Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm

Summary

In dit artikel wordt in detail een systematische aanpak uitgelegd om de beschikbaarheid van micromineralen in Atlantische zalm te beoordelen. De methodologie omvat instrumenten en modellen met toenemende biologische complexiteit: (1) chemische soortanalyse, (2) in vitro oplosbaarheid, (3) opnamestudies in cellijnen en (4) in vivo visstudies.

Abstract

Het beoordelen van de beschikbaarheid van micromineralen in de voeding is een grote uitdaging in de minerale voeding van vissoorten. Dit artikel beoogt een systematische aanpak te beschrijven die verschillende methodologieën combineert om de beschikbaarheid van zink (Zn) in Atlantische zalm(Salmo salar)te beoordelen. Gezien het feit dat verschillende chemische Zn-soorten aanwezig kunnen zijn in een Atlantisch zalmvoer, werd verondersteld dat de beschikbaarheid van Zn wordt beïnvloed door de chemische Zn-soorten die in het voer aanwezig zijn. In deze studie gaat het eerste protocol dus over hoe de verschillende chemische Zn-soorten uit het voer kunnen worden geëxtrahuteerd en geanalyseerd door een grootte-uitsluiting chromatografie-inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (SEC-ICP-MS) -methode. Vervolgens werd een in vitro methode ontwikkeld om de oplosbaarheid van Zn in de voeding in Atlantische zalmvoeders te evalueren. Het derde protocol beschrijft de methode om de impact van het veranderen van de samenstelling van Zn chemische soorten op de opname van Zn in een visinaal epitheelmodel te bestuderen met behulp van een regenboogforel darmcellijn (RTgutGC). Samen werden de bevindingen van de in vitro methoden vergeleken met een in vivo studie naar de schijnbare beschikbaarheid van anorganische en organische bronnen van Zn aangevuld met Atlantische zalmvoeders. De resultaten toonden aan dat verschillende chemische soorten Zn in voeders kunnen worden gevonden en dat de efficiëntie van een organische Zn-bron sterk afhangt van het aminozuur ligand dat wordt gebruikt om Zn te cheleren. De bevindingen van de in vitro methoden hadden minder correlatie met die uitkomst van de in vivo studie. Niettemin leverden in vitro protocollen die in dit artikel worden beschreven cruciale informatie op over de beschikbaarheid van Zn en de beoordeling ervan in visvoeders.

Introduction

Vismeel en visolie werden traditioneel gebruikt in Atlantisch zalmvoer. Deze ingrediënten worden echter steeds vaker vervangen door plantaardige ingrediënten¹. De bovengenoemde verschuiving in de samenstelling van het voer heeft geleid tot een lage beschikbaarheid via de voeding en een toegenomen behoefte aan verbetering van de beschikbaarheid van mineralen in Atlantische zalmvoeders, met name zink (Zn)². De verminderde beschikbaarheid kan het gevolg zijn van een verandering in het Zn-gehalte, de chemische Zn-soort en/of antinutritionele factoren die aanwezig zijn in de voedermatrix. In dit scenario is een nieuwe reeks additieven ontstaan die algemeen als 'organische bronnen' worden beschouwd, met het potentieel om een beter beschikbare bron van voedingsmineralen voor vissen te zijn. Daarom is het belangrijk om de fundamentele chemie en fysiologie te begrijpen die de beschikbaarheid van mineralen en hun bronnen voor vissen regelen. Zink is een essentieel sporenelement voor alle levende organismen³. De rol van Zn als signaalmolecuul is beschreven op zowel paracellulair als intracellulair niveau in vissen⁴. Bij Atlantische zalm is Zn-deficiëntie in verband gebracht met skeletafwijkingen en verminderde activiteit van verschillende Zn-metallo-enzymen^5,6.

Deze studie beschrijft een systematische benadering om de beschikbaarheid van Zn te begrijpen door het te categoriseren in vier verschillende compartimenten van gevarieerde chemische en biologische complexiteit. De betrokken methoden worden beschreven in vier secties, zoals te zien is in figuur 1:(1) evaluatie van Zn chemische soorten in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer met behulp van een grootte-uitsluiting chromatografie-inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (SEC-ICP-MS) methode⁷; 2) in vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer; (3) evaluatie van de opname van Zn-chemische soorten door middel van een in vitro darmmodel (RTgutGC)⁸; en (4) kennelijke beschikbaarheid van Zn in Atlantische zalm (Salmo salar)⁹. Soortgelijke protocollen kunnen worden ontwikkeld voor andere mineralen (bijv. Mangaan, selenium, koper) die van nutritioneel belang zijn voor aquacultuurvissoorten.

Protocol

De voedingsproef in sectie 4 werd uitgevoerd volgens de Noorse (FOR-2015-06 - 18-761) en Europese wetgeving (Richtlijn 2010/63/EU).

