Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59845

⸱

5 november 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol om vrij zwevende segment culturen van volwassen menselijk brein voor te bereiden wordt gepresenteerd. Het protocol is een variatie van de veelgebruikte segment cultuurmethode met behulp van membraan inserts. Het is eenvoudig, kosteneffectief, en aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen gericht op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter de leeftijd geassocieerde hersenziekten.

Samenvatting

Organotypische, of segment culturen, zijn op grote schaal gebruikt om aspecten van het centrale zenuwstelsel functioneren in vitro te modelleren. Ondanks het potentieel van segment culturen in de neurowetenschappen, zijn studies die gebruik maken van volwassen zenuwweefsel om dergelijke culturen voor te bereiden nog schaars, met name die van menselijke proefpersonen. Het gebruik van volwassen menselijk weefsel om segment culturen voor te bereiden is bijzonder aantrekkelijk om het begrip van menselijke neuropathologieën te verbeteren, omdat ze unieke eigenschappen hebben die kenmerkend zijn voor het volwassen menselijke brein dat ontbreekt in plakjes die worden geproduceerd door knaagdieren (meestal neonataal) zenuwweefsel. Dit protocol beschrijft hoe te gebruiken hersenweefsel verzameld van levende menselijke donoren voorgelegd aan recidiverend hersenchirurgie om te bereiden op korte termijn, vrij zwevende segment culturen. Er worden ook procedures gepresenteerd voor het onderhouden en uitvoeren van biochemische en celbiologie-testen met behulp van deze culturen. Representatieve resultaten tonen aan dat de typische menselijke corticale laminering wordt bewaard in plakjes na 4 dagen in vitro (DIV4), met de verwachte aanwezigheid van de belangrijkste neurale celtypen. Bovendien ondergaan plakjes bij DIV4 een robuuste celdood wanneer ze worden uitgedaagd met een toxische stimulus (H2O2), wat het potentieel van dit model aangeeft om als platform te dienen in celdood testen. Deze methode, een eenvoudiger en kosteneffectief alternatief voor het veelgebruikte protocol met behulp van membraan inserts, wordt vooral aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen die gericht zijn op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter leeftijdsgebonden hersenziekten. Ten slotte, hoewel het protocol is gewijd aan het gebruik van corticale weefsel verzameld van patiënten die worden voorgelegd aan de chirurgische behandeling van pharmacoresistant temporale kwal epilepsie, wordt aangevoerd dat weefsel verzameld uit andere hersengebieden/voorwaarden ook moet worden beschouwd als bronnen om soortgelijke vrij zwevende segment culturen te produceren.

Inleiding

Het gebruik van menselijke monsters in onderzoek is ondubbelzinnig een geweldige optie om menselijke hersen pathologieën te bestuderen, en moderne technieken hebben nieuwe manieren geopend voor robuuste en ethische experimenten met behulp van door de patiënt afgeleid weefsel. Methoden zoals organotypic/slice culturen bereid uit volwassen menselijk brein zijn steeds vaker gebruikt in paradigma's zoals optogenetica1, elektrofysiologie2,3,4,5, plasticiteit 6,7,8,9, neurotoxiciteit/neuroprotectie10,11,12,13, celtherapie14, screening van geneesmiddelen15,16,17, genetica en genbewerken12,18,19,20, onder andere, als een strategie voor betere het begrijpen van neurologische aandoeningen tijdens de volwassenheid.

Het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan menselijke hersen pathologieën is afhankelijk van experimentele strategieën die een groot aantal onderwerpen vereisen. Omgekeerd is, in het geval van segment culturen, hoewel de toegang tot menselijke monsters nog steeds moeilijk is, de mogelijkheid om tot 50 schijfjes uit één enkel corticale monster te genereren gedeeltelijk de eis van het werven van meerdere vrijwilligers door het verhogen van de aantal replicaten en uitgevoerde assays per verzameld weefsel21.

