Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft methoden voor de vaststelling van de patiënt afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen en primaire kanker cellijnen van chirurgische maagkanker monsters. De methoden bieden een nuttig instrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en Kankerbiologie onderzoek.

Samenvatting

Het gebruik van preklinische modellen om ons begrip van de tumor biologie te leren en de werkzaamheid van therapeutische middelen te onderzoeken is de sleutel tot kankeronderzoek. Hoewel er veel gevestigde maagkanker cellijnen en vele conventionele transgene muismodellen voor preklinisch onderzoek, de nadelen van deze in vitro en in vivo modellen beperken hun toepassingen. Omdat de kenmerken van deze modellen zijn veranderd in de cultuur, ze niet langer model tumor heterogeniteit, en hun reacties zijn niet in staat om reacties te voorspellen bij de mens. Zo worden alternatieve modellen ontwikkeld die een betere tumor heterogeniteit vormen. Patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen behouden de histologische verschijning van kankercellen, behouden intratumoreel heterogeniteit, en beter weerspiegelen de relevante menselijke componenten van de tumor micro omgeving. Het duurt echter meestal 4-8 maanden om een PDX-model te ontwikkelen, dat langer is dan het verwachte voortbestaan van veel maag patiënten. Om deze reden, het opzetten van primaire kanker cellijnen kan een effectieve complementaire methode voor drug Response studies. Het huidige protocol beschrijft methoden voor het vaststellen van PDX-modellen en primaire kankercellijnen van chirurgische maagkanker monsters. Deze methoden bieden een nuttig instrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en Kankerbiologie onderzoek.

Inleiding

Maagkanker is de vijfde meest voorkomende kanker wereldwijd en de derde belangrijkste oorzaak van kanker dood. In 2018 werden wereldwijd meer dan 1.000.000 nieuwe gevallen van maagkanker gediagnosticeerd en werden naar schatting 783.000 mensen gedood door deze ziekte¹. De incidentie en sterfte van maagkanker blijft zeer hoog in Noordoost-Aziatische landen^2,3. Ondanks aanzienlijke vooruitgang op het gebied van kanker therapeuten, blijft de prognose van patiënten met gevorderde maagkanker slecht, met een overlevingspercentage van vijf jaar van ongeveer 25%^{4,5,6, 7,}. Er is dus dringend behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor maagkanker

De behandeling van maagkanker is een uitdaging vanwege de hoge heterogeniteit^8,9. Zo is de vraag hoe de uitdagingen van tumor heterogeniteit aan te pakken om precisie geneeskunde te realiseren centraal in kankeronderzoek. In vitro en in vivo modellen spelen cruciale rollen in het verhelderend zijn van de heterogene mechanismen en biologie van maagkanker. Echter, hoewel er tal van maagkanker cellijnen en vele conventionele transgene muismodellen voor preklinisch onderzoek, de nadelen van deze modellen beperken hun toepassingen¹⁰. Omdat de kenmerken van deze modellen zijn veranderd in de cultuur, ze niet langer model tumor heterogeniteit, en hun reacties zijn niet in staat om reacties te voorspellen bij de mens¹¹. Deze kwesties beperken de mogelijkheid van het identificeren van subgroepen van kankerpatiënten die zullen reageren op gerichte drugs. De korte-termijn cultuur van primaire tumoren biedt een relatief snelle en gepersonaliseerde manier om te onderzoeken antikanker farmacologische eigenschappen, die waarschijnlijk het kenmerk van gepersonaliseerde kankerbehandeling zal zijn.

Patiënt-afgeleide xenotransplantaten (pdxs) hebben de voorkeur als een alternatief preklinisch model voor drug Response profilering¹². Daarnaast bieden PDX-modellen een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de initiatie en progressie van kanker^13,14. PDX-modellen behouden het histologische uiterlijk van kankercellen, behouden de intratumoral heterogeniteit en weerspiegelen beter de relevante menselijke componenten van de tumor micro omgeving^15,16. De beperking van de veelgebruikte PDX-modellen is echter het lage slagingspercentage voor het vaststellen en serieel propageren van menselijke solide tumoren. In deze studie worden fatsoenlijk succesvolle methoden voor het opzetten van PDX-modellen en primaire cellijnen beschreven.

Protocol

Deze menselijke studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische Review Board van Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, China). De dierenstudie werd goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Sun Yat-sen universiteit. Opmerking: alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante wetten en institutionele richtlijnen, met inbegrip van de richtlijn voor bescherming van beroepsmatige blootstelling tegen door bloed overgedragen pathogenen.

1. monstervoorbereiding

1. Verkrijg maagkanker weefsels (P0 = passage 0) rechtstreeks uit de operatie. Het tumor preparaat moet groter zijn dan 0,5 cm³.
2. Bereid 3-4 mL stockoplossing voor: bijvoorbeeld RPMI-1640 medium (1x) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U/mL penicillaire en 0,1 mg/mL streptomycine.
3. Plaats de verse tumor specimen in de Stock-oplossing bij 4 °C gedurende niet meer dan 4 uur.