1. Evaluatie van chemische Zn-soorten in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer met behulp van een SEC-ICP-MS-methode

1. Extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5)
   1. Bereid de extractiebuffer voor door een geschikte hoeveelheid tris(hydroxymethyl)aminomethaan op te lossen om de gewenste ionische sterkte (100 mM) te bereiken in ultrapeur H₂O.
   2. Stel de pH van de oplossing in op pH 8,5 met de HCl-oplossing en controleer de pH-verandering met een pH-meter.
2. Voorbereiding van voedermonsters
   OPMERKING: Het gebruikte voedermonster is geformuleerd op basis van commercieel voer voor Atlantische zalm, dat eiwitbronnen bevat die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% viseiwit, 10% visolie, 68% plantaardig eiwit en 12% plantaardige olie). Zinksulfaat werd aangevuld met het voer.
   1. Maal het voermonster met de hand met behulp van een stamper en een vijzel.
   2. Zeef het voedingsmonster om ervoor te zorgen dat de extractie wordt uitgevoerd in een voedingsfractie met een vergelijkbare deeltjesgrootte (van 850 μm tot 1,12 mm).
   3. Ga verder met het uitvoeren van de Zn-extractie.
3. Zinkextractie uit een voedermonster
   1. Weeg ongeveer 0,5 g voer in drievoud af in conische buisjes van 15 ml.
   2. Voeg de extractiebuffer (5 ml van 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) toe aan de monsters.
   3. Pak de monsters in een rotator (20 rpm) bij 4 °C gedurende 24 uur.
   4. Scheid de oplosbare en niet-oplosbare fracties door centrifugering gedurende 10 minuten bij 3000 x g.
   5. Gebruik een wegwerpspuitfilter van 0,45 μm om de oplosbare fractie te filteren.
   6. Breng de gefilterde monsters over naar schone buizen.
   7. Voer de Zn-speciatieanalyse uit in de oplosbare fracties met SEC-ICP-MS, zoals beschreven in stap 1.6.
      OPMERKING: Een samenvatting van de procedure voor Zn-extractie uit een voedermonster wordt beschreven in figuur 2.
4. Mobiele fase oplossing (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5)
   1. Bereid de mobiele faseoplossing voor het oplossen van 6,057 g tris(hydroxymethyl)aminomethaan in 1 l 3% MeOH-oplossing (v/v).
   2. Stel de pH van de oplossing in op 7,5 met de HCl-oplossing en controleer de pH-verandering met een pH-meter.
   3. Filter de mobiele fase-oplossing door een membraanfilter van 0,45 μm.
5. Moleculaire gewichtskalibratie van het SEC-kolomscheidingsbereik
   1. Kalibreer het scheidingsbereik door een kalibratie van het molecuulgewicht uit te voeren.
      OPMERKING: In deze studie werden thyroglobuline (660 kDa), Zn/Cu superoxide dismutase (32 kDa), myoglobine (17 kDa) en vitamine B12 (1,36 kDa) gebruikt.
   2. Bereid elk van de normen voor met een bekende concentratie in ultrapijn H₂O.
   3. Bereid een hplc-injectieflacon (high-performance liquid chromatography) voor door 250 μl standaard aan een injectieflacon toe te voegen.
   4. Laad de injectieflacons met standaarden op de volgorde van de monsters.
   5. Voer de molecuulgewichtkalibratie uit aan het begin en aan het einde van de analytische sequentie en controleer ¹²⁷I (thyroglobuline), ⁶⁶Zn (Zn / Cu superoxide dismutase), ⁵⁷Fe (myoglobine) en ⁵⁹Co (vitamine B12).
      OPMERKING: De kalibratie van het molecuulgewicht wordt gelijktijdig uitgevoerd met de Zn-speciatieanalyse.
6. Zinkspeciatie analyse met SEC-ICP-MS
   OPMERKING: De Zn-soortanalyse volgens de SEC-ICP-MS-methode is ontwikkeld op basis van elders beschreven principes^10,11 en verdere optimalisatie is uitgevoerd voor de analyse van een Atlantisch zalmvoer⁷.
   1. Voer de Zn-speciatieanalyse uit op de oplosbare fracties met behulp van een kolom met grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en een HPLC in combinatie met inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (ICP-MS).
   2. Bereid een HPLC-injectieflacon door 250 μL oplosbare fractie aan een injectieflacon toe te voegen.
   3. Voor de analyse, spike alle monsters met 0,5 μL vitamine B12. Deze stap maakt het mogelijk om te corrigeren voor retentietijden verschuivingen, monitoring ⁵⁹Co.
   4. Verdun de oplosbare fractie met extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) en pas aan tot een eindvolume van 1 ml.
   5. Bereid de volgorde van de monsters in willekeurige volgorde voor.
   6. Stem de ICP-MS af volgens de instructies van de fabrikant.
   7. Volg de instrumentinstellingen voor de HPLC en ICP-MS die de Zn-speciatieanalyse uitvoeren (zie tabel 1).

