2. Voeg 4% Paraformaldehyde (verdund in 1x PBS) toe en inincuberen gedurende 15 minuten bij RT.
    Let op: Paraformaldehyde is giftig, dus deze stap moet worden uitgevoerd in een rook afzuigkap, met beschermende uitrusting, inclusief handschoenen, een Labcoat en een masker.
  3. Verwijder Paraformaldehyde en was de cellen tweemaal met 1x PBS. De cellen kunnen gedurende een paar dagen vóór de kleuring in 1x PBS bij 4 °C worden bewaard. Wikkel met Parafilm en bedek met aluminiumfolie om te voorkomen dat de cellen drogen.
  4. Verwijder 1x PBS. Inincuberen de cellen met 60% isopropanol gedurende 5 min bij RT.
  5. Verwijder isopropanol en laat de cellen volledig drogen bij RT.
  6. Voeg olie rode O-werkoplossing toe en inincuberen bij RT gedurende 30 minuten. Het volume van de werkoplossing die nodig is voor elk monster komt overeen met het volume van de media die worden gebruikt voor het kweken van de cellen.
  7. Verwijder Oil Red O Solution en voeg onmiddellijk ddH2o. was de cellen 4 keer met DDH2o.
  8. Verzamel afbeeldingen onder de Microscoop voor analyse (Figuur 2B).
  9. Om Oil Red O Dye te Elueer: Verwijder al het water en laat het drogen; Voeg 1 mL 100% isopropanol toe en incuberen gedurende 10 minuten met zachtjes schudden bij RT.
  10. Pipet keer het isopropanol met geeleerde olie rode O-kleurstof meerdere malen op en neer, zodat alle olie rode O in de oplossing zit. Breng de oplossing over naar een kuvette. Meet OD500 nm door spectrophotometrie en gebruik 100% isopropanol als blanco (Figuur 2C).

6. evaluatie van lipide-overbelasting en steatose inductie: Bodipy kleuring en Cytofluorimetrische analyse

  1. Was de cellen één keer met 1x PBS. Inbroed met 100 nM Bodipy verdund in 1x PBS in het donker voor 40 min bij 37 °C. Een onbevlekte controle moet worden opgenomen in de flow cytometrie metingen. Vanaf dit punt, Bescherm de monsters van licht zoveel mogelijk.
    Opmerking: Het volume van de kleurings oplossing voor elk monster komt overeen met het volume van de media die worden gebruikt voor het kweken van cellen.
  2. Verwijder de kleurings oplossing en was de cellen één keer met 1x PBS. Ga verder naar stappen 6.3-6.6. voor FACS (fluorescentie-geactiveerde celsortering) of voor stap 6,7 voor Microscoop-beeldvorming.
  3. Schuif de cellen zachtjes met 1x PBS en breng deze over in een buis van 15 mL. Centrifugeer gedurende 10 min (200 x g, 4 °c).
  4. Verwijder voorzichtig de supernatanten zonder de pellets te storen en was met 3 ml 1x PBS. Centrifugeer gedurende 5 min (200 x g, 4 °c).
  5. Verwijder de supernatanten en revoer in 300 μL van 1x PBS en breng vervolgens over naar een FACS Tube.
  6. Meet onmiddellijk de intensiteit van de Bodipy fluorescentie door cytofluorimetrische analyse met excitatie/emissie golflengten van 505/515 nm (Figuur 3A, B).
  7. Was de cellen één keer met 1x PBS en verwijder PBS volledig.
  8. Voeg 4% Paraformaldehyde (verdund in 1x PBS) toe en inincuberen gedurende 15 minuten bij RT.
    Let op: Paraformaldehyde is giftig, dus deze stap moet worden uitgevoerd in een rook afzuigkap, met beschermende uitrusting, inclusief handschoenen, een Labcoat en een masker.
  9. Verwijder Paraformaldehyde en was de monsters 3x gedurende 5 min in PBS. De cellen kunnen in 1x PBS bij 4 °C worden bewaard of onmiddellijk worden afgebeeld (Figuur 3C). Voor opslag, wikkel met Parafilm en afdekking met aluminiumfolie om te voorkomen dat de cellen drogen.

