We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Primaire volwassen fibroblasten zijn uitgegroeid tot een belangrijk instrument om fibrose te bestuderen, fibroblast interacties en ontsteking in alle lichaamsweefsels. Omdat primaire fibroblasten niet voor onbepaalde tijd kunnen delen door myofibroblast-differentiatie of senescentie-inductie, moeten er regelmatig nieuwe culturen worden vastgesteld. Echter, er zijn verschillende obstakels te overwinnen tijdens de processen van de ontwikkeling van een betrouwbare isolatie protocol en primaire fibroblast isolatie zelf: de moeilijkheidsgraad van de methode (vooral voor beginners), het risico van bacteriële besmetting, de vereiste tijd tot primaire fibroblasten kunnen worden gebruikt voor experimenten, en de daaropvolgende celkwaliteit en levensvatbaarheid. In deze studie, een snelle, betrouwbare en gemakkelijk te leren protocol om primaire volwassen fibroblasten te isoleren en te cultuur van muis hart, longen, lever en nieren combineren enzymatische spijsvertering en ultrasone agitatie is voorzien.
Inleiding
Fibroblasten zijn vlakke, spindle-vormige cellen met meerdere ecoagriturismo late processen en een uitgebreid ruw endoplasmisch reticulum1,2. Een gemiddelde fibroblast meet 30-100 μm en heeft een levensduur van 57 ± 3 dagen1,3. De gemiddelde celcyclus duur van menselijke fibroblasten varieert van 16-48 h, afhankelijk van de cultuuromstandigheden4. Er zijn aanwijzingen dat de replicatieve capaciteit en de functionele kwaliteit van gekweekte primaire fibroblasten negatief correleerden met de leeftijd van de donor, wat suggereert dat jongere donoren (dieren of patiënten) de voorkeur moeten krijgen indien mogelijk5,6 .
Fibroblasten vormen een overheersend celtype van de meeste lichaamsweefsels van zoogdieren. Ondanks hun alomtegenwoordige aanwezigheid is de moleculaire identificatie van fibroblasten nog steeds een uitdaging7. Fibroblasten migreren naar de ontwikkeling van weefsels en organen uit verschillende bronnen tijdens de embryonale ontwikkeling8. Om deze reden is er een overvloed aan marker eiwitten die kan worden gevonden in fibroblasten, terwijl unieke marker eiwitten, die aanwezig zijn in elke fibroblast populatie en exclusief voor fibroblasten, nog steeds ontbreken. Zo worden expressie patronen van verschillende herkende markers meestal gebruikt om fibroblasten te identificeren. Onder de meest erkende markers zijn vimentin, menselijk fibroblast oppervlak eiwit (hFSP), discoidin domein receptor 2 (DDR2) en alpha glad spier actine (αsma).
Fibroblasten zijn de belangrijkste extracellulaire matrix (ECM)-producerende celtype. Daardoor behouden fibroblasten een geordende weefsel architectuur en bieden ze mechanische ondersteuning voor naburige cellen1. De balans tussen ECM-synthese en afbraak is een goed gereguleerd proces. Verschuivingen in de richting van synthese markeren het begin van overmatige ECM-depositie die, indien niet beëindigd, leidt tot fibrose. Fibrose wordt gemedieerd door myofibroblasten, die afkomstig zijn van geactiveerde fibroblasten die moleculaire en fenotypische veranderingen ondergaan. Een kenmerk van myofibroblasten is verbeterde secretie van ECM en cytokinen en de uitdrukking van ordelijke gearrangeerde αSMA Microfilamenten9.
Primaire fibroblasten zijn in de schijnwerpers van recent onderzoek gericht op fibrose, weefsel ontsteking en fibroblast-kanker-celinteracties10,11. Echter, om effectief te bestuderen fibroblast eigenschappen in gezondheid en ziekte, het is noodzakelijk om te isoleren van levensvatbare primaire volwassen fibroblasten op een regelmatige basis. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van fibroblasten12,13,14. De drie belangrijkste methoden van fibroblast isolatie zijn uitgroei uit weefsel chunks12, enzymatische weefsel spijsvertering15, en enzymatische perfusie van holleorganen 9,13,16. Het voordeel van uitgroei is een zacht isolatie proces zonder enzymatische celdegradatie. Aan de andere kant vereisen de groei culturen meestal langdurige cultuur perioden totdat cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten. Veelvoorkomende enzymatische spijsvertering is snel, maar draagt een risico van besmetting met andere celtypen (bijv. endotheel cellen) of bacteriën in het roer proces, die nodig zijn om het weefsel mechanisch te ontbinden. Bovendien, deze methoden zijn vaak uitgebreid en vereisen tijd en vaardigheid om te leren.