2. In vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer

OPMERKING: Het gebruikte voedermonster is geformuleerd op basis van commercieel voer voor Atlantische zalm, dat eiwitbronnen bevat die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% vismeel, 10% visolie, 68% plantaardige ingrediënten en 12% plantaardige olie).

1. Maal de Atlantische zalmvoermonsters gedurende 10 s bij 3000 tpm met behulp van een messenmolen en bewaar bij 4 °C tot verdere analyse.
2. Weeg ~0,2 g van de in stap 2.1 gemalen voedingsmonsters en voeg Zn radiotracer⁽⁶⁵Zn) van bekende specifieke activiteit toe in een monsterbuis met een volume van 5 ml (met een dop).
   LET OP: Deze procedure moet worden uitgevoerd in een radionuclidesuite. De persoon die deze stap uitvoert, moet worden getraind en gecertificeerd om radio-isotopen te verwerken. De veiligheids- en voorzorgsmaatregelen die door de stralingsveiligheidsadministratie van het instituut worden geadviseerd, moeten strikt worden gevolgd.
3. Bereid vervolgens de zoetwater intestinale luminale bufferoplossing zoals hieronder beschreven.
   1. Weeg voor zoutoplossing A 11,65 g NaNO_3,0,55 g KNO₃ en 0,4 g MgSO₄af. Los de zouten op in ultrapaat H₂O en pas aan tot een eindvolume van 60 ml.
   2. Weeg voor zoutoplossing B 0,31 g Ca(NO₃)₂· ₄ H₂O. Los de zouten op in ultrapaat H₂O en stel het in op een eindvolume van 10 ml.
   3. Gebruik 500 mM HEPES stockoplossing als zoutoplossing C.
   4. Weeg voor zoutoplossing D 1,2 g MgCl₂af, los het zout op in ultrapure H₂O en pas het aan tot een eindvolume van 20 ml.
   5. Voor zoutoplossing E weegt u 0,9 g MgSO_4,lost u het zout op in ultrapruim h₂O en past u het aan tot een eindvolume van 20 ml.
   6. Bereid pyruvaatoplossing door 0,55 g CH₃COCOONa op te lossen in 10 ml ultrapaat H₂O.
   7. Los 0,9 g galactose (C₆H₁₂O₆) op in ultrapeur H₂O.
   8. Los goed op met behulp van een magneetroerder en steriliseer zoutoplossingen A, B, D en E door autoclaveren, en oplossing C, pyruvaat en galactose door filtratie door een spuitfilter van 200 μm.
   9. Na bereiding van de verschillende stamoplossingen, om 100 ml werkoplossing van de buffer te bereiden, mengt u de bovengenoemde bereide oplossingen in de volgende verhouding: 6,8 ml zoutoplossing A, 4,14 ml B, 5 ml C, 2,5 ml D, 1,5 ml E en 1,14 ml pyruvaat en galactose. Maak het volume aan tot 100 ml met gedeioniseerd water.
      OPMERKING: De bovenstaande buffer vertegenwoordigt nu de ionische samenstelling van het darmlumen dat wordt aangetroffen in zoetwaterzalmen.
4. Bereid zes andere aliquots van de buffer beschreven in stap 2.6 en voeg een van de volgende aminozuren (cysteïne, methionine, glycine, histidine, lysine en arginine) toe om een uiteindelijke molaire concentratie van 5 mM te bereiken.
5. Voeg de luminale buffer van de zoetwateringinlaat (reactievolume = 3 ml; pH 7,4) toe aan het voedingsmonster.
6. Herhaal stap 2.5 met de in 2.4 beschreven buffers (in aanwezigheid van verschillende aminozuren bij een concentratie van 5 mM).
7. Sluit de buizen en laat ze 30 minuten bij 25 tpm in een roterende spinner draaien.
8. Scheid de oplosbare en niet-oplosbare fracties door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 1157 x g.
9. Gebruik een gammateller om de tellingen per minuut (cpm) van ^{65 Zn}in de oplosbare en niet-oplosbare fracties te meten.
10. Bereken het aandeel van de radio-isotopen van Zn (⁶⁵Zn) aanwezig in de oplosbare en niet-oplosbare fracties.