Verschillende protocollen voor organotypische/segment culturen van de hersenen zijn beschreven, variërend van de klassieke Franceschetti-concepten22,23 tot de rolbuis24,25,26, semi-permeabele membranen interface27,28,29,30en vrij zwevende segmenten31,32. Afhankelijk van de bijzonderheden van een experimenteel ontwerp, heeft elke techniek zijn eigen voor-en nadelen. Op korte termijn, vrij zwevende segmenten culturen van volwassen menselijke hersenen is in sommige gevallen voordelig over de methode die wordt gebruikt door Stoppini et al.27, indien rekening houdend met het feit dat, hoewel lange termijn cel overleving in vitro is meestal een belangrijke zorg bij het evalueren van een cultuur methode, in veel experimenten slechts korte perioden in cultuur zijn nodig12,31,32,33,34,35. Onder deze omstandigheden presenteert het gebruik van vrij zwevende culturen het voordeel dat het eenvoudiger en kosteneffectiever is, en dat het nauwkeuriger lijkt op de oorspronkelijke menselijke weefsel aandoening dan op plakjes die gedurende 2-3 weken in cultuur worden gehouden.

Ondanks het potentieel van segment culturen aan de neurowetenschappen, zijn studies die gebruik maken van volwassen zenuwweefsel om dergelijke culturen voor te bereiden nog schaars, met name van menselijke proefpersonen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik van verzamelde hersenweefsel van levende menselijke donoren ingediend bij recidiverend hersenchirurgie om vrij zwevende segment culturen te bereiden. Procedures voor het onderhouden en uitvoeren van biochemische en celbiologie testen met behulp van deze culturen zijn gedetailleerd. Dit protocol is bewezen waardevol voor het analyseren van de levensvatbaarheid en neuronale functie in onderzoeken naar de mechanismen van neuro pathologieën die verband houden met de volwassenheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Levende volwassen hersenweefsels werden verkregen van patiënten die resectieve Neurochirurgie ondergingen voor de behandeling van pharmacoresistant temporale kwal epilepsie (Figuur 1A). Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het klinieken ziekenhuis op de medische school Ribeirão Preto (17578/2015), en patiënten (of hun juridisch verantwoordelijke persoon) spraken de voorwaarden voor geïnformeerde toestemming af en ondertekenden deze. De verzameling van het weefsel werd gedaan door het Neurochirurgie team in het epilepsie chirurgie centrum (CIREP-clinics Hospital aan de Ribeirão Preto Medical School, Universiteit van São Paulo, Brazilië).

1. sterilisatie van materialen

Opmerking: alle materialen en oplossingen moeten vóór gebruik gesteriliseerd worden.

  1. Steriliseer alle chirurgische gereedschappen en vibratome snijden materiaal (meshouder, preparaat schijf, buffer lade) in een droge steriliserend oven voor 4 uur bij 180 °c.
  2. Steriliseren temperatuurgevoelig materiaal of apparatuur door UV-of gamma-bestraling.
  3. Steriliseren media en oplossingen door autoclavation of filtratie door middel van 0,22 μm porie membranen.

2. voorbereiding van de oplossingen

  1. Bereid 15-20 mL transportoplossing voor: 50% v/v Hanks ' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) pH 7,4, 50% v/v Basaal medium voor het onderhoud van postnatale en volwassen hersenneuronen (tabel met materialen), aangevuld met 10 mm 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfoninezuur (Hepes), 3 mg/mL glucose en 33 μg/mL gentamicine.
    Opmerking: de transport oplossing moet gedurende ten minste 20 minuten voorafgaand aan de monsterafname gekoeld en zuurstofrijk (borrelend met Manager gas) zijn.
  2. Bereid 300 ml van de snijden oplossing (HBSS aangevuld met 10 mm Hepes en 3 mg/ml glucose) en koel het af in een vriezer op het punt van de initiële kristalvorming.
  3. Bereid 20 mL kweekmedium voor: Basaal medium voor het onderhoud van postnatale en volwassen hersenneuronen (tabel met materialen) aangevuld met 1% L-glutamine derivaat (tabel vanmaterialen), 2% supplement voor neurale cultuur (tabel van Stoffen), 1% penicileen/streptomycine en 0,25 μg/ml amfotericine B.

3. opzet van de snijapparatuur

Opmerking: dit protocol wordt idealiter uitgevoerd met de hulp van een collega als gevolg van de logistiek van monsterafname in de chirurgische ruimte.