7. evaluatie van lipide-overbelasting en steatose inductie: qPCR

  1. Was de cellen één keer met 1x PBS. Schrael de cellen met 1x PBS, centrifugeer bij 200 x gen gooi het supernatant weg. Bij deze stap kunnen cellen worden geoogst bij-80 °C of worden verwerkt zoals in stap 7,2.
  2. Voer de totale RNA-isolatie volgens standaardmethoden uit met behulp van commerciële reagentia volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Evalueer de RNA-concentratie met UV-spectrofotometrische metingen, om ervoor te zorgen dat de RNA-zuiverheid hoog is (dicht bij 2,0) op basis van de A260/A280-meting.
  4. Synthetiseren cDNA van 1 μg totaal RNA met een standaard cDNA synthese Kit.
  5. Verdun cDNA tot een laatste 50 μL volume met H2O.
  6. Analyseer elke cDNA-sample in drievlaat door qPCR: bereid één qPCR-Master mengsel (tabel 1) voor dat voldoende is voor de benodigde reacties voor elke primer, inclusief primers die specifiek zijn voor de drie huishoudelijke genen als besturingselementen: gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), actinB en ribosomale 18S (Zie tabel van materialen voor primer sequenties):
  7. Verdeel 18 μL Master Mix per put in een PCR-multiwall plaat.
  8. Voeg in elke put 2 μL cDNA-monster toe. De plaat afdichten.
  9. Voer de monsters uit volgens de thermische cycler-instructie.

8. evaluatie van lipide overbelasting en steatose inductie: AUTO'S

  1. Corrigeer de cellen die eerder zijn bereid op gerechten met glazen bodem, zoals beschreven in stappen 5.1-5.3.
  2. Schakel een commercieel instelbaar Pico gepulseerd lasersysteem in en stem het af om twee uitgangen van verschillende golflengten te verkrijgen. Het frequentieverschil tussen de uitgangen moet 2.840 cm-1 voor het genereren van de intense auto's lichtsignaal overeenkomend met methyleen symmetrische stretching; bij een uitgang met een vaste golflengte bij 1.064 nm ("Stokes"-licht) moet de andere golflengte worden afgestemd op 817 nm ("pomp"-licht).
  3. Zorg ervoor dat de 817 nm-uitgang ruimtelijk en tijdelijk overlapt met de 1.064 nm-uitgang: gebruik een geschikte dichroïde spiegel (d.w.z. met een snede tussen 817 en 1.064 nm) om de balken ruimtelijk te combineren en een optische vertragings lijn te gebruiken om temporele overlapping van de laser te verkrijgen Pulsen.
  4. Zorg ervoor dat de twee copropagerende balken beide gecollimatiseerd zijn en dat hun diameters vergelijkbare waarden hebben die geschikt zijn voor het optische systeem binnen de Microscoop die hen op het monster zal concentreren; indien nodig, afzonderlijk collimate de balken voor de dichroïde spiegel die ze combineert.
  5. Schakel een commercieel omgekeerde Microscoop systeem in dat een infrarood laser scanning-eenheid en een tweekanaals rood/groen epi-detectie-eenheid moet bevatten en lijn de copropagerende laserstralen in de Scaneenheid uit.
  6. Het openen van de Dual-Channel epi detectie-eenheid, de filter kubus verwijderen en het detectie filter van de rode golflengte vervangen door een band pass filter dat het 2.840 cm-1 Cars signaal kan selecteren dat gecentreerd is op 663 nm voor de 817/1064 nm pomp/Stokes excitatie Regeling. Een smalle bandbreedte (20 nm) filter heeft de voorkeur om het verzamelen van hoge niveaus van fluorescerende achtergrond signalen te voorkomen.
  7. Plaats een gerecht op het podium van de omgekeerde AUTO'S Microscoop, en met behulp van een 100x olie-onderdompeling doel, verschuiving van de verticale positie van het doel om zich te concentreren op de cellen.
  8. Stel de Microscoop software in voor het verzamelen van afbeeldingen met hoge resolutie (1024 x 1024 pixels) over een gezichtsveld van 127 μm x 127 μm.
  9. Stel de Microscoop software in om continu beelden van het gezichtsveld van 127 μm x 127 μm te verkrijgen en weer te geven en de weergegeven beelden te controleren terwijl de parameters voor de beeld verzameling worden optimaliseert. Zorg ervoor dat de laser krachten in balans zijn voor een snelle beeld verzameling en minimale schade, en voeg zo nodig geschikte filters voor neutrale dichtheid toe aan de straal paden en selecteer een pixel dwelltijd die het mogelijk maakt om beelden met een goed signaal-ruis te verzamelen onder de geselecteerde Laser stroom condities.
  10. Verkrijg en Bewaar afbeeldingen van verschillende weergave gebieden binnen de schaal onder de geoptimaliseerde omstandigheden. Optioneel kunnen multiphoton fluorescentie beelden, gegenereerd door een groen golflengte emissie (meestal uit twee-Fobe excitatie bij 817 nm), gelijktijdig worden verzameld via de andere epi-detector. Herhaal stap 8.7-8.10 voor elk gerecht.
  11. Voor de image-analyse van CARS verwerkt u afbeeldingen met de FIJI-implementatie van ImageJ. Bedien de Despeckle-functie (of een soortgelijk tekengereedschap) voor elke afbeelding vóór verdere analyse om de signaal-ruis verhoudingen te verbeteren zonder verlies van Details.
  12. Gebruik FIJI om cellen handmatig te selecteren en vervolgens automatisch te tellen lipide druppels binnen gesegmenteerde individuele cellen om statistieken te produceren over lipide druppel gebieden en nummers voor elke cel en voor de volledige afbeeldingsgegevensset voor elk gerecht.