2. vaststelling van het PDX-model (Figuur 1)

1. Desinfecteer alle materialen met ultraviolet licht gedurende meer dan 30 minuten voordat deze in het dier laboratorium worden gebracht om een steriel chirurgische gebied te garanderen.
   Opmerking: de operatiekamer moet gedurende 30 minuten met ultraviolet licht worden gedesinfecteerd, voordat we het Bureau reinigen met dichloor isocyanurinezuur natrium zetpillen ontsmettingsmiddel. Dan Povidon-jodium wordt gebruikt om de huid te desinfecteren.
2. Met behulp van Tang en schaar, zorgvuldig ontleden de tumorweefsels en trim ze in verschillende kleine stukjes (ongeveer 1 mm³ blokjes) onder steriele omstandigheden.
3. Anesthetize vrouwelijke 5-tot 7-week-oude NOD-scid-IL2rg (NSG) muizen door blootstelling aan 1-1.5% Isofluraan met een anesthesie machine.
   1. Anesthetiseer de muis totdat het stopt met worstelen, maar handhaaft zelfs de ademhaling.
      Opmerking: de 50 mL buis is een eenvoudige apparatuur die vergelijkbaar is met een anesthesie machine functioneert. Het gebruik van veterinaire oogzalf om droogheid te voorkomen is onnodig vanwege de korte werkingstijd.
4. Maak een 1 cm incisie op beide rugflanken met behulp van een steriele schaar, en implantaat een tumor stuk in elke flank van de muis.
   1. Gebruik de steriele tang om het onderhuidse weefsel te verstoren om ervoor te zorgen dat het tumor stuk niet uitglijdt. Vervolgens, clip een stukje van het tumorweefsel, en plaats het in de diepe site.
5. Sluit het implantaat gebied door subcutane hechting met chirurgische hecht naalden, en markeer de muis oren met gelabelde oormerken
6. Steriliseren de wond met jodium.
7. Plaats de muizen na de operatie zachtjes in een lege kooi met behoud van de borstbeen-recumbency. Aandacht besteden aan de toestand van de muizen; ze worden wakker en beginnen ongeveer 3-4 minuten later te lopen. Plaats muizen die een operatie ondergaan in een andere nieuwe kooi gescheiden van die niet onderworpen aan chirurgie.
8. De grootte van de tumor beoordelen door palpatie van de implantatieplaats. Meet twee keer per week de tumoren met een Vernier remklauw.
9. Zodra de tumor bereikt 10 mm in diameter, de toestand van het dier verslechtert, of de tumor zweren, euthanaseren de muis met een IRB goedgekeurde methode. Reimer planten geoogst verse tumor fragmenten in 2 nieuwe muizen voor het doorvoeren, of de specimens tijdelijk op te slaan in PBS op ijs voor de isolatie van primaire cellijnen.

3. weefsel cryopreservatie

Opmerking: dit deel verwijst voornamelijk naar de methoden voor de Live tissue Kit Cryo Kit. De belangrijkste kits en apparatuur staan vermeld in de tabel met materialen.

1. Euthanaseren de muizen met een IRB-goedgekeurde methode wanneer de tumor groter is dan 10 mm in diameter.
2. Met behulp van steriele Tang en schaar, Isoleer langzaam de tumor van de muizen.
3. Was de tumorweefsels met DPBS in een 10 cm schaal. Ontleden en verwijderen van necrotische gebieden, vetweefsel, bloedstolsels en bindweefsel met een tang en een schaar.
4. Snijd de tumorweefsels tot een maximale dikte van 1 mm met een mal.
5. Was de sneetjes met DPBS in een 10 cm schaal.
   Opmerking: het vitrificatie proces omvat het gebruik van buizen met het label v1/v2/v3 in stappen 3.6-3.8. De belangrijkste ingrediënten zijn DMSO en sucrose.
6. Breng de plakjes in buis v1 met een tang, en inbroed de buis bij 4 °C gedurende 4 min. rol en Inverteer de buis kort, en plaats deze bij 4 °C voor nog eens 4 min.
7. Giet de V1-oplossing en plakjes in een 10 cm schaal. Breng de segmenten in tube v2 met een tang en inbroed de buis v2 bij 4 °C gedurende 4 min. rol en Inverteer de buis kort, en plaats deze bij 4 °C voor nog eens 4 min.
8. Giet de v2-oplossing en plakjes in een schotel van 10 cm. Breng de plakjes in buis V3 met een tang, en inbroed de buis bij 4 °C gedurende 5 min. rol en Inverteer de buis kort, en plaats deze bij 4 °C gedurende ten minste 5 min. Zorg ervoor dat de segmenten alle naar de onderkant van de buis zinken.
   1. Als meerdere sneetjes blijven zweven, rol en Inverteer de buis kort, en plaats de buis op 4 °C totdat alle plakjes volledig zinken; Gooi indien nodig de zwevende segmenten weg.
9. Giet de V3-oplossing en plakjes in een schaal van 10 cm.
10. Snijd de weefsel houders op de juiste lengte en plaats ze op steriel gaas. Breng de segmenten over naar de houders. Wikkel de houders met het gaas en plaats ze in vloeibare stikstof met behulp van een tang, gevolgd door incubatie gedurende 5 minuten.
11. Label de cryogene flesjes met de weefsel informatie.
12. Breng de houders met weefsel segmenten in cryogene flesjes, die zijn opgeslagen in vloeibare stikstof.