3. Evaluatie van de opname van chemische Zn-soorten met behulp van een in vitro darmmodel (RTgutGC)

1. RTgutGC-cellenkweek
   OPMERKING: Alle werkmaterialen die in deze stap worden gebruikt, moeten steriel zijn.
   1. Laat de bevroren RTgutGC-cellen voorzichtig herleven in een waterbad op 20 °C.
   2. Pipetteer voorzichtig de oplossing die de cellen bevat en suspenseer ze in 10 ml L15-medium met 10% foetaal runderserum (FBS).
      OPMERKING: 10% FBS wordt alleen gebruikt voor het doen herleven van de bevroren cellen. Voor de volgende passage wordt FBS gebruikt bij 5%. De samenstelling van FBS kan variëren tussen batches, dus het is raadzaam om zoveel te kopen en op voorraad te hebben als nodig is van een enkele batch om inter-batch variaties in de serumsamenstelling te voorkomen.
   3. Voeg de celsuspensie toe aan 75 cm² celkweekkolven en incubeer in een incubator bij 19 °C onder normale atmosfeer.
   4. Controleer de cellen en wanneer confluent (80% confluentie, visueel beoordelen door de dichtheid van het celoppervlak onder een microscoop te onderzoeken), splits de cellen in nieuwe kolven (daaropvolgende passage) of oogst om te gebruiken in experimenten.
      OPMERKING: Een voorbeeld van de RTgutGC-cellen 1 uur en 1 week na het zaaien in de celkweekkolven is weergegeven in figuur 3.
2. Celoogst en voorbereiding op blootstellingsexperimenten
   1. Was de cellen tweemaal met 1 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing. Na elke wasbeurt hevelt u de EDTA-oplossing uit met behulp van een steriele zuigbuis.
   2. Behandel de cellen met trypsine (0,7 ml trypsine, in 0,25% in fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS]).
   3. Draai de kolf voorzichtig onder scherpe hoeken om de trypsine over het oppervlak van de kolf te verspreiden.
   4. Blijf 2 minuten draaien, terwijl de cellen loskomen.
   5. Voeg na een voorzichtige draaiing gedurende 2 minuten 10 ml L15/FBS-medium toe om trypsine te neutraliseren.
   6. Decanteer de resulterende celsuspensie in een conische bodemcentrifugebuis met behulp van een steriele pipet en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 130 x g.
   7. Bepaal de dichtheid van de geoogste cellen door handmatig te tellen met behulp van hemocytometer.
   8. Voeg het vereiste volume L15/FBS-medium toe om een celdichtheid van 5 x 10⁴ cellen/ml te bereiken.
   9. Zaai de cellen op 24-well platen door 1 ml celsuspensie per put te pipetteren om de uiteindelijke celdichtheid van 5 x 10⁴ cellen / put te bereiken.
      OPMERKING: Gebruik bij voorkeur pipetten met meerdere doseerdoseringen om variatie te minimaliseren en de tijd te verkorten.
   10. Plaats de gezaaide platen in een incubator onder normale atmosfeer bij 19 °C gedurende 48 uur voorafgaand aan de experimenten.
       OPMERKING: Trypsine te bewaar bij -20 °C; EDTA-oplossing en L15/FBS-media bij 4 °C. Stel de temperatuur van alle werkoplossingen en media vlak voor gebruik in op 19 °C.
3. Voorbereiding van blootstellingsmedia
   OPMERKING: Deze stap moet onder de zuurkast worden uitgevoerd onder aseptische en steriele omstandigheden.
   1. Bereid L15/ex door 6,8 ml zoutoplossing A (stap 2.3.1), 1,14 ml B (stap 2.3.2), 5 ml C (stap 2.3.3) en 1,14 ml pyruvaat (stap 2.3.6) en galactose (stap 2.3.7) te mengen. Maak het volume aan tot 100 ml met gedestilleerd water van steriele celkweekkwaliteit.
   2. Bereid FW door 6,8 ml zoutoplossing A (2.3.1), 4,14 ml B (2.3.2), 5 ml C (2.3.3), 2,5 ml D (2.3.4), 1,5 ml E (2.3.5) en 1,14 ml pyruvaat (2.3.6) en galactose (2.3.7) te mengen. Maak het volume aan tot 100 ml met steriel gedestilleerd water van celkweekkwaliteit.
   3. Kwantificeer de concentraties van ionen in de blootstellingsmedia met behulp van ICP-MS zoals elders beschreven¹².
      OPMERKING: Ionische concentraties geanalyseerd in de mediapreparaten zijn weergegeven in tabel 2.
4. Zink (⁶⁵Zn) instroom assays
   1. Zaai de RTgutGC-cellen op 24-well platen (5 x 10⁴ cellen/put) in volledig L15/FBS medium.
   2. Incubeer gedurende 48 uur in een incubator met een normale atmosfeer bij 19 °C.
   3. Pas alle experimentele mediapreparaten aan op pH 7,4 met behulp van 0,5 M NaOH in de aan- of afwezigheid van L-methionine (L-Met) of DL-methionine (DL-Met) bij een concentratie van 2 mM.
      OPMERKING: De pH-aanpassing van de in punt 3.4.3 beschreven buffers moet opnieuw worden uitgevoerd voordat de cellen in stap 3.4.5 worden behandeld.
   4. Verwijder na het voltooien van de incubatietijd het medium uit de putten en spoel grondig met PBS.
   5. Voeg de pH-aangepaste FW experimentele media toe en laat 20 minuten acclimatiseren.
   6. Stel de RTgutGC-cellen bloot aan nominale concentraties van 3,07, 6,14, 12,27 en 24,55 μM ⁶⁵Zn(II) (als ZnCl₂; ~4 kBq/ml) in de in stap 3.4.3 beschreven media.
   7. Houd de cellen onmiddellijk daarna gedurende 15 minuten in de couveuse bij 19 °C.
   8. Nadat de incubatie van 15 minuten voorbij is, aspirateer je het cultuursupernatant en verwijder je het uit de put.
   9. Spoel de cellen met ijskoud FW-medium (met 200 μM Zn, pH 7,4) en blus vervolgens door de buffer van 5 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA) (pH 7,4) gedurende 5 minuten toe te voegen om zich te ontdoen van geadsorbeerde ⁶⁵Zn(II).
   10. Stel de cellen bloot aan de bovenstaande mediapreparaten in de aan- of afwezigheid van 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] heptaan-2-carbonzuur (BCH), een aminozuurtransportremmer.
   11. Herhaal na de blootstellingsperiode van 15 minuten stap 3.4.8 en 3.4.9.
   12. De RtgutGC-cellen worden als monolaag aan de onderkant van de putten gehecht. Verteer de cellen met behulp van 0,2% heet natriumdodecylsulfaat (SDS) reinigingsmiddel (100 μL / put).
       OPMERKING: De SDS-oplossing moet vóór gebruik gedurende 1 uur in een waterbad van 90 °C worden geplaatst.
   13. Adem het cel digestaat op en herstel het in een buis van 1,5 ml.
   14. Meet de radioactiviteit van de celverteert met behulp van een gammateller.
       OPMERKING: De tellingen per minuut (cpm) moeten worden gecorrigeerd voor radioactief verval, achtergrondactiviteit en worden onderworpen aan specifieke activiteitsberekeningen volgens de formules beschreven door Glover en Hogstrand¹³.
   15. Om de eiwitconcentratie van de cellen te kwantificeren, homogeniseert u de cellen met 500 μL van 0,5 M NaOH.
   16. Gebruik een Bradford-testkit om de eiwitconcentratie in het celmonster te meten, met runderserumalbumine (BSA) als standaard.
       OPMERKING: Zodra de eiwitconcentratie is gekwantificeerd, kan de snelheid van Zn-opname door RTgutGC-cellen worden uitgedrukt als pmolen Zn min^-1 mg^-1 eiwit.

