Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

15.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59866

⸱

18 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regeneron Pharmaceuticals, Inc

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.

Samenvatting

Pancreatic eilandjes bestaan uit endocriene cellen met onderscheidende hormoon expressie patronen. De endocriene cellen vertonen functionele verschillen in reactie op normale en pathologische omstandigheden. Het doel van dit protocol is het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van elk type endocriene cellen met het gebruik van een druppeltje gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie. Dergelijke gegevens kunnen worden gebruikt om het genexpressie profiel van elk type endocriene cellen in normale of specifieke omstandigheden te bouwen. Het proces vereist zorgvuldige hantering, nauwkeurige meting en strenge kwaliteitscontrole. In dit protocol beschrijven we gedetailleerde stappen voor de dissociatie, sequencing en data-analyse van menselijke alvleesklier eilandjes. De representatieve resultaten van ongeveer 20.000 humane single Islet-cellen tonen de succesvolle toepassing van het protocol aan.

Inleiding

Pancreatic eilandjes vrijgeven endocriene hormonen om de niveaus van de glucose van het bloed te reguleren. Vijf endocriene celtypen, die functioneel en morfologisch verschillen, zijn betrokken bij deze essentiële rol: α-cellen produceren glucagon, β-cellen insuline, δ-cellen Somatostatine, pp-cellen alvleesklier polypeptide en ε-cellen ghreline1. Genexpressie profilering is een nuttige benadering om de endocriene cellen in normale of specifieke omstandigheden te karakteriseren. Historisch gezien werd het hele eilandje genexpressie profilering gegenereerd met behulp van Microarray en volgende-generatie RNA-sequencing2,3,4,5,6,7 , 8. Hoewel het hele eilandje transcriptome informatief is om de Orgaanspecifieke transcripten en kandidaatgenen van de ziekte te identificeren, slaagt het er niet in de moleculaire heterogeniteit van elk eilandje celtype te achterhalen. Laser Capture microdissection (LCM)-techniek is toegepast om rechtstreeks specifieke celtypen te verkrijgen van eilandjes9,10,11,12 maar valt niet op zuiverheid van de beoogde cel Bevolking. Om deze beperkingen te overwinnen, is fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt om specifieke endocriene celpopulaties te selecteren, zoals α-en β-cellen13,14,15,16 , 17 , 18. Bovendien gebruikte dorrell et al. een op antilichamen gebaseerde FACS Sorteer benadering om β-cellen te classificeren in vier subpopulaties19. FACS-gesorteerde eiland cellen kunnen ook worden verguld voor RNA-sequencing van enkelvoudige cellen; de op plaat gebaseerde methoden worden echter geconfronteerd met uitdagingen in schaalbaarheid20,21,22.

Voor het genereren van hoge kwaliteit, grootschalige transcriptome gegevens van elk type endocriene cel, we toegepast microfluïdische technologie voor menselijke eiland cellen. Het microfluïdische platform genereert transcriptome gegevens uit een groot aantal afzonderlijke cellen in een hoge doorvoer, hoge kwaliteit en schaalbare manier23,24,25,26,27. Naast het onthullen van moleculaire kenmerken van een celtype dat in een grote hoeveelheid is gevangen, maakt een zeer schaalbaar microfluïdisch platform identificatie van zeldzame celtypen mogelijk wanneer er voldoende cellen worden geleverd. Vandaar dat de toepassing van het platform op menselijke pancreas eilandjes de profilering van ghrelin-afscheidende ε-cellen toegestaan, een zeldzaam endocriene celtype met weinig bekende functie vanwege zijn schaarste28. In de afgelopen jaren, verschillende studies zijn gepubliceerd door ons en anderen rapporteren grootschalige transcriptome gegevens van menselijke eilandjes met behulp van de technologie29,30,31,32, 33. De gegevens zijn publiekelijk beschikbaar en nuttige middelen voor de Gemeenschap van het eiland om de heterogeniteit van de endocriene cellen en de implicatie ervan bij ziekten te bestuderen.

