Het doel van deze methode is het genereren van een in vivo model van tumor angiogenese door xenotransplanterende tumorcellen van zoogdieren tot een embryo van zebravis dat fluorescently gelabelde bloedvaten heeft. Door beeldvorming van de xenotransplantaatmodellen is en geassocieerde vaten kan een kwantitatieve meting van de angiogene respons worden verkregen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tumor angiogenese is een belangrijk doelwit van anti-kankertherapie en deze methode is ontwikkeld om een nieuw model te bieden om dit proces in vivo te bestuderen. Een zebravis xenotransplantaatmodellen is wordt gecreëerd door het implanteren van zoogdieren tumorcellen in de perivitelline ruimte van twee dagen-post-bemesting zebravis embryo's, gevolgd door het meten van de mate van de angiogene respons waargenomen bij een experimenteel eindpunt tot twee dagen na implantatie. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om de zebravis host angiogene reactie op het transplantaat nauwkeurig te Kwantificeer. Dit maakt gedetailleerd onderzoek van de moleculaire mechanismen en de bijdrage van gastheer versus tumor aan de angiogene respons mogelijk. De xenografted embryo's kunnen worden onderworpen aan een verscheidenheid aan behandelingen, zoals incubatie met potentiële anti-angiogenese medicijnen, om strategieën voor de remming van de tumor angiogenese te onderzoeken. De angiogene respons kan ook live-imaged zijn om meer dynamische cellulaire processen te onderzoeken. De relatief onveeleisende experimentele techniek, goedkope onderhoudskosten van zebravis en korte experimentele tijdlijn maken dit model vooral nuttig voor de ontwikkeling van strategieën om de tumor angiogenese te manipuleren.
Inleiding
Angiogenese is een van de klassieke kenmerken van kanker en vertegenwoordigt een doelwit van anti-kankertherapie1,2. Om dit proces te bestuderen, xenotransplantaatmodellen is modellen van kanker zijn gemaakt door het implanteren van zoogdier tumorcellen in dieren zoals muizen3. Een zebravis xenotransplantaatmodellen is model is ook ontwikkeld, waarbij de implantatie van tumorcellen in 2 dagen post fertilisatie (dpi) zebravis die resulteert in een snelle groei van zebravis bloedvaten in de xenotransplantaatmodellen is4.
Dit protocol bes....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van micro injectienaalden
- Zet een micro pipet-trekker aan en stel de volgende parameters in (gekalibreerd voor het in de materiaallijst vermelde micropipet trekker-model): warmte, 680; Pull, 75; Velocity, 40; Tijd, 55; Druk: 530.
- Zet een borosilicaatglas capillair in de pipet-trekker en trek het capillair aan om twee naalden te maken. Herhaal dit voor zo veel naalden als gewenst.
2. celkweek voor implantatie
Opmerking: Bij het gebruik van dit protocol kan elke zoogdier kanker cellijn worden gebruikt voor implantatie in zebravis embryo's als xe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Door beeldvorming van een individuele xenotransplantaatmodellen is op 6, 24 en 48 HPI, kan de angiogene respons op verschillende tijdstippen worden berekend zoals weergegeven in Figuur 1a-C. De grootste angiogene respons wordt waargenomen tussen 24-48 h post implantatie, met de maximale niveaus van transplantaat vascularisatie gezien rond 2 dpi (Figuur 1a-C). Een time-lapse-film van een typische .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De eerste kritieke stap in het protocol is de implantatie van tumorcellen. Het is essentieel dat cellen worden geïnjecteerd in een locatie die de xenotransplantaatmodellen is in staat stelt om met succes in het embryo te implanteren zonder het embryo edematous te maken. Een te anterieure injectie kan de cellen in de richting van het hart laten bewegen, de bloedbaan blokkeren en tot oedeem leiden, terwijl een injectie die te posterieure is, een slecht geïmplanteerde xenograft zal veroorzaken. Een voorste injectie wordt he.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken de heer alhad mahagaonkar voor het beheer van de Universiteit van Auckland zebravis Facility en de biomedische beeldvormings onderzoekseenheid, school voor medische wetenschappen, Universiteit van Auckland, voor hulp bij time-lapse confocale microscopie. Dit werk werd gesteund door een Health Research Council van Nieuw-Zeeland project Grant (14/105), een Royal Society of Nieuw-Zeelandse Marsden Fonds project Grant (UOA1602) en een Auckland Medical Research Foundation project Grant (1116012) toegekend aan J.W.A.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Luchtcilinder | BOC | 011G | Xenotransplantatie |