4. Schijnbare beschikbaarheid van dieet Zn in Atlantische zalm (Salmo salar)

OPMERKING: De Atlantische zalmvoeders zijn geformuleerd op basis van commerciële voeders, die eiwitbronnen bevatten die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% viseiwit, 10% visolie, 68% plantaardig eiwit en 12% plantaardige olie). Twee voeders werden aangevuld met een anorganische bron (Zn-sulfaat) of een organische bron (Zn-chelaat van glycine) om een Zn-concentratie van 150 mg/kg voer te bereiken. Bovendien werd Yttriumoxide (feed grade) met 0,01% aan het voer toegevoegd als inerte marker om de schijnbare beschikbaarheidscoëfficiënt te kunnen berekenen.

1. Acclimatiseer de Atlantische zalm (SalmoBreed-stam, leeftijd 1 + jaar, groepen van gemengd geslacht) in hun respectieve tanks totdat de vissen gewend zijn aan de experimentele omstandigheden.
2. Beoordeel de acclimatisatie van de Atlantische zalm door hun dagelijkse voeropname te controleren.
   OPMERKING: Deze proef werd uitgevoerd in drievoudstanks, dus in totaal werden zes tanks gebruikt. Tijdens de voedingsproef was de watertemperatuur 11,9 ± 0,3 °C en de verzadiging van opgeloste zuurstof 101 ± 5%.
3. Voer de vis gedurende 11 dagen met experimentele feeds.
4. Euthanaseer de vis door overdosis met behulp van 6 ml tricaine methaansulfaat stamoplossing per liter water.
5. Verzamel een gepoold monster van uitwerpselen van de vis uit dezelfde tank in een plaat door striping van de ventrale vin naar de anus.
6. Verwijder de uitwerpselen van de plaat met een spatel in een conische buis van 50 ml en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C.
   OPMERKING: De monsters werden bij -20 °C bewaard tot verdere analyse.
7. Vries de uitwerpselenmonsters gedurende 72 uur bij -80 °C.
8. Homogeniseer het ontlastingsmonster handmatig tot een fijn poeder met behulp van een stamper en mortel.
9. Bepaal de concentratie van Zn en Yttrium in de voeder- en ontlastingsmonsters met behulp van een ICP-MS (zoals elders beschreven⁹).
10. Bepaal de schijnbare beschikbaarheidscoëfficiënt (AAC, %) met behulp van de volgende formule:
    