Hier beschrijven we een op droplet gebaseerd microfluïdisch single-cell RNA sequencing protocol, dat is gebruikt om transcriptome gegevens te produceren van ongeveer 20.000 menselijke eilandje cellen, waaronder α-, β-, δ-, PP, ε-cellen, en een kleiner deel van niet-endocriene cellen 32. de werkstroom begint met geïsoleerde menselijke eilandjes en toont stappen van eilandje celdissociatie, vastleggen in één cel en gegevensanalyse. Het protocol vereist het gebruik van vers geïsoleerde eilandjes en kan worden toegepast op eilandjes van mensen en andere soorten, zoals knaagdieren. Met behulp van deze workflow, kunnen onbevooroordeelde en uitgebreide eiland-celatlas onder baseline en andere omstandigheden worden gebouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. dissociatie van menselijke eilandje

  1. Verkrijgen van menselijke eilandjes geïsoleerd van kadaver orgaandonoren van beide geslacht, leeftijden tussen 15-80 jaar, zonder reeds bestaande ziekten, tenzij eilandjes van donoren met specifieke demografische gegevens zijn vereist voor het doel van de studie.
    1. Na isolatie, hebben de geïsoleerde eilandjes bewaard in de weefselcultuur faciliteit voor 2-3 dagen bij de leverancier. Het duurt vaak meer dan 1 dag voor eilandje schade zichtbaar te worden.
    2. Plaats de eilandjes in een flesje en dompel het volledig onder in het eilandje. Krijg het in het laboratorium door de nachtelijke verzending.
    3. Verkrijg het eilandje equivalente hoeveelheid (IEQ) van de verscheept eilandjes van de leverancier van het eilandje.
  2. Herstel eilandjes van de zending op de dag van het eilandje aankomst. Voer deze stap uit met een capuchon om de kans op verontreiniging te minimaliseren.
    1. Koel de volledige eilandje media (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x pen-STREP, 2 mM glutamine) in een koelkast.
    2. Breng de eilandjes van de fles over in een conische buis van 50 mL.
    3. Voeg 10 mL voorgekoelde complete eilandje media toe aan de geleegd flesje om de overgebleven eilandjes te wassen. Breng de media over naar de conische buis.
    4. Centrifugeer de buis op 200 x g gedurende 2 minuten om eilandjes te herstellen. Aspireren de supernatant verlaten over 1-2 mL media met de pellet.
    5. Resubreng de eilandjes met voorgekoelde complete eilandje media. Op basis van de IEQ geleverd door de leverancier, toevoegen 12 mL media per 5000 IEQ.
    6. Giet de eilandjes in de media op een 10 cm niet-behandelde weefselkweek schotel. Incuberen in een weefselkweek incubator bij 37 °C met 5% CO2 in atmosferische lucht.
  3. Dissociate eilandjes zoals hieronder weergegeven. Voer deze stap uit na een nachtelijke incubatie.
    1. Pre-warme complete eilandje media en celdissociatie oplossing.
    2. Bereid 1x PBS met 0,04% BSA bij kamertemperatuur.
    3. Tel en hand-pick 200-300 eilandjes met behulp van een P200 pipet en breng de eilandjes over naar een conische buis van 15 mL met 5 mL voorverwarmde complete eilandje media.
    4. Verzamel de eilandjes door centrifugeren bij 200 x g gedurende 2 min. Zuig de supernatant zachtjes op zonder de pellet op de bodem te verstoren.
    5. Voeg 1,0 mL voorverwarmde celdissociatie oplossing toe en breek de pellet door zachtjes op en neer te pipetteren. Incuberen de eilandjes bij 37 °C gedurende 9-11 min. Elke 3 min pipet op en neer langzaam voor 10 s om de cellen in afzonderlijke cellen te ontkoppelen.
    6. Zodra de eiland cellen goed zijn losgekoppeld en de oplossing troebel wordt, voeg je 9 mL complete eilandje media toe en filtreer je door een 30 μm celzeef in een nieuwe conische buis van 15 mL.
    7. Was de buis en de celzeef met 2 mL complete eilandje media om de overgebleven eilandjes te verzamelen en toe te voegen aan dezelfde buis.
    8. Verzamel cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 minuten.
    9. Zuig de media voorzichtig aan en breng de celpellet in 5 mL 1x PBS met 0,04% BSA (PBS-BSA).
    10. Filtreer door een nieuwe 30 μm celzeef in een conische buis van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g om cellen te verzamelen.
    11. Zuig de supernatant op en relaat de celpellet in 200-300 μL 1x PBS-BSA-oplossing.
    12. Meet de celconcentratie en pas het volume aan tot een eindconcentratie van 400-500 cellen/μL.