| B16-F1 cellen | ATCC | Celcultuur | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellulair matrix mengsel) | Corning | 356235 | Xenotransplantatie |
| Borosillicaat glazen capillairen | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1,00 mm, ID = 0,78 mm, Lengte = 10 cm Celinjectie |
| Celcultuur schaal 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Vishouderij |
| Celcultuur schaal 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Vishouderij |
| Celcultuur fles 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Celcultuur |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cellabeling, Stock concentratie (10 mM in DMSO), werkconcentratie (0,2 μM in serumvrij media) |
| Dimethyl sulfaat | Sigma-Aldrich | D8418 | Drugbehandeling, Cellabeling |
| E3 Media (60x in 2 L water) 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2·2H2O 9,78 g MgCl2·6H2O pas aan naar pH 7,2 met NaOH | In house [1] | Vishouderij | |
| Ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantatie, Beeldvorming |
| Filtertip 1.000 μL | VWR | 732-1491 | Gebruikt tijdens meerdere stappen |
| Filtertip 200 μL | VWR | 732-1489 | Gebruikt tijdens meerdere stappen |
| Filtertip 10 μL | VWR | 732-1487 | Gebruikt tijdens meerdere stappen |
| Fluorescentiemicroscoop | Leica | MZ16FA | Bereiding van embryo's |
| FBS (NZ oorsprong) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Celcultuur |
| Handschoenen | Elk commercieel merk | Gebruikt tijdens meerdere stappen | |
| Haemocytometer celtellingskamer Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantatie |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Celcultuur, Cellabeling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cellabeling, Stock concentratie (1 mg/ml in DMSO), werkconcentratie (6 μg/ml in serumvrij media) |
| Laag smeltpunt, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Beeldvorming |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantatie |
| Methyleenblauw | sigma-Aldrich | M9140 | Vishouderij |
| Microloader 0,5-20 μL pipettetip voor het laden van microcapillairen | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantatie |
| Micropipetten | Elk commercieel merk | Gebruikt tijdens meerdere stappen | |
| Micropipet puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantatie | |
| Microscoop kooi incubator | Okolab | Time-lapse beeldvorming | |
| Microgolfoven | Elk commercieel merk | Beeldvorming | |
| Mineraal olie | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantatie |
| Minimal Essential Media (MEM) - alfa | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cel Cultuur |
| MPPI-2 Druk Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantatie | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantatie | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Beeldvorming | |
| N-Fenylthioureum (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Vishouderij |
| PBS | Gibco | 10010023 | Celcultuur |
| Penicilline Streptomycine | Life Technologies | 15140122 | Celcultuur |
| S1 pipetvuller | Thermoscientific | 9501 | Celcultuur |
| Serologische stripette 10 mL | Corning | 4488 | Celcultuur |
| Serologische stripette 25 mL | Corning | 4489 | Celcultuur |
| Serologische stripette 5 mL | Corning | 4485 | Celcultuur |
| Serologische stripette 2 mL | Corning | 4486 | Celcultuur |
| Terumo Naald 22 G | Amtech | SH 182 | Vishouderij |
| Weefselcultuur incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Celcultuur |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drugbehandeling | |
| Transfer pipet 3 mL | Mediray | RL200C | Vishouderij |
| Trypsin/EDTA (0,25%) | Life Technologies | T4049 | Celcultuur |
| Pincet | Fine Science Tools | 11295-10 | Vishouderij |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Beeldanalyse |
Referenties
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Rese....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