Results

Evaluatie van chemische Zn-soorten in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer met behulp van een SEC-ICP-MS-methode
De SEC-ICP-MS-methode levert gegevens op over de chemische Zn-soorten die worden aangetroffen in de oplosbare fractie van het Atlantische zalmvoer. Figuur 4 illustreert het chromatografische profiel van Zn in de oplosbare fractie. Dit chromatogram werd verkregen met behulp van de SEC-ICP-MS methode. Vijf Zn bevattende pieken werden gevonden in de oplosbare fracties van het Atlantische zalmvoer. Elke piek heeft een ander molecuulgewicht; piek één (~ 600 kDa), piek twee en piek drie (van 32 tot 17 kDa), piek vier (van 17 tot 1,36 kDa) en piek vijf (> 1,36 kDa). Piek vier was het meest overvloedig, gevolgd door respectievelijk piek twee, drie, vijf en één. De chemische Zn-soorten die in de oplosbare fractie worden aangetroffen, kunnen verschillende bronnen hebben omdat het gebruikte voer zowel mariene als plantaardige ingrediënten en aangevulde vorm (d.w.z. Zn-sulfaat) bevat. Het molecuulgewichtsbereik van de chemische Zn-soort suggereerde dat deze verbindingen metalloproteïnen zouden kunnen zijn.

In vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer
De oplosbaarheid van aangevuld ⁶⁵Zn nam toe in aanwezigheid van aminozuren. Alle geteste aminozuren verhoogden de oplosbaarheid van aangevuld ^{65 Zn.}Methionine, glycine, cysteïne, histidine en lysine verbeterden de oplosbaarheid ^{van 65}Zn; hogere oplosbaarheid werd gevonden met histidine en lysine(figuur 5).

Evaluatie van de opname van Zn-soorten met behulp van een in vitro darmmodel (RTgutGC)
Apicale zinkopname in RTgutGC-cellen werd significant beïnvloed door de aanwezigheid van L-Met of DL-Met bij 2 mM-concentraties. Bovendien werd de impact van methionine op de opname van Zn in RTgutGC-cellen negatief beïnvloed door de aanwezigheid van BCH (een aminozuurtransportsysteemblokker), in vergelijking met cellen die niet met BCH zijn behandeld(figuur 6).

Schijnbare beschikbaarheid van dieet Zn in Atlantische zalm (Salmo salar)
In praktische voeders voor Atlantische zalm was de schijnbare beschikbaarheid van Zn hetzelfde bij aanvulling met een anorganische bron (Zn-sulfaat) of een organische bron (Zn-chelaat van glycine). De geschatte waarden voor de schijnbare beschikbaarheid van Zn (%, n = 3) in Atlantische zalm waren 31% ± 12% bij suppletie met een anorganische bron (Zn-sulfaat) en 31% ± 3% bij aanvulling van een organische bron (Zn-chelaat van glycine).

Figuur 1: Een samenvatting van de systematische aanpak om de beschikbaarheid van mineralen te beoordelen met behulp van complementaire methoden. Deze benadering werd gebruikt om de beschikbaarheid van zink in Atlantische zalm te bestuderen, waaronder Zn-soortvorming, Zn-oplosbaarheid in het darmmilieu, Zn-opname door darmcellen en Zn schijnbare beschikbaarheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Een samenvatting van de procedure voor Zn-extractie uit een voedermonster. Zink wordt gewonnen uit een voedingsmonster met behulp van milde extractieomstandigheden. De extractie wordt gevolgd door Zn-soortvormingsanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Een voorbeeld van de RTgutGC-cellen 1 h (links) en 1 week (rechts) na het zaaien in de celkweekkolven. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.

Figuur 4: Een chromatogram met de Zn-bevattende pieken van de oplosbare fractie van Atlantisch zalmvoer en geanalyseerd door SEC-ICP-MS. De drie replicaties worden gekenmerkt door de blauwe, rode en zwarte lijnen. Een moleculaire gewichtskalibratie werd uitgevoerd met thyroglobuline (660 kDa, monitoring ¹²⁷I), Zn/Cu superoxide dismutase (32 kDa, monitoring ⁶⁶Zn), myoglobine (17 kDa, monitoring ⁵⁷Fe), vitamine B12 (1,36 kDa, monitoring ⁵⁹Co); Piek 1 (P1): ~600 kDa, retentietijd (RT) 8,2 min; Piek 2+3 (P2+3): van 32 tot 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Piek 4 (P4): van 17 tot 1,36 kDa, RT 16,3 min; Piek 5 (P5): > 1,36 kDa, Rt 23,2 min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: De impact van aminozuren op de in vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). Gegevens werden geanalyseerd door middel van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door dunnet's meervoudige vergelijkingstest, waarbij het gemiddelde van elke AA-groep werd vergeleken met dat van de controlegroep (geen AA). De sterretjes geven het significantieniveau van ANOVA aan (P-waarden < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) en < 0,0001 (****)). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: De invloed van methionine en een aminozuurtransportremmer (2-Aminobicyclo [2.2.1] heptaan-2-carbonzuur, BCH, 10 mM). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). Gegevens werden geanalyseerd via tweerichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest met p < significantieniveau van 0,05. Post-hoc verschillen tussen groepen worden weergegeven als superscriptletter boven de balken; balken met verschillende superscripten zijn statistisch verschillend (p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