  1. In een emmer zout-toegevoegd ijs, laat de snijden oplossing rusten onder de Manager mengsel borrelen (95% O2,5% co2) voor ten minste 20 minuten vóór gebruik.
  2. Bereid een blok van 3% agarose (ongeveer 2 cm x 2 cm x 2 cm) en superlijm het op de viatome specimen schijf om extra mechanische ondersteuning te creëren voor het weefselmonster tijdens het snijden (Figuur 1E).
  3. Stel de vibratome voor snijden: sectie dikte van 200 μm, frequentie van trillingen van 100 Hz, en de snelheid van het Segeren tussen 0.5-1.0 mm/s.
  4. Vergrendel de vibratome-buffer lade op de vibratome-basis en voeg ijs toe om het koel te houden voordat u de snijden-oplossing en het monster ontvangt, en tijdens de snijden-procedure.

4. monsterverzameling

Opmerking: in dit protocol werd humaan neocorticale weefsel verzameld in de chirurgische ruimte en getransporteerd naar het laboratorium.

Let op: bij het omgaan met menselijke monsters, volg de juiste veiligheidsprotocollen vastgesteld door de instelling.

  1. De transport apparatuur (Figuur 1C) instellen die bestaat uit: een draagbare gascilinder met het Manager-mengsel aangesloten op een druk/flux klep die de gasuitgang regelt die is aangesloten op een silicium slang die de gasproductie verbindt met het vervoer het schip een transportvaartuig, meestal een conische centrifugebuis van 50 mL met geperforeerd deksel voor gasinvoer, met de transportoplossing; en ijs voor monster koeling tijdens transport.
  2. Het specimen (Figuur 1B) onmiddellijk naar het lab verzamelen en transporteren. Dompel het preparaat onder in een koude transportoplossing (voortdurend borrelen met het Manager mengsel).

5. Segeren

  1. Breng het preparaat over in een Petri schaaltje (100 mm x 20 mm) met een snijden oplossing en verwijder, met fijne chirurgische gereedschappen, voorzichtig zoveel mogelijk van de resterende hersenvliezen in het monster (Figuur 1D).
  2. Kies de beste sample oriëntatie voor het produceren van plakjes met de bijzondere karakteristieken van het experimentele ontwerp, en met een No. 24 scalpel Blade, trim een vlakke ondergrond om de basis te zijn gelijmd aan de specimen schijf.
  3. Met behulp van een wegwerp plastic lepel en delicate penselen, verzamel het fragment van de Petri schaal en droge overtollige oplossing met behulp van filtreerpapier (droog door capillariteit en Vermijd het aanraken van het weefsel fragment met papier).
  4. Bevestig het weefsel met behulp van superlijm aan de vibratome-specimen schijf totdat het stevig aan de schijf is bevestigd en in contact komt met het agarose-blok (Figuur 1E).
  5. Plaats de vibratome specimen disk (met weefsel goed aangesloten) in de vibratome buffer tray gevuld met snijden oplossing die tijdens het hele proces moet borrelen.
  6. Vergrendel de meshouder op zijn plaats met het scheermesje stevig vast.
  7. De snijden-oplossing moet zowel het preparaat als het blad bedekken en vervolgens beginnen met snijden (Figuur 1F).
  8. Snijd het preparaat in schijfjes van 200 μm.
    Opmerking: Hoewel sommige vibratomes de specimens automatisch knippen, kunnen de nauwe observatie en kleine aanpassingen in de snijsnelheid tijdens het proces helpen bij het produceren van betere segmenten. Gooi de eerste onregelmatige schijfjes weg.
  9. Breng de segmenten van de buffer lade over naar een Petri schaaltje met een snijden oplossing en snijd losse randen en overtollige witte Mater in een verhouding van ongeveer 70% cortex/30% witte stof.

6. cultuur

Opmerking: Voer deze stap uit in een laminaire flowkast onder steriele omgeving.