2. enkelvoudige celophanging kwaliteitscontrole

  1. Bepaal de celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller van fluorescentie34.
    1. Meng 10 μL cellen met 0,5 μL AO/DAPI. Pipet Meng grondig. Laad 10,5 μL op de glijbaan en voer de celmeetassay uit om het aantal en de levensvatbaarheid te bepalen.
    2. Verdun en/of Filtreer de celsuspensie indien nodig op basis van het aantal cellen.

3. partitionering van één cel met behulp van een microfluïdische chip. Volg Protocol van microfluïdische chipfabrikant35.

  1. Breng 3 ' gel Beads en reverse transcriptie (RT) reagentia naar kamertemperatuur (> 30 min). Reconstitueer indien nodig de RT primer in TE buffer.
  2. Bereid de RT Master mix in een lage BIND buis zoals beschreven in tabel 1.
  3. Bepaal het aantal cellen dat moet worden ingevoerd voor elk voorbeeld. Bereken het volume van de celsuspensie (X) dat nodig is om het gewenste doelcelnummer te leveren. Het berekende volume Nuclease vrij water dat aan elk monster wordt toe te voegen, is 33,8-X μL.
  4. Voeg voor elk te gepartitioneerd monster 33,8-X μL Nuclease vrij water toe aan de PCR-strip buis van 0,2 mL. Voeg vervolgens 66,2 μL Master Mix toe aan elke strip buis. Voeg de cellen op dit punt niet toe aan de strook buis. Pipetteer zachtjes om te mengen. Leg de voorbereide strook buizen op ijs.
  5. Plaats een microfluïdische chip in een chip case. Oriënteer de chip Case waardoor olieputten (rij gelabeld 3) zijn het dichtst bij de persoon die het experiment uitvoert.
  6. Als er minder dan 8 monsters worden uitgevoerd, gebruikt u 50% glycerol om ongebruikte kanalen in de volgende volgorde te vullen:
    1. Voeg 90 μL 50% glycerol toe aan de putten in rij 1 voor alle ongebruikte kanalen.
    2. Voeg 40 μL 50% glycerol toe aan de putjes in rij 2 voor alle ongebruikte kanalen.
    3. Voeg 270 μL 50% glycerol toe aan de putjes in rij 3 voor alle ongebruikte kanalen.
  7. Maak de gelkralen in een Vortex. Vortex op volle snelheid voor 30 s. Tik meerdere malen op de strip op de Bench top om kralen te verzamelen. Bevestig dat er geen bubbels aanwezig zijn.
  8. Voeg X μL cellen toe aan de voorbereide strook buizen. Pipet om 5 keer te mengen. Zonder de pipetpunten te verwijderen, moet u 90 μL celmengsel overbrengen naar rij 1 van de chip.
  9. Wacht 30 s en laad vervolgens 40 μL gel-parels op rij 2. Pipetteer heel langzaam voor deze stap. Breng 270 μL partitioneringsolie in de putjes van rij 3.
  10. Haak de spaan pakking op de lipjes van de spaan houder. Plaats de gemonteerde chip houder in het partitioneringsapparaat met één cel en druk op de knop uitvoeren.
  11. Verwijder onmiddellijk de gemonteerde spaan houder bij uitvoering voltooid.
  12. Verwijder de spaan pakking van de houder, open de spaan kast in een hoek van 45 ° en verwijder 100 μL van de emulsie van de chip in een blauwe kunststof 96-goed plaat.

4. cDNA-versterking van één cel. Volg Protocol van microfluïdische chipfabrikant35.

