Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

Samenvatting

We presenteren een methode voor het isoleren en cultiveren van primaire menselijke speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Deze cellen vertonen genexpressie patronen consistent met hen van speeksel epitheel oorsprong en kunnen worden gekweekt als salispheres op kelder membraan matrices afgeleid van engelbreth-Holm-Swarm tumorcellen of als monolagen op behandelde cultuur gerechten.

Samenvatting

De speekselklieren zijn een site van aanzienlijke belangstelling voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in meerdere aspecten van de menselijke ziekte. Een doel van de onderzoekers is het herstellen van de functie van klieren beschadigd door straling therapieën of als gevolg van pathologieën geassocieerd met het syndroom van Sjögren. Een tweede doel van de onderzoekers is het definiëren van de mechanismen waarmee virussen repliceren binnen klierweefsel waar ze dan toegang tot speeksel vloeistoffen belangrijk voor horizontale overdracht kunnen krijgen. Deze doelstellingen benadrukken de noodzaak van een robuuste en toegankelijke in vitro speekselklier model dat kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de bovengenoemde en aanverwante onderzoekgebieden. Hier bespreken we een eenvoudig protocol om epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren en ze in vitro te propageren. Ons protocol kan verder worden geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van individuele studies. Kort, speeksel weefsel is mechanisch en enzymatisch gescheiden om te isoleren van enkele cellen of kleine clusters van cellen. Selectie voor epitheliale cellen treedt op door plating op een kelder membraan matrix in de aanwezigheid van media geoptimaliseerd om epitheliale celgroei te bevorderen. Deze resulterende culturen kunnen worden gehandhaafd als driedimensionale clusters, aangeduid als "salispheres", of gekweekt als een monolaag op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten. Dit protocol resulteert in de uitgroei van een heterogene populatie van voornamelijk epitheelcellen die kan worden gekweekt voor 5-8 passages (15-20 populatie doublings) voordat het cellulaire senescentie ondergaat.

Inleiding

Bij zoogdieren zijn de speekselklieren ingedeeld in 3 paar grote speekselklieren: de parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Er bestaat ook een reeks van kleine klieren gelegen op de tong en verspreid over de mondholte¹. De belangrijkste klieren zijn verantwoordelijk voor het bulk volume van speeksel geproduceerd². Naast het verstrekken van antimicrobiële bescherming door uitgescheiden factoren, het speeksel is belangrijk in het proces van kauwen en smeren van voedsel als het passeert de slokdarm². Als zodanig, speekselklier dysfunctie vertegenwoordigt een medisch probleem waarbij patiënten die niet in staat zijn om voldoende speeksel te produceren meer vatbaar zijn voor het ontwikkelen van maladies zoals tandheelkundige holten of orale candidiasis³. Bovendien, verminderde speeksel resulteert in grotere moeilijkheden eten en verteerd voedsel met een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven.

De speekselklier dysfunctie is voornamelijk te vinden bij patiënten die lijden aan het syndroom van Sjögren, een auto-immuunstoornis of bij patiënten met hoofd-en nekkanker die bestraling van^{3,4,5, 6}. Beschadigde secretoire acini binnen de klieren als gevolg van auto-immuniteit of bestralingstherapie ondergaan geen zelf vernieuwing, wat resulteert in een patiënt leven met onherstelbare schade⁶. De studie van de speekselklieren heeft ook de aandacht of onderzoekers geïnteresseerd in mechanismen van virale pathogenese gegarnerd. Sommige pathogenen, zoals humaan cytomegalovirus (hcmv), voortdurend repliceren binnen de speekselklieren, die vervolgens het mogelijk maakt voor de overdracht van ontluikende virus naar een nieuwe gastheer via speeksel^7,8. Zo is er een onvervulde behoefte om robuuste en reproduceerbare in vitro modellen van speekselklier weefsel te ontwikkelen om een divers scala aan medische problemen aan te pakken en te begrijpen.

Verschillende modellen van het Murine speekselklier systeem zijn gebruikt als uitgangspunt voor het begrijpen en karakteriseren van de verschillende epitheelcellen die de speekselklieren vormen^9,10. Er bestaan duidelijke en grote verschillen tussen menselijke en muriene speekselklieren¹¹. Met name de humane holte klier is groter ten opzichte van de submandibulaire klier, terwijl de muis submandibulaire en holte veel vergelijkbaar zijn in grootte^1,2,11. Terwijl vereeuwigd menselijke submandibulaire cellijnen bestaat, er zijn grote bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet nauwkeurig het fenotype van het primaire weefsel en secundaire bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet daadwerkelijk worden afgeleid van speeksel epitheel zelf¹². Om deze redenen is er een belang en een noodzaak om primaire speeksel weefsel van de mens te bestuderen.