HPLC-instellingen
Kolom	SEC-kolom (30 cm x 7,8 mm, deeltjesgrootte 5 μm) + beschermkolom (deeltjesgrootte 7 μm)
Kalibratiebereik	1,0 × 104 - 5,0 × 105 Da
Mobiele fase	50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7,5)
Debiet	0,7 ml min−1
Injectie volume	50 μL
ICP-MS-instellingen
Voorwaarts vermogen	1550 W
Plasma gasstroom	15,0 l min−1
Dragergasstroom	0,86 l min−1
Make-up gasstroom	0,34 l min−1
Verblijftijd	0,1 s per isotoop
Isotopen gemonitord	127 I, 66Zn, 59Co, 57Fe

Tabel 1. Een overzicht van instrumentinstellingen voor de HPLC en ICP-MS.

Chemische samenstelling (mM)	L15/ex	Experimenteel medium (L15/FW)
Natriumnitraat	155	155
Kaliumnitraat	6.2	6.2
Magnesiumsulfaat	3.8	19.5
Calciumnitraat	1.5	5.4
Hepes	5	5
Magnesiumchloride	-	15
Natriumpyruvaat	5.7	5.7
Galactose	5.7	5.7
Ph	7.1	7.4
Ionische sterkte	178	258
Ionische samenstelling (mM)
Calcium, Ca2+ *	1,6 ± 0,1	5,3 ± 0,2
Magnesium, Mg2+ *	3,9 ± 0,3	32,5 ± 0,7
Kalium, K+ *	8,2 ± 1,2	8,6 ± 1,1
Natrium, Na+ *	160 ± 3	157 ± 2
Nitraat, NO3- **	164	172.4
Sulfaat, SO4- **	3.8	18.7
Chloride, Cl- **	1.5	31.5

Tabel 2. De chemische en ionische samenstelling van de experimentele media getest.

Discussion

De intestinale absorptie van Zn lijkt te worden beïnvloed door de chemische vorm van de Zn-soort¹³. In dit verband maakte het gebruik van de in dit artikel beschreven protocollen het mogelijk om achtereenvolgens de chemische en biologische aspecten te bestuderen die ten grondslag liggen aan de 'beschikbaarheid' van Zn in Atlantische zalm.

Deze studie rapporteerde het gebruik van een Zn-soortanalysemethode. De SEC-ICP-MS-methode leverde kwalitatieve gegevens op over het molecuulgewicht van chemische Zn-soorten die aanwezig zijn in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer. Dit werd bereikt door vergelijking van de retentietijden van de moleculaire gewichtskalibratiestandaarden (d.w.z. thyroglobuline (660 kDa), Zn/Cu superoxide dismutase (32 kDa), myoglobine (17 kDa) en vitamine B12 (1,36 kDa)) met de retentietijden van Zn-bevattende pieken. Een uitdaging gevonden in de Zn-soortanalyse was de identificatie van de onbekende chemische Zn-soort als gevolg van een gebrek aan analytische normen. In SEC is de scheiding van de moleculen gebaseerd op hun grootte ten opzichte van de poriën in de stationaire fase. In principe zullen grotere moleculen sneller reizen, eerst elueren, en kleinere moleculen zullen langzamer reizen, later^{eluteren 14}. Bijgevolg kan elke Zn-bevattende piek verschillende verbindingen bevatten met een vergelijkbaar molecuulgewicht¹⁵. Dit draagt ook bij aan de uitdaging om onbekende chemische Zn-soorten te identificeren. Bovendien werden verschillende milde extractiecondities getest voor extractie van Zn. De geëxtraheerde Zn was laag (~10%). Milde extractieomstandigheden werden toegepast om de chemische Zn-soorten intact te houden, maar dit kan de extractie-efficiëntie in gevaar hebben gebracht⁷.