  1. Omgekeerde transcriptie.
    Opmerking: Voer deze stap uit onder een schone PCR-only kap om microbiële en andere contaminatie van het niet versterkte cDNA te voorkomen.
    1. Seal de 96-goed blauwe plaat met een folie afdichting op een verwarmde plaat sealer.
    2. Voer de omgekeerde transcriptie reactie in een thermische cycler als volgt uit: 53 °C gedurende 45 min à 85 °C gedurende 5 minuten à 4 °C.
      Opmerking: dit is een veilig stoppunt. Monsters kunnen op 4 °C voor maximaal 72 uur houden.
  2. Reiniging na RT
    1. Breng het nucleïnezuur bindende magnetische kralen en nucleïnezuur grootte selectie magnetische kralen op kamertemperatuur en Vortex om opnieuw op te schorten. Op dit punt ontdooit u de monster opschonings buffer gedurende 10 minuten bij 65 °C. Breng alle andere reagentia op kamertemperatuur en Vortex.
    2. Bereid de buffers voor zoals weergegeven in tabel 2 en tabel 3.
  3. De emulsie chemisch breken en zuiveren.
    1. Om dit te doen, verwijder voorzichtig de folie afdichting van de plaat.
    2. Verdeel 125 μL roze emulsie-breek reagens in elke emulsie. Wacht 1 minuut en breng het volledige volume over naar een schone 0,2 mL strip buis. Zorg ervoor dat er een laag van helder en een laagje roze in de strook buis.
    3. Verwijder 125 μL van de roze laag van de onderkant van de strook buis zonder de blanke laag te verstoren. Het is normaal dat een klein volume (~ 15 μL) van de roze laag in de buis blijft.
    4. Voeg 200 μL opruimings mengsel van tabel 2 toe aan de strook slang en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    5. Breng de strip buis over naar een magnetische standaard en laat de oplossing wissen. Verwijder de supernatant en gooi, dan was de kralen met 80% ethanol tweemaal. Laat de kralen 1 minuut drogen.
    6. Verwijder de strook buis van de magneet en voeg 35,5 μL elutie-oplossing van tabel 3 aan de parels toe. Pipet om de parels in de oplossing te hervatten. Inincuberen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Breng de strip buis over naar een magnetische standaard en laat de oplossing wissen. Verwijder het gezuiverde cDNA uit de strip buis en verdeel het om 0,2 mL strip buizen te reinigen.
  4. Versterken de cDNA.
    1. Bereid amplificatie Master mix voor in tabel 4, hieronder.
    2. Voeg aan elk monster 65 μL cDNA Amplification Master Mix toe. Plaats de strip buis in een thermische cycler en voer het volgende programma uit: 98 °C 3 min à 15 cycli van [98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1 min] à 72 °C 5 min à 4 °C Hold
      Opmerking: dit is een veilig stoppunt. Monsters kunnen op 4 °C voor maximaal 72 uur houden.
    3. Reinig de versterkte cDNA met 0,6 x nucleïnezuur grootte selectie magnetische kralen. Was tweemaal met 80% ethanol en elueer met 40,5 μL.
    4. Voer de kwaliteitscontrole cDNA uit met behulp van geautomatiseerde gel elektroforese en fluorescentie-gebaseerde DNA kwantatie test36,37.
      Opmerking: dit is een veilig stoppunt. Monsters kunnen bij 4 °C tot 72 uur of bij-20 °C voor onbepaalde tijd worden bewaard.