4. isolatie van primaire cellen (Figuur 2)

1. Steriliseer de Tang en schaar met hogedruk stoom bij 121 °C gedurende 30 minuten.
2. De monsters van maagkanker opnieuw in de vorm van geoogste specimens of verkregen PDX-weefsels. Leg de weefsels op het ijs en breng de weefsels vervolgens over in een steriele kweek schaal van 10 cm.
3. Ontleden en verwijderen van necrotische gebieden, vetweefsel, bloedstolsels en bindweefsel met een tang en een schaar.
4. Was de tumorweefsels eenmaal met DPBS met 100 U/mL penicillaire en 0,1 mg/mL streptomycine in een 10 cm schaal.
5. Snijd het tumorweefsel in 1 mm³ stukken op het deksel van het Gerecht; de maximale dikte van elk stuk moet 1 mm zijn.
6. Breng de weefsels over in een centrifugebuis van 50 mL met ongeveer 7 mL type 1 Collagenase-en trypsine-oplossing (1:14). Vortex het mengsel kort.
7. Inbroed de buis in een waterbad bij 37 °C gedurende 30-40 min. Vortex het mengsel elke 5 min.
8. Voeg een gelijk volume RPMI-1640 medium (1x) toe, aangevuld met 10% FBS aan de buis. Vortex het mengsel grondig.
9. Breng het mengsel over in een nieuwe centrifugebuis van 50 mL door een langzame filtratie door een 40 μm filter.
   Opmerking: gebruik 40 μm filters om een hogere verhouding van kankercellen te garanderen. Indien nodig kunnen 100 μm filters worden gebruikt om meer soorten cellen te behouden, zoals immunologische cellen.
10. Centrifugeer het filtraten op 113-163 x g voor 5-7 min bij RT. Verwijder voorzichtig het supernatant.
11. Was de pellet met 5 mL PBS en verwijder voorzichtig het supernatant.
12. Als de pellet rood is, bevat het veel erytrocyten. Breng de pellet voorzichtig met 500 μL rode bloedcel lysis buffer in. Voeg na een incubatie van 5 minuten 5 mL PBS toe en verwijder het supernatant voorzichtig.
13. Respendeer de pellet met kweekmedium en breng het mengsel over naar een steriele 10 cm schaal.
14. Vervang het medium elke 2-3 dagen door een serum met een medium.
15. Passage de primaire cellen met trypsine/EDTA wanneer ze bereiken 50% samenvloeiing.

Resultaten

Hier, tumorweefsels uit een operatie werden bewaard in stockoplossing tot de volgende stap. Binnen 4 uur, tumorweefsels werden in kleine stukjes gesneden en geïmplanteerd in de rugflanken van NSG muizen die waren verdoven met behulp van isoflurane-geweekte katoen. Tumoren groter dan 1 cm³ kunnen worden geperfectioneerd voor implantatie in nieuwe muizen (Figuur 1) of zorgvuldig worden gesneden en bewaard in vloeibare stikstof na het protocol. In deze studie, de eerste generatie tum...

Discussie

Maagkanker is een agressieve ziekte met beperkte therapeutische opties; zo zijn modellen van maagkanker een kritieke bron geworden om functionele onderzoeken mogelijk te maken met directe vertaling naar de kliniek^4,8,17. Hier, we hebben beschreven de methoden en het Protocol van de oprichting van maagkanker PDX modellen en primaire cellijnen. Belangrijk is dat zowel de morfologische als de biologische eigenschappen van maagkanke...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
40 μm Cell Strainer	Biologix, Shandong, China	15-1040
Biologische microscoop	OLYMPUS, Tokyo, Japan	OLYMPUS CKX41
Centrifuge	Eppendorf, Mittelsachsen, Duitsland	5427R
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghai, China	L40601
Elektro-thermostatische waterkast	Yiheng, Shanghai, China	DK-8AXX
Fetaal bovien serum	Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada	86150040
Isofluraan	Baxter, China	CN2L9100
Cryo-kit voor levend weefsel	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2601
Ontdooi-kit voor levend weefsel	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2602
NSG	Biocytogen, Beijing, China	B-CM-002-4-5W
Penicilline & streptomycine	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	15140122
Rode bloedcel lysis buffer	Solarbio, Beijing, China	R1010
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	8118367
Chirurgische heennaalden met draad	LingQiao, Ningbo, China	3/8 boog 4×10
Vormen en hulpmessen voor weefselverwerking	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	2003779
Type 1 collageenase	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	17100017