Hier beschrijven we een protocol om primaire epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren voor weefselkweek. Ons protocol is gebaseerd op de werken van Pringle et al. en Tran et al. met wijzigingen die zijn aangebracht om hun procedures over het algemeen te vereenvoudigen^13,14. Ten eerste, terwijl het Protocol van Tran et al. vraagt om een lange incubatietijd van vijf uur voor enzymatisch verteren van het speeksel weefsel, is ons gewijzigde protocol succesvol geweest met zo weinig als een incubatie van één uur, vergelijkbaar met die in Pringle et al. Ten tweede gebruiken we verschillende enzymen voor de spijsvertering van weefsels, met name we gebruiken geen trypsine zoals wordt gebruikt in het oorspronkelijke Tran et al.-Protocol, maar in plaats daarvan een mengsel van dispase en Collagenase gebruiken. We voorkomen dat trypsine in de eerste digestie stappen als een recente studie suggereerde dat de initiële vertering van het speeksel weefsel door trypsine resulteert in verminderde levensvatbaarheid van de cel, mogelijk door het verlies van een zeldzame stamcel populatie¹⁵. Ten slotte cultuur we de salispheres op het oppervlak van de kelder membraan matrix (BMM) met behulp van een commercieel beschikbare media oorspronkelijk geformuleerd voor de voortplanting van bronchiale epitheelcellen. Ons protocol kan worden gebruikt om speeksel cellen te isoleren van parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Deze cellen Express speeksel amylase en andere speeksel specifieke genen die erop wijzen dat ze een fenotype vergelijkbaar met dat van speeksel acineuze epitheelcellen⁷. We hebben met succes speeksel culturen gegenereerd uit > 50 primaire menselijke weefselmonsters met behulp van deze methodologie. Bovendien kunnen de primaire speeksel cellen gemakkelijk worden cryopreserved voor gebruik op een later tijdstip.

Protocol

Deze protocollen en studies zijn beoordeeld en goedgekeurd door de institutioneel Review Board van de Universiteit van Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, IRB protocol 2016-4183). Speeksel weefsel wordt gewoonlijk in veel hoofd-en nekchirurgische ingrepen door de hand gelopen en is meestal niet betrokken bij het maligne proces. Normaalgesproken wordt na verwijdering van de patiënt (Figuur 1a) binnen 2-4 h een vers verwijderd speekselklier weefsel gebruikt.

1. bereiding van het reagens

1. Bronchiale epitheliale celgroei medium (BEGM)
   1. Voeg onderdelen uit de door de fabrikant geleverde Kit toe (Zie de tabel met materialen).
   2. Was elke buis één keer met de basismedia om volledige overdracht van componenten te garanderen. Voeg vervolgens houtskool gestript foetaal runderserum toe om een uiteindelijke concentratie van 4% serum te maken.
2. Rode bloedcel (RBC) lysisbuffer
   1. Voeg, om 10x voorraad te maken, 40,15 g NH₄Cl, 5,0 g NaHCO₃en 0,186 g ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) toe en breng tot een eindvolume van 200 ml met DH₂O. Filter vervolgens steriliseren en bewaren bij 4 °C.
   2. Verdun tot een werkconcentratie van 1x in steriele dH₂O vóór gebruik.
3. Dissociatie oplossing
   1. Naar een flesje van 100 mL dispase (Zie de tabel met materialen) Voeg 0,15 g Collagenase type III toe. Nadat Collagenase volledig is opgelost, steriliseren filter de nieuwe oplossing en aliquot. Bewaren bij-20 °C.

2. weefsel spijsvertering

1. Met behulp van een 100 mm weefselcultuur plaat, mechanicallymince het weefsel in fijne stukken ~ 1-2 mm in grootte met behulp van autoclaaf gesteriliseerde ontleden schaar en chirurgische Tang (Figuur 1b,C). Bindweefsel tussen stukken moet worden gesneden om een goede scheiding en gemak in verdere stappen te garanderen.
2. Voeg 6 mL van de dispase/Collagenase-oplossing toe aan het fijngehakte weefsel. Inincuberen bij 37 °C gedurende ongeveer 30 minuten tot 1 uur.
3. Ontwer het weefsel door pipetteren met een serologische Pipet van 5 mL 15-20 keer.
4. Inincuberen bij 37 °C voor nog eens 30 min tot 1 uur.
5. Herhaal de stappen 2,3 en 2,4 tweemaal drie keer of totdat het weefsel lijkt op een slurry en gemakkelijk de pipet opening kan passeren (figuur 1d).
   Opmerking: De begingrootte van het weefsel specimen en hoe fijnheid van de weefsel gehakt zal bepalen hoe vaak men de stappen 2,3 en 2,4 moet herhalen. Meestal ontvangen we weefsel ongeveer 1 cm x 1 cm groot. Daarnaast kan men weefsel dissociatie bewaken met behulp van een standaard omgekeerde weefselkweek Microscoop om de voortgang van celdissociatie van het weefsel te volgen. Kleine clusters van cellen zijn ideaal voor initiële uitgroei van speeksel cellen als salispheres.