5. sequentiëren bibliotheek constructie

  1. Tagmentatie en clean-up van cDNA38.
    1. Normaliseer cDNA tot 50 ng in 20 μL van het totale volume. Exacte kwantatie is van cruciaal belang in deze stap.
    2. Maak de tagmentatie mix in tabel 5 en aliquot 30 μL tot elk 20 ΜL cDNA-monster op ijs. Zet de monsters in de thermische cycler en voer het tagmentatie protocol uit: 55 °C 5 min à 10 °C vasthouden.
    3. Voer de clean-up van tagmenteerde cDNA met behulp van kolommen38. Voeg aan elk monster een DNA-bindings buffer van 180 μL toe. Breng 230 μL over naar een spin kolom.
    4. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1300 x g en gooi de doorstroom weg.
    5. Was tweemaal met een 300 μL DNA-reinigings buffer. Centrifugeer 2 minuten extra bij 1300 x g om te zorgen dat ethanol wordt verwijderd.
    6. Elute gezuiverde tagmenteerde cDNA door het toevoegen van 31 μL elutie buffer aan de kolom en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    7. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1300 x g om het gezuiverde product te herstellen.
  2. Monster index PCR.
    1. Kies streepjescodes die niet overlappen tijdens een multiplexed sequentiëren uitvoeren.
    2. Maak een sample index PCR Master Mix zoals weergegeven in tabel 6.
    3. Voeg 60 μL monster index PCR-Master mengsel toe aan 30 μL van het gezuiverde monster.
    4. Voeg aan elk monster 10 μL van een 20 μM, 4-oligo-monster index toe (record index gebruikt). Het totale reactievolume is nu 100 μL.
    5. Plaats in een thermische cycler met het deksel ingesteld op 105 °C. Voer het volgende programma uit: 98 °C 45 s à 12-14 cycli van [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] à 72 °C 1 min à 4 °C hold.
      Opmerking: dit is een veilig stoppunt. Monsters kunnen op 4 °C voor maximaal 72 uur houden.
  3. Purify bibliotheken met dubbele kraal opruimen.
    1. Voeg aan het monster 100 μL nucleïnezuur grootte selectie magnetische kralen toe en meng grondig met een pipet. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    2. Breng aan op een magneet en laat deze staan totdat de oplossing is verdwenen. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
    3. Was tweemaal met 200 μL van 80% ethanol.
    4. Droog de parels op de magneet gedurende 2 min. Verwijder uit de magneet en voeg 50,5 μL EB-buffer toe aan de kraal pellet. Pipet om de parels in de buffer opnieuw op te schorten.
    5. Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 min. overbrengen naar een magneet en laat staan voor 2 min. Breng 50 μL van het voorbeeld naar een schone strook buis.
    6. Voeg 40 μL nucleïnezuur selectie magnetische kralen toe aan het monster en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Breng de oplossing op een magneet aan en laat deze duidelijk. Verwijder en gooi supernatant weg.
    7. Was tweemaal met 125 μL van 80% ethanol.
    8. Droog de parels op de magneet gedurende 2 min. Verwijder uit de magneet en voeg 60,5 μL EB-buffer toe aan de kraal pellet. Pipet om de parels in de buffer opnieuw op te schorten.
    9. Inincuberen bij kamertemperatuur 2 min. Transfer naar een magneet en laat het staan voor 2 min. Breng 50 μL van het voorbeeld naar een schone strook buis. Dit is de definitieve bibliotheek.
    10. Houd monsters bij 4 °C voor onbepaalde tijd tot 72 uur of bij-20 °C. Houd er rekening mee dat dit een veilig stoppunt is.
  4. Kwantificeer en voer kwaliteitscontrole uit van de uiteindelijke bibliotheken met behulp van geautomatiseerde gel elektroforese en fluorescentie-gebaseerde DNA-quantitatie test36,37. Verdun de monsters 1:10 voordat de kwaliteitscontrole wordt uitgevoerd.

6. sequentiëren van bibliotheken

  1. Normaliseer elk monster om te worden gesequentieerd naar 2 ng/μL en pool 3 μL van elk genormaliseerd monster samen.
  2. Meet de pool concentratie met de op fluorescentie gebaseerde DNA-kwantitatie test37.
  3. Verdun het zwembad tot 0,25 ng/μL.
  4. De pool als volgt denatureren: 12 μL verdund samengevoegd monster (0,25 ng/μL) + 1 μL DNA-controle (1 nM), 2 μL EB-buffer + 5 μL NaOH (0,4 N). Laat dit gedurende 5 minuten inbroed en voeg vervolgens 10 μL van 200 mM tris pH 8,0 toe.
  5. Laad 4,05 μL in 1345,95 μL HT1. Laad 1,3 mL in de patroon van de sequencer en voer volgens de richtlijnen van de fabrikant39 met behulp van een volgorde recept met 26 cycli (Lees 1) + 8 cycli (i7-index) + 0 cycli (i5-index) + 55 cycli (Lees 2).