Wat betreft het belang van primaire fibroblasten in het onderzoek, is er nog steeds behoefte aan het optimaliseren van bestaande celisolatiebenaderingen in termen van snelheid, eenvoud en betrouwbaarheid. Hier wordt een nieuwe Ultrasone-gebaseerde enzymatische fibroblast-isolatiemethode geleverd die hoge kwaliteit cellen levert.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het volgende protocol volgt de richtlijnen voor de institutionele dierenverzorging van de Technische Universität Dresden, Duitsland (dossiernummer: T 2014/4) en internationaal aanvaarde richtlijnen inzake dierenverzorging (FELASA)17. Figuur 1 visualiseert het celisolatieproces.
1. voorbereiden van de installatie, materiaal en media
- Bereid celkweekmedium, PBS-oplossing, Collagenase Blend Stock Solution (reconstitueer 50 mg gelyofiliseerd Collagenase mengsel in 12 mL steriel ultrapuur water), en 0,25% trypsine oplossing.
- Verwarm het medium, de PBS en de trypsine-oplossing tot 37 °C.
- Verwarm het ultrasone waterbad voor op 37 °C.
- Desinfecteer de Tang, een spatel van roestvrijstaal, Scalpels (2x scalpels per orgel) en 2 glazen bekers met 70% ethanol en plaats deze materialen onder de celcultuurkap.
- Vul één bekerglas met 70% ethanol en de andere met steriel water of PBS-oplossing. Deze bekers zijn nodig om het instrument te ontsmetten en te wassen na elke orgaanprocessie.
- Plaats steriele 15 mL plastic buizen met koude PBS op nat ijs. Het aantal buisjes is afhankelijk van het aantal organen waarvan u de fibroblasten wilt isoleren.
2. muis dissectie en orgaanverwijdering
- Draag twee paar handschoenen boven elkaar, zodat het eerste paar kan worden verwijderd zodra het dier is ontleed.
Opmerking: deze procedure voorkomt dat bacteriën uit de vacht en de huid van het dier zich over de organen verspreiden. - Euthaniseer de muis (bijv. cervicale dislocatie) en speld het karkas met naalden aan elke ledemaat tot een piepschuim pad.
- Desinfecteer het karkas van de muis met behulp van 70% ethanol spray. Zorg ervoor dat de vacht wordt geweekt in ethanol zodat het haar niet zal opzwenken.
- Snijd de vacht recht boven het urogenitale tractus met behulp van chirurgische Tang en atraumatische schaar. Snijd de huid langs de middelste lijn vanaf het punt van de initiële incisie naar de nek (3-4 cm) en voeg reliëf sneden toe aan de ledematen.
Let op: de gespierde laag niet perforeren bij deze stap om bacteriële besmetting te voorkomen! - Speld de huid aan het piepschuim pad om een optimale toegang tot de spier massa die de buikholte bedekt.
- Desinfecteer de buikspieren tweemaal met 70% ethanol. Laat de ethanol drogen voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Verwijder het eerste paar handschoenen. Gebruik een nieuwe, steriele set Tang en schaar.
- Open de buikholte en de thorax door gebeuren van de gespierde laag met chirurgische schaar om voorzichtig te verwijderen van de organen van de keuze. Houd daarom het orgel zachtjes vast met een chirurgische Tang (niet doorboren van het orgel, gebruik minimale druk) en snijd de leverende bloedvaten bij het ingangspunt op het orgel met een schaar.
- Leg de organen in de steriele buisjes die koude PBS bevatten. Sluit de buizen strak. Plaats de buisjes op nat ijs totdat u doorgaat met stap 3,1.
3. weefsel gehakt, spijsvertering en celextractie
- Breng de buisjes onder de steriele celcultuurkap over.
VOORZICHTIG: Draag een nieuw paar handschoenen en Desinfecteer de buizen met 70% ethanol voordat u ze onder de motorkap overbrengt! - Neem het orgel uit de 15 mL buis met behulp van steriele Tang. Plaats het orgel op de helft van een steriele 6 cm Petri schaal en was het orgel kort met PBS om overtollig bloed te verwijderen. Breng het orgel over naar de tweede helft van de Petri schaal, Verwijder overtollige PBS.