3. coating putten met kelder membraan matrix

Opmerking: de kelder membraan matrix (BMM) moet 's nachts op 4 °C worden ontdooid op de dag voordat deze wordt gebruikt. Eenmaal ontdooid, moet BMM constant worden gehandhaafd op ijs of op 4 °C, omdat het snel stollen (d.w.z. een gel vormen) bij warmere temperaturen. Bovendien moet worden gezorgd als monsters zijn gekoeld op ijs voorafgaand aan het beplating op BMM als koude monsters zal "smelten" de BMM en bloot cellen aan de plastic schotel.

1. Pipetteer langzaam BMM (Zie de tabel met materialen) in elk goed om te worden gecoat. Gelijkmatig en langzaam verdelen de BMM over de put.
   Opmerking: over het algemeen gebruiken we 500 μL per stuk van een zes-waterput, maar dit volume kan worden aangepast voor gebruik op andere varianten van platen zoals 12-well of 24-Well, of zoals gewenst voor dikkere of dunnere hydrogels.
2. Inincubeer de gecoate platen bij 37 °C gedurende ten minste 15 minuten vóór gebruik, zodat de BMM-tijd kan stollen.

4. filtreren van onverteerd weefsel, RBC lysis en celplating

1. Overdracht weefsel homogenaat van stap 2,5 naar een conische buis van 15 mL. Was één keer met 6 mL van Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) om de resterende cellen over te brengen.
2. Filtreer het homogenaat in een conische buis van 50 mL door middel van een 70 μm nylon mesh Cell zeef om onverteerd weefsel te verwijderen. Centrifugeer cellen gedurende 5 min bij 500 x g.
3. Verdun 10x RBC lysisbuffer in steriele dH₂O om een 1x werkoplossing te maken.
4. Aspireren het supernatant. Breng vervolgens de celpellet in 10 mL van 1x RBC lysisbuffer. Inincuberen gedurende 5 min bij 37 °C.
5. Voeg 20-25 mL DPBS toe om de RBC lysisbuffer te neutraliseren en Lysis van de speeksel cellen te minimaliseren. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
   Opmerking: na behandeling met de RBC lysisbuffer moet de celpellet wit zijn. Rode kleur in de pellet geeft aan dat niet alle RBC volledig lysed zijn geweest. Herhaal stap 4,4 tot en met 4,5 indien nodig voor volledige lysis van alle RBC.
6. Aspireren het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1-2 mL BEGM per putje en plaats vervolgens de herhangende cellen op BMM gecoate putten. Incuberen bij 37 °C.
7. Eenmaal verguld op BMM, cellen zullen vormen in sferische structuren of "salispheres" over een periode van 2-3 dagen. Cellen kunnen worden gehandhaafd als salispheres voor ongeveer 5-7 dagen voordat de BMM begint te degraderen waardoor de cellen te openen en te hechten aan het plastic en groeien als een monolayer.

5. subculturing van de salispheres en onderhoud op BMM

1. Aspirate media uit putten, voeg vervolgens 1 mL dispase/Collagenase oplossing aan elk putje en inbroed bij 37 ° c voor ~ 15 min of tot BMM is meestal opgelost.
2. Breng cellen over naar een conische buis van 15 mL en spoel de putjes eenmaal met DPBS om de resterende cellen te verkrijgen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
3. Aspireren het supernatant. Hervat de pellet in 2 mL trypsine en inincuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten.
4. Neutraliseer de trypsine met behulp van alle volledige media die 10% serum bevatten. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
5. Aspireren het supernatant. Respendeer de cellen in DPBS om rest media, trypsine en serum te verwijderen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
6. Aspireren het supernatant. Resuspendeer in BEGM en plaat de geredigeerde cellen op gestijde BMM gecoate cultuur gerechten. Resuspendeerde cellen kunnen ook direct worden geplateerd op celcultuur behandeld gerechten voor proliferatie als een monolayer. Voor meer informatie over de groei van speeksel cellen als monolayer, zie rubriek 6. Cellen geteeld op BMM of op plastic moeten worden gevoed met verse BEGM elke 2 – 3 dagen.
7. Cultuur de cellen in een bevoficeerde incubator onderhouden bij 37 °C met 5% CO₂.