  1. Voeg 600 μL kweekmedium per put (in een 24-put) toe en inincuberen gedurende ten minste 20 minuten bij 36 °C en 5% CO2 voorafgaand aan het bekleden van de plakjes.
  2. Plaat één segment per put met een penseel (Figuur 1G).
  3. Als er ongebruikte putjes in de plaat zitten, vul ze dan met 400 μL steriel water.
  4. Incuberen de plaat bij 36 °C, 5% CO2.
    Opmerking: de eerste gemiddelde vervanging moet worden uitgevoerd tussen 8-16 uur na het bekleden, afhankelijk van de grootte van het segment.
  5. Supplement 10 mL van het eerder bereide kweekmedium met 50 ng/mL hersenen afgeleide neurotrophic factor (BDNF).
    Opmerking: tijdens de eerste 8-16 h worden de schijfjes geïnineerd in 600 μL medium om nutriënten ontbering en verzuring te voorkomen, aangezien het gemiddelde verbruik in deze fase wordt versneld. Vanaf de volgende stap wordt het volume van het medium per put aangepast tot 400 μL.
  6. Verwijder 333 μL van het geconditioneerde medium van elke put en voeg 133 μL vers BDNF-aangevuld medium toe.
  7. Herhaal het proces van gemiddelde vervanging om de 24 uur door een derde van het geconditioneerde medium te vervangen door een nieuw, met BDNF aangevuld medium.

7. evaluatie van de gezondheid, morfologie en functie in gekweekte plakjes

Opmerking: om celdood te induceren met het oog op illustratie in de representatieve resultaten, werden sommige plakjes ingediend bij een behandeling van 24 uur met de oxidatieve stress-inductor H2O2. Stappen 7.1.2 en 7.1.3 beschrijven het gebruik van H2O2 om celdood te induceren.