- Het weefsel met behulp van twee steriele scalpels gehakt. De overblijvende weefsel fragmenten mogen niet groter zijn dan 1-2 mm.
- Breng het fijngehakte weefsel in een nieuwe steriele 15 mL buis met behulp van de steriele spatel en voeg 2 mL 0,25% trypsine oplossing toe. Plaats de buis in een cel cultuur incubator bij 37 °C gedurende 5 minuten.
- Vortex de buis zachtjes (circa 1400/min) voor 10 s.
- Stop de trypsine-reactie onder de celcultuurkap door toevoeging van 4 mL FCS-bevattende celkweekmedium (Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium (DMEM), bijv.).
- Voeg 250 μL Collagenase-Meng oplossing toe aan elke buis met hart-of longweefsel en 100 μL voor nier-of lever, respectievelijk.
- Plaats de buizen in een ultrasoon waterbad (37 °C) en activeer de ultrasone sonicator gedurende 10 minuten.
Opmerking: het ultrasone waterbad dat in dit protocol wordt gebruikt, heeft een bedrijfsfrequentie van 35 kHz en een maximaal vermogen van 320 W. - Vortex de buizen zachtjes (circa 1400/min) gedurende 10 sec.
- Plaats de buizen opnieuw in het ultrasone waterbad gedurende 10 minuten.
- Vortex zachtjes (circa 1400/min) voor 10 sec.
- Desinfecteer de buisjes met 70% ethanol en breng ze over in de steriele celkweek.
- Filter de oplossing met een 40 μm gaas in een nieuwe steriele 15 mL buis.
- Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder de supernatant en rebreng de pellet in 1 mL vers medium.
- Breng de cellen in een geschikt celcultuurvat (bijv. 6-goed plaat) en plaats het vat in de celkweek incubator 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
- De volgende dag, verwijder het medium, was 3 keer met PBS en voeg vervolgens vers medium toe (het toegevoegde volume is afhankelijk van het celkweek vaartuig naar keuze, 2 mL per put van een 6-well plaat enz.).
- Verander het medium om de andere dag.
Opmerking: fibroblasten kunnen worden gesplitst na het bereiken van optische samenvloeiing van 90% (meestal na 5-7 dagen).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het vermogen van dit protocol om volwassen fibroblasten uit massief muriene weefsel te isoleren werd aangetoond. Levensvatbare fibroblasten werden verkregen die kunnen worden gebruikt voor latere experimenten zoals immunofluorescentie kleuring of proliferatie experimenten (Figuur 2D-F, Figuur 5A).
Volwassen fibroblasten zijn platte spindel vormige cellen met meerdere cellulaire processen die meestal g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In vergelijking met vereeuwigd fibroblast cellijnen bieden primaire fibroblasten verschillende voordelen. Ze kunnen worden geïsoleerd kosteneffectief in hoge kwaliteit en kwantiteit. Bovendien bieden primaire culturen de mogelijkheid om cellen van meerdere individuen te bestuderen, wat de betrouwbaarheid van de verkregen resultaten verhoogt en de kans verkleint dat alleen celcultuurartefacten worden bestudeerd. Continue generatie van nieuwe primaire culturen voorkomt genetische veranderingen die vaak optreden na herhaald...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen belangenconflicten om te verklaren.
Dankbetuigingen
Wij danken mevrouw Romy Kempe en Mrs. Annett Opitz voor deskundige technische ondersteuning. Wij danken ook de heer Bjoern Binnewerg voor haar steun. Dit werk werd gesteund door subsidies van a) de Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Faculteit Geneeskunde Carl Gustav Carus Dresden en c) else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) faculteit geneeskunde Carl Gustav Carus Dresden. Wij zijn dankbaar voor de financiering en de steun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10.000 U/mL) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | afhankelijk van het vat | 6-, 12-, 24-wells Nunclon-oppervlak |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Duitsland | 20727400 | BVC professionele zuiging |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Duitsland | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | afhankelijk van volume | SafeSeal tips voor pipetten (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | afhankelijk van volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.v.t. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | Hoge glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Duitsland | afhankelijk van volume | 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Duitsland | n.v.t. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlijn, Duitsland | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Duitsland | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Duitsland | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Duitsland | BD577 |
Referenties
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098(2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