6. subculturing de salispheres op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten

Opmerking: als u cellen als een monolaag op plastic onderhoudt, begint u bij deze stap. Het volgende protocol is van toepassing op cellen die groeien in een schaal van 100 mm.

1. De media te aspireren. Was één keer met DPBS om rest media te verwijderen.
2. Voeg 2 mL trypsine toe en inincuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten, of totdat de cellen volledig zijn losgemaakt.
3. Neutraliseer trypsine met behulp van 4 mL van alle volledige media die 10% serum bevatten. Breng cellen over in een conische buis van 15 mL.
4. Was de plaat één keer met ongeveer 5 mL DPBS om de resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
5. Aspireren het supernatant. Respendeer cellen in 6-10 mL DPBS om rest media te verwijderen.
6. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
7. Aspireren de supernatant en respenderen in BEGM. Plaat cellen op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten. Voer elke 2-3 dagen met verse BEGM.
8. Cultuur de cellen in een bevoficeerde incubator onderhouden bij 37 °C met 5% CO₂.

7. cryopreservering van cellen

Opmerking: cryopreservering van cellen kan worden bewerkstelligd door een enkele celsuspensie die afkomstig is van ofwel salisphere of monolaag gekweekte cellen.

1. Tel de cellen op een hematocytometer om de totale hoeveelheid aanwezige cellen te berekenen.
2. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
3. Aspireren het supernatant. Respendeer de pellet in BEGM met 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Concentratie van cellen moet 2 x 10⁶ cellen/ml tot 10 x 10⁶ cellen/ml.
4. Aliquot cellen in steriele cryogene opslag buizen. Plaats de buisjes in een geïsoleerde schuimrek en inincuberen bij-80 °C 's nachts om de cellen langzaam te bevriezen.
5. Op de volgende dag, plaats buizen in vloeibare stikstof voor lange termijn opslag.
   Opmerking: cellen moeten snel ontdooid worden bij 37 °C. Bij het ontdooien moeten de cellen worden omhuld met 500 x g en de DMSO-bevattende media vóór het beplating worden verwijderd.

Resultaten

Twee-drie dagen na het plating van cellen van verteerd weefsel op BMM, cellen zullen gemakkelijk vormen kleine clusters die zullen blijven uitbreiden in grootte tot 15-20 cellen per cluster (Figuur 2a). Cellulaire puin en losgekoppelde dode cellen worden meestal gezien en moeten worden verwijderd door aspireren en aanvullen met verse media. Cellen zullen blijven prolifereren als salispheres voor over 3-10 dagen, of zolang de BMM laag intact blijft. Af en toe,...

Discussie

Speeksel dysfunctie is een zorg voor de kwaliteit van leven voor mensen die lijden aan het syndroom van Sjögren, evenals degenen die radiotherapie ondergaan voor kankers naast de speekselklieren^3,4,^{5, 16}. Een voorgestelde therapie voor de behandeling van deze patiënten is om te groeien functionele speeksel stamcellen of organoïden in vitro, die vervolgens kunnen worden ingebracht in beschadigd...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 mm kweekschalen	Thermo Scientific	172931
15 mL conische buizen	Thermo Scientific	339651
50 mL conische buizen	Thermo Scientific	339653
Bronchiale Epitheelcel Groeimedia	Lonza	CC-3171	Voeg bullet kit toe volgens de instructies van de fabrikant. Supplement met 20 mL geactiveerde koolstof gestript serum.
Celzevener 70 µm nylon gaas	Fisher	22-363-548
Geactiveerde koolstof gestript foetaal bovien serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Bewaar bij 4 °C.
Cryogene buis	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Los collagenase op om een 0,15% (w/v) stock oplossing te maken. Filter sterieel en bewaar bij -20 °C.
Dissectie schaar	Fisher	08-940
Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing	Corning	55-031-PC
Algemene chemicaliën	Sigma
PathClear Basaalmembraan extract	Cultrex	3432-005-01	Ontdooi bij 4 °C ten minste 24 uur voor gebruik. Altijd hanteren op ijs.
Zes-well kweekschalen	Falcon	353046
Chirurgische pincet	Fisher	22-079-742
Trypsine-EDTA oplossing	Corning	25-052-CI