9. bepaling van de levensvatbaarheid van de MTT-cel

  1. Plaat gedifferentieerde HepaRG cellen in een 96-put plaat met een dichtheid van 1 x 105 cellen/goed in een finale 100 μL volume van differentiatie kweekmedium.
  2. 24 uur na het zaaien, behandel de cellen met 99% methanol (voertuig) en met 100 μM, 250 μM en 500 μM natriumoleaat en natrium palmitaat verdund in 100 μL differentiatie kweekmedium/goed in drievultaat.
  3. Verander het medium met 99% methanol en met 100 μM, 250 μM en 500 μM natriumoleaat en natrium palmitaat verdund in 100 μL differentiatie kweekmedium/goed elke 24 h.
  4. 96 h na de behandeling met methanol/natriumoleaat/natriumpalmitaat worden de cellen behandeld met 2 μM Doxorubicine, verdund in 100 μL differentiatie kweekmedium/goed in drievultaat als controle.
  5. 18 h na behandeling met doxorubucin, verander het medium met 100 μL differentiatie kweekmedium.
  6. Pipet 20 μL van 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium reagens MTT (tabel van de materialen) in elke put van de 96-well-test plaat met de cellen in 100 μL cultuurmedium . Neem een achtergrond besturingselement op door Pipetteer 20 μL van het reagens in een goed besturingselement zonder cellen in 100 μL differentiatie kweekmedium in drievultaat.
  7. Inincuberen van de plaat bij 37 °C in een lucht bevoficeerd, 5% CO2 -atmosfeer.
  8. Na incuberen voor 30, 60 en 90 min met MTT tetrazoliumreagens, noteer de extinctie bij 490 nm met behulp van een 96-well plate Reader. Trek de achtergrond absorptie van de No-Cell Control putten uit de extinctiewaarden voor de andere monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het induceren en karakteriseren van vesiculaire steatose in DMSO-gedifferentieerde HepaRG cellen door natriumoleaat behandeling (Figuur 1A).