  1. Levensvatbaarheid van de cel
    Opmerking: een eenvoudige, ongecompliceerde methode om neurotoxische/neuroprotectie te evalueren in betwiste segment culturen is de 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium (MTT) test36, die het percentage van metabole actieve cellen meet onder normale omstandigheden in vergelijking met behandelde monsters.
    1. Vervang in de laminaire flowkast een derde van het medium met vers medium.
    2. Van een 30% H2o2 stockoplossing, voeg een volume van h2o2 per put toe om de beoogde eindconcentratie te bereiken (30 mm of 300 mm).
      Opmerking: H2O2 is toegevoegd na de dagelijkse verandering van het medium om de juiste toevoer van verse voedingsstoffen te garanderen voor de uitdaging.
    3. Incuberen de plaat voor 24 uur bij 36 °C, 5% CO2.
      NB: na de behandeling met H2O2 (of een andere toxische stimulans van belang) beschrijven de volgende stappen de levensvatbaarheid van de cel door de MTT-test.
    4. Voeg 40 μL MTT-oplossing toe aan een eindconcentratie van 0,5 mg/mL voor elke put in de plaat.
    5. Incuberen de plaat bij 36 °C, 5% CO2 voor 3 uur.
    6. Was de schijfjes met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en breng deze over naar een micro tube.
    7. Verwijder de resterende oplossing zorgvuldig door Pipetting.
    8. Weeg de microbuisjes met de segmenten af om de massa van elk segment te bepalen (dit is de sleutel voor het normaliseren van de extinctie metingen).
      Opmerking: indien nodig kunnen monsters in dit stadium worden bevroren (-20 °C) voor latere verwerking.
    9. Homogeniseren de segmenten in 200 μL van isopropanol/HCl met behulp van een gemotoriseerde vijl.
    10. Centrifugeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 minuten bij 2600 x g.
    11. Vang het supernatant op en meet de extinctie bij 540 nm.
  2. KCl-geïnduceerde neuronale depolarisatie
    Opmerking: fosforylering van de mitogeen geactiveerde proteïne kinase (MAPK) signalering Cascade proteïne ERK, gevolgd door Western blotting, kan worden gebruikt voor de kwantificering van de neuronale reactie op KCl-geïnduceerde depolarisatie37 .
    1. Vervang in de stroom kast het kweekmedium door 300 μL HBSS die eerder zijn geëscaleerd tot 36 °C.
    2. Vervang de HBSS met 300 μL verse HBSS die eerder zijn geëscaleerd tot 36 °C.
    3. Incuberen de plaat bij 36 °C, 5% CO2 gedurende 15 min.
    4. Vervang de HBSS met ofwel de verse HBSS of met 80 mM KCl depolariserende oplossing (beide bij 36 °C) en inbroed bij 36 °C, 5% CO2 gedurende 15 min.
    5. Breng de segmenten van de plaat over naar de microbuisjes. In deze stap kunnen segmenten worden opgeslagen bij-20 °C voor latere verwerking.
    6. Bereid weefsel extracten voor in 150 μL radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (50 mM tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% nonionische oppervlakteactieve stof; 0,1% natriumdodecylsulfaat; pH 7,5). Centrifugeer extracten bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 16000 x g, verzamel supernatant en bepaal de totale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-methode.
    7. Laad 30 μg totaal eiwit op een 12% natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE).
    8. Breng na elektroforese het gelgehalte over naar een nitrocellulose membraan.
    9. Na het blokkeren van het membraan met 5% niet-vette droge melk in TBS plus 0,1% tween, incuberen met muis anti-pERK (1:1000) voor 16 uur bij 4 °C. Na het wassen, inincuberen voor 2 h bij RT met konijn anti-ERK1/2 (1:1000).
    10. Inincuberen met het geschikte HRP-geconjugeerde secundair antilichaam bij RT gedurende 1 uur.
    11. Onthul met het gewenste HRP-substraat.
  3. Morfologische evaluatie
    Opmerking: naast overleving van de cel en functionele evaluaties is het belangrijk om weefsel morfologie te analyseren. Let op dat resectioneren van het gekweekte segment een belangrijke stap is om zo veel mogelijk materiaal van hoge kwaliteit te produceren voor morfologische analyse.
    1. Bevestiging, cryoprotecting en resectioning van de plakjes
      1. Breng de segmenten van de putten over met cultuurmedium naar een nieuwe 24-putplaat met PBS.
      2. Verwijder de PBS en voeg 1 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) toe. Het is belangrijk dat segmenten plat worden gehouden voordat PFA wordt toegevoegd. Inincuberen op 4 °C.
      3. Verwijder voorzichtig de PFA-oplossing en voeg 1 mL 30% sucrose-oplossing toe. Inincuberen voor 48 uur bij 4 °C.
      4. Stel de Vries microtoom in op-40 °C.
      5. Bereid een sacharose basis op de microtoom fase waar de schijfjes moeten worden geplaatst (Figuur 2a). Laat het volledig bevriezen en snijd zorgvuldig enkele van de bevroren sucrose om een plat oppervlak te produceren waarop het segment wordt geplaatst.
      6. Plaats elk segment op een uitgerekte plastic film en gebruik een penseel om het weefsel plat te maken.
      7. Breng het uitgerekte segment in één beweging over naar de bevroren sacharose basis.
        Opmerking: het is niet mogelijk om het segment te verplaatsen wanneer het zich boven de bevroren sacharose basis bevindt. Voer deze overdrachts stap zorgvuldig uit.
      8. Laat de schijfje rusten voor 5-10 min voor een goede bevriezing.
      9. Snijd het segment in 30 μm secties.
      10. Breng de 30 μm-secties over in een Petri schaaltje met PBS.
      11. Ga verder met het histologie protocol dat meer geschikt is voor het experimentele ontwerp.
        Opmerking: de 30 μm-secties kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor vrij zwevende immunohistochemie, gemonteerd op microscopie dia's voor verdere histologie of opgeslagen in antivriesoplossing bij-20 °C.
    2. Immunohistochemistry