In de in vitro oplosbaarheidstest gaf de oplosbaarheid van aangevuld Zn (als radio-isotoop ⁶⁵ZnCl₂) aan dat de aminozuren, met name histidine en lysine, de oplosbaarheid van Zn verhoogden (figuur 5). Het rechtstreeks gebruik van voedermonsters voor in vitro oplosbaarheidstests onder gesimuleerde gastro-intestinale omstandigheden is gebaseerd op de wetenschap dat verandering in Zn-speciatie pH-afhankelijk is¹⁶. Zure omstandigheden aan het begin van het maagdarmkanaal kunnen echter leiden tot enige verandering in de soortvorming die onomkeerbaar kan zijn (bijv. ZnO -> ZnCl₂, in aanwezigheid van HCl onder zure omstandigheden in de maag). Niettemin is de Zn-bron die hier wordt gebruikt ZnSO₄ en waarvan de oplosbaarheid werd verbeterd door aminozuren in het medium. De volgende vraag die beantwoord moest worden was: kan de toegenomen oplosbaarheid vertaald worden naar beschikbaarheid? De RTgutGC darmcellijn werd gebruikt om deze vraag te bestuderen. In de context van minerale voeding bij dieren is de term 'beschikbaarheid' moeilijk te definiëren en kan deze differentieel worden gereguleerd in de cellen (in vitro) in vergelijking met een dier (in vivo). Vandaar dat de term 'opname' werd gebruikt als het ging om de in vitro evaluatie met behulp van intestinale cellijn. De cellijn leverde nuttige informatie op over de Zn-opnamemechanismen in het darmepitheel, dat deel uitmaakt van het complexe regulerende proces dat de beschikbaarheid van mineralen bij dieren regelt. De RTgutGC-cellen ontlokten een beter vermogen tot apicale opname van Zn in de aanwezigheid van een aminozuur (d.w.z. methionine; Figuur 6). De schijnbare beschikbaarheid in vivo verschilde echter niet significant tussen anorganische en organische Zn-bronnen in Atlantische zalm. In de in vivo beschikbaarheidsstudie werd de Zn-bronvergelijking gemaakt bij Zn-niveaus in de voeding die de bekende Zn-behoeften van Atlantische zalm¹⁷, totale Zn-concentratie van 150 mg / kg voer overschreden. De verschillen in beschikbaarheid worden beter gevisualiseerd wanneer de geteste voedingsniveaus in het lineaire dynamische bereik vallen voordat het dier verzadiging bereikt. In de huidige in vivo studie is het mogelijk dat de Atlantische zalm goed verzadigd was door het waargenomen verschil in Zn-absorptie tussen de gebruikte bronnen.

Samenvattend leverde de eerste methode kwalitatieve informatie op over verschillende chemische Zn-soorten die worden aangetroffen in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer; de tweede methode, in vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn werd verbeterd in aanwezigheid van aminozuurliganden; de derde methode bevestigde dat verbeterde oplosbaarheid door aminozuren de opname in het darmepitheel kan verbeteren; omgekeerd heeft de vierde methode geen verschillen gevonden in de beschikbaarheid van Zn van anorganische of biologische bron tot Atlantische zalm. Tot slot, hoewel niet in overeenstemming met de in vivo bevindingen, leverden de in vitro protocollen wel interessante inzichten op in het begrijpen van de verschillende componenten van de beschikbaarheid van Zn.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Sartorius
0.45 μm membrane filter	Pall
10 % fetal bovine serum	Eurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter	LKB Wallac
24 well plates (Falcon, TPP microplates)	Thermo Fisher Scientific	10048760
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid	Sigma Aldrich	A7902
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks)	TPP Techno Plastic Products AG	90075
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
Bradford assay kit	Bio-Rad	5000001
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5702
L-Cysteine	Sigma Aldrich	30089
DL-methionine	Alfa Aesar	59-51-8
D-methionine	Sigma Aldrich	M9375
Experimental fish feeds	Skretting
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size)	Tosoh
L-Histidine	Sigma Aldrich	53319
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS	Agilent Technologies
Hydrochloric acid	Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck	1.00317
Knife mill	GM 300, Retsch Gmbh
L-15 medium	Invitrogen/Gibco	21083027
L-methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Lysine	Sigma Aldrich	23128
Methanol	LiChrosolv, HPLC grade, Merck	1.06035
Milli-Q water (18.2 MΩ cm)	EMD Millipore Corporation
Myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
NexION 350D ICP-MS	Perkin Elmer
Pasteur pipette	VWR
pH meter	inoLab
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	806552
RTgutGC cells			Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland
SEC column, TSKgel G3000SWxl	Tosoh
Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm)	Retsch
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	436143
Superoxide dismutase	Sigma Aldrich	S7571
Thyroglobulin	Sigma Aldrich	T1001
Tricaine methanesulphonate	PharmaQ
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma Aldrich	252859
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline	Biowest	L0910
Versene EDTA solution	Invitrogen/Gibco	15040-033
Vitamin B12	Sigma Aldrich	V2876
Zinc chelate of glycine	Phytobiotics
Zinc sulphate	Vilomix