Differentiatie van HepaRG cellen.
Om differentiatie efficiënt te induceren, moeten prolifererende cellen worden gescheiden bij een lage dichtheid (2,5 x 104 cellen/cm2) in het proliferatie medium. Bij een lage dichth...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft hoe u de Heparylcellen onderscheidt en hoe u vesiculaire steatose door natriumoleaat behandeling induceert (Figuur 1A). Sterker nog, in vergelijking met andere humane hepatocellulaire carcinoom (HCC) cellijnen vertoont de heparg cellijn kenmerken van volwassen humane hepatocyten, die een waardevol alternatief vertegenwoordigen voor ex vivo gecultiveerde primaire humane hepatocyten13,14 ,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Prof. Christian Trepo (INSERM U871, Lyon, Frankrijk), die vriendelijk de HepaRG cellen geleverd. We zijn Rita Appodia dankbaar voor administratieve hulp. Dit werk werd gesteund door MIUR-Ministero dell'istruzione, dell'università e della Ricerca (FIRB 2011 – 2016 RBAP10XKNC) en Sapienza universiteit van Rome (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hyclone HyClone Fetal Clone II GE HealthcareSH30066
William’s E medium with GlutaMAX Thermofisher32551087
Penicillin/streptomycin SIGMAP4333
Insulin SIGMAI9278
Hydrocortisone hemisuccinateSIGMAH2270
DMSO, dimethyl sulfoxideSIGMAD2438   
Sodium OleateSIGMAO7501 
MethanolSIGMA179337
IsopropanolSIGMA278475
BODIPY 505/515ThermofisherD3921
PBSThermofisher14190-250
Formaldehyde solutionSIGMA252549
RNAse free DNAseIPromegaM198A 
Glass-bottomed dishesWillco WellsGWST-5040
Oil Red solutionSIGMAO625
CellTiter 96 AQueous One SolutionPromega G3582
q-PCR oligo nameSequence
ACACB FORCAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REVCCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
β-actin FORGCACTCTTCCAGCCTTCCT
β-actin REVAGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FORTGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REVAAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FORGCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOB REVTAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FORCCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FORCTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REVGGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FORTCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REVGCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FORTTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REVCGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FORCTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REVTCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FORTGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REVAGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FORTCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REVATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FORCCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REVACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FORACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REVTGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FORTTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REVCCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FORAATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REVGGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FORTCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REVTCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FORTGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REVCCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FORCGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REVTTGGCAAATGCTTTCGCTC

Referenties

  1. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  2. Byrne, C. D., Targher, G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology. 62 (1), Suppl 47-64 (2015).
  3. Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis. Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).
  4. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  5. Banini, B. A., Sanyal, A. J. Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).
  6. Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).
  7. Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
  8. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).
  9. Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).
  10. Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).
  11. Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes. Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).
  12. Gómez-Lechón, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
  13. Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies. Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).
  14. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  15. Anthérieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells. Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).
  16. Rouge, A., et al. PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).
  17. Belloni, L., et al. Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model. Scientific Reports. 8, 13638(2018).
  18. Nunn, A. D. G., et al. The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells. Scientific Reports. 6, 28025(2016).
  19. Donato, M. T., et al. Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells. Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).
  20. Hellerer, T., Axäng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).
  21. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), 51092(2012).
  22. Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  23. Nelson, L. J., et al. Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).
  24. Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  25. Pusl, T., et al. Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).
  26. Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).
  27. Mei, S., et al. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes. Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).
  28. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).
  29. Moravcová, A., Červinková, Z., Kučera, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotková, H. The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture. Physiological Research. 64, Suppl 5 627-636 (2015).
  30. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).
  31. Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., Müller, M. Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy. Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).
  32. Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination. Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).
  33. Jüngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy. Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).
  34. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), Pt B 1260-1272 (2017).
  35. Cohen, S. Lipid droplets as organelles. International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).
  36. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Behandeling met natriumoleaatOil Red O kleuringBodipy metingCARS microscopieophoping van lipidedruppelsmodel voor hepatische steatosegedifferentieerde hepatocytenNAFLD in vitro

Gerelateerde artikelen