      Opmerking: de standaardprotocollen immunohistochemie en immunofluorescentie variëren tussen laboratoria. Voor een gedetailleerde versie van het protocol dat hier wordt gebruikt, verwijzen wij u naar Horta et al.38. Primaire antilichamen die worden gebruikt voor immunostainings in Figuur 2 omvatten neuronale kernen (neun), gezonde volwassen neuron marker, gliacellen fibrillair zuur eiwit (GFAP), astorcytes marker, geïoniseerde calcium binding adapter (IBA-1), en Microglia Markering.
      1. Inbroed de segmenten in blokkerende oplossing (bijv. 2% normaal Donkey serum in PBS) gedurende 40 min.
      2. Incuberen 's nachts met primair antilichaam onder milde opwinding bij 4 °C.
      3. Na wassen met PBS, incuberen voor 120 min met biotinyleerd secundair antilichaam onder milde agitatie bij RT.
      4. Na het wassen met PBS, incuberen bij RT voor 120 min met avidin-peroxidase conjugaat (tabel van materialen).
      5. Onthulling met DAB + 0,04% nikkel ammonium.
      6. Monteer de bevlekt delen op gelatine gecoate microscopie dia's en laat ze lucht drogen. Dehydraat in ethanol, diaphanize in xyleen, afwerking met afdekmedium (tabel van de materialen), bedekken met een dekslip, en beeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een kritisch aspect om de kwaliteit en de gezondheid van de gekweekte plakjes te evalueren is de aanwezigheid en typische morfologie van de verwachte neurale celtypen, neuronen en gliacellen. De typische architectuur van de menselijke corticale laminatie werd waargenomen in een segment op DIV4, onthuld door neuronale immunolabeling (Figuur 2D). Daarnaast werd ook de verwachte aanwezigheid van Microglia en astroglia (Figuur 2B, C...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol voor het produceren van vrij zwevende, korte-termijn segment culturen is een alternatieve methode voor het kweken van volwassen menselijke neocorticale schijfjes. Een dergelijk protocol voor segment culturen kan vatbaar zijn voor studies over (maar niet beperkt tot) optogenetica1,44,45, elektrofysiologie2,3,4,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (post-doctoraats Fellowship PNPD/INCT-HSM naar A.F. en pre-Doctoral Fellowship to N.D.M.) en FAEPA. G.M.A. bezit een Master Fellowship van FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. bezit een CNPq Research Fellowship. We danken de patiënten en hun families voor het doneren van de door de weefsels voor dit onderzoek. We willen de steun van bewoners, verpleegkundigen, technici en het CIREP-team erkennen, van het klinisch ziekenhuis van de medische school van Ribeirão Preto, de Universiteit van São Paulo, die in verschillende stadia van het proces heeft geholpen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-PropanolMerck1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solutionSigma AldrichA3449 
AgaroseSigma AldrichA9539
Ammonium persulfateSigmaA3678-25G
Amphotericin BGibco15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit)Santa Cruz Biotecnologysc-154Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse)Santa Cruz Biotecnologysc-7383Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7906
Bradford 1x Dye ReagentBioRad500-0205
EDTASigmaT3924Used in RIPA buffer
GlucoseMerck108337
GlutamaxGibco35050-061
Hank's Balanced SaltsSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
Hydrochloric acidMerck1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2)Vetec194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000Used in RIPA buffer
Neurobasal AGibco10888-022
Non-fat dry milk (Molico)NestléUsed for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2Laborclin590338
Penicilin/StreptomicinSigma AldrichP4333
Potassium ChlorideMerck1049361000
Prime Western Blotting Detection ReagentGERPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)GENA934-1ML
SDSSigmaL5750Used in RIPA buffer
TEMEDGE17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378Used in RIPA buffer
Triton x-100SigmaX100Used in RIPA buffer
Ultrapure WaterMilliporeSterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment en materiaal
24-well platesCorningCL S3526Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) GE29047575
Carbogen MixtureWhite Martins95% O2, 5% CO2
CO2 incubatorNew Brunswick ScientificCO-24Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate ReaderMolecular Devices
MicrotubesGreiner0016081,5mL microtube
Motorized pestleKimble Chase
Plastic spoonSize of a dessert spoon
Razor BladeBicChrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel BladeBecton Dickinson (BD)Number 24Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder)HenkelComposition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome Leica14047235612 - VT1000S
Naam van Materiaal/Equipment voor Immunohistochemie
Antibody anti-NeuN (mouse)Millipore MAB377Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse)MerckMAB360Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit)AbcamEPR16588 - ab178846Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)VectorBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
EthanolMerck1.00983.1000
GelatinSynth00G1002.02.AEUsed for coating slides
MicrotomeLeicaSM2010REquipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)GENA934-1ML
Slides (Star Frost)Knittel GlaserGelatin coated slides
SucroseVetec60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)VectorPK-4000, Kit Standard
XyleneSynth01X1001.01.BJ

Referenties

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20(2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103(2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002(2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Corticale laminatiebiochemische assayscelbiologische assaysimmunohistochemievibratoomsnijdenwaterstofperoxide-challengeMTT-reductieassayERK-fosforylering
Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.