7. Lees uitlijning (aanvullend bestand 1)

  1. Voer Cell Ranger (v 2.0.0) uit om RAW base Call (BCL)-bestanden te demultiplex die worden gegenereerd door sequentiëren in FASTQ-bestanden. Lijn FASTQ bestanden uit naar humaan B 37,3 genoom assemblage en UCSC gen model om expressie kwantificering te verkrijgen.
  2. Uitlijning kwaliteitscontrole.
    1. Metrische gegevens voor uitlijning genereren en controleren Q30 bases, geldige streepjescode, cel-geassocieerde Lees breuk, toegewezen Lees breuk en gelezen in elke cel gedetecteerd.
    2. Bekijk de streepjescode rangschikking om ervoor te zorgen dat de met de cel geassocieerde streepjescodes en de achtergrond worden gescheiden.

8. gegevensanalyse (aanvullend bestand 2)

  1. Celkwaliteitscontrole en voorverwerken.
    1. Cellen uitsluiten met < 500 gedetecteerde genen, < 3000 totaal aantal unieke moleculaire identificatie (UMI), > 0,2 levensvatbaarheid Score zoals eerder beschreven32. Pas de afgeknipte aan volgens weefsel-en celtypes.
    2. Verwijder doublets.
      1. Evalueer de vijf endocriene hormoon genen (glucagon- GCG, insuline- ins, Somatostatine- SST, pancreas polypeptide- PPYen ghreline- ghrl) voor bimodaal uitdrukkings patroon (hoog-en laaguitdrukkings modus) met behulp van R pakket mclust40.
      2. Verwijder cellen die meer dan één hormoon-gen uitdrukken, d.w.z. met twee of meer hormoon genen in de High-Expression-modus.
    3. Normaliseer genexpressie door de totale UMI en vermenigvuldig met de schaalfactor van 10.000 op celniveau met R-pakket Seurat41.
    4. Verwijder genen gedetecteerd in minder dan 3 cellen.
    5. Detecteer variabele genen met behulp van gemiddelde expressie en dispersie van alle cellen. Pas de afgeknipte aan volgens de weefsel-en celtypen.
  2. Voer de hoofdcomponent analyse uit met de variabele genen. Cluster cellen met het geselecteerde aantal hoofdcomponenten. Verrijkte cellen met cluster verrijking door één celcluster te vergelijken met de rest van de cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De single-cell RNA sequencing workflow bestaat uit drie stappen: door intact menselijke eilandjes in eencellige suspensie, het vastleggen van afzonderlijke cellen met behulp van een druppel gebaseerde technologie, en het analyseren van RNA-SEQ-gegevens (Figuur 1). Ten eerste werden de verworven menselijke eilandjes 's nachts geïnfiltreerd. De intacte eilandjes werden onder de microscoop onderzocht (Figuur 2a). De integriteit van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Single-cell technologieën ontwikkeld in de afgelopen jaren bieden een nieuw platform te karakteriseren celtypen en studie moleculaire heterogeniteit in menselijke alvleesklier eilandjes. We hebben een protocol van op droplet gebaseerde microfluïdische eencellige isolatie en data-analyse aangenomen om menselijke eilandjes te bestuderen. Ons protocol heeft met succes RNA-sequentie gegevens geproduceerd van meer dan 20.000 single human Islet-cellen met relatief kleine variaties in sequentie kwaliteit en batch-effecten.

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs zijn werknemers en aandeelhouders van Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Celzevener
8-kamer slidesChemometec102673-680Dell telling assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626voor QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagenten
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elutie buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blauw, semi-skirtedVWR47744-112Emulsie plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRGeïsoleerde humane islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Reagenten voor bibliotheekvoorbereiding
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854voor QC
Solution 18Chemometec103011-420Celtelling assay reagens
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Zuiveringskralen
Weefselkweekschotels (10 cm)VWR10861-594voor isletcultuur
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Celdissociatie oplossing
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactiesVWR77001-152Bibliotheek opruiming kolommen

Referenties

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552(2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694(2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499(2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367(2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , 10X Genomics. (2017).
  36. Agilent Technologies. Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent Technologies. (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , Thermo Fischer Scientific. (2015).
  38. Illumina. Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , Illumina. (2016).
  39. Illumina. llumina NextSeq 500 System Guide. , Illumina. (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Celdissociatiemicrofluïdische chipfluorescentiegebaseerde celstellercomplementaire DNA-amplificatietagmentatieprotocolprincipale componentenanalysecelclusteringt-SNE-analyse
Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.