Methodenartikel

Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

DOI:

10.3791/59873

⸱

14 augustus 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Groupe Hospitalier Sud, Hospices Civils de Lyon, 2Circulating Cancer (CIRCAN) Program, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 3University of Lyon, Claude Bernard University, Cancer Research Center of Lyon, 4Biolidics Limited, 5Institut de Pathologie Multisites des HCL-Site Sud, Hospices Civils de Lyon, 6Acute Respiratory Disease and Thoracic Oncology Department, Lyon Sud Hospital, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 7EMR-3738 Therapeutic Targeting in Oncology, Lyon Sud Medical Faculty, Lyon 1 University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De karakterisering van circulerende tumorcellen (Ctc's) is een populair onderwerp in translationeel onderzoek. Dit protocol beschrijft een semiautomatische immunofluorescentie (IF)-test voor PD-L1-karakterisering en inventarisatie van Ctc's in niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-patiënt monsters.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulerende tumorcellen (Ctc's) afgeleid van de primaire tumor worden vergoten in de bloedbaan of lymfatisch systeem. Deze zeldzame cellen (1 − 10 cellen per mL bloed) rechtvaardigen een slechte prognose en zijn gecorreleerd met een kortere totale overleving in verschillende kankers (bijv. borst, prostaat en colorectale). Momenteel is het met anti-EpCAM gecoate, op magnetische kraal gebaseerde CTC-opnamesysteem de gouden standaard test die is goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor het inventariseren van Ctc's in de bloedbaan. Deze test is gebaseerd op het gebruik van magnetische kralen bekleed met anti-EpCAM markers, die specifiek gericht zijn op epitheliale kankercellen. Veel studies hebben aangetoond dat EpCAM niet de optimale marker is voor CTC-detectie. Inderdaad, Ctc's zijn een heterogene subpopulatie van kankercellen en kunnen een epitheliale-naar-mesenchymale overgang ondergaan (EMT) in verband met gemetastaseerde proliferatie en invasie. Deze Ctc's zijn in staat om de expressie van celoppervlak epitheliale marker EpCAM verminderen, terwijl het verhogen van mesenchymale markers zoals vimentin. Om deze technische hindernis aan te pakken, zijn er andere isolatie methoden ontwikkeld op basis van fysische eigenschappen van Ctc's. Microfluïdische technologieën maken een etiket vrije benadering van CTC-verrijking van volledige bloedmonsters mogelijk. De spiraalvormige microfluïdische technologie maakt gebruik van de inertiële en Dean Sleep krachten met continue stroming in gebogen kanalen gegenereerd binnen een spiraal microfluïdische chip. De cellen worden gescheiden op basis van de verschillen in grootte en plasticiteit tussen normale bloedcellen en tumorale cellen. Dit protocol Details de verschillende stappen om de geprogrammeerde Death-ligand 1 (PD-L1) expressie van CTCs te karakteriseren, waarbij een spiraal microfluïdisch apparaat wordt gecombineerd met aanpasbare immunofluorescentie (IF) marker set.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumor antigen-specifieke cytotoxische T-lymfocyten (Ctl's) spelen een cruciale rol in de reactie op kanker door middel van een proces dat bekend staat als kanker "immuun surveillance". Hun anti-tumor functies worden versterkt door immuun Checkpoint blokkade antilichamen zoals CTLA-4 remmers en PD-1/PD-L1-remmers. Bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) resulteren anti-PD-1/PD-L1 therapieën in responspercentages variërend van 0%-17% bij patiënten met PD-L1-negatieve tumoren en 36%-100% in degenen die PD-L1 uitdrukken. De robuuste responsen op PD-1/PD-L1-blokkade waargenomen bij melanoom en NSCLC worden aangetoond door het bewijs van een verbeterde algehele responsratio (RR), duurzame klinische voordelen en progressievrije overleving (PFS). Momenteel zijn anti-PD1 behandelingen de standaard van de zorg in de tweede-lijn NSCLC behandeling met nivolumab ongeacht PD-L1 expressie en met pembrolizumab bij patiënten die PD-L1 ≥ 1% uitdrukken. In de eerstelijnsbehandeling is de standaard van de zorg pembrolizumab alleen bij patiënten met nsclc die pd-L1 ≥ 50% uitdrukken en kunnen worden verhoogd met chemotherapie (Platin en Doublet medicijn afhankelijk van het histologische subtype)1,2.

Echter, een dergelijke benadering van het beheer van de patiënt is discable3, aangezien PD-L1 expressie in tumorcellen door immunohistochemie (IHC) is waarschijnlijk niet de meest ideale metgezel biomarker. Anderen zoals tumor mutatie last4 (TMB), microsatellietinstabiliteit (MSI) en/of microbiota zijn mogelijk interessant in deze setting, alleen of in combinatie. NSCLC staat bekend als heterogene tumoren, ofwel ruimtelijk (van een tumor site naar een andere) of tijdelijk (van diagnose tot herhaling). Patiënten met NSCLC zijn meestal kwetsbaar, en iteratieve invasieve weefsel biopsieën kunnen een probleem zijn. Inderdaad, re-biopsie tarief bij eerste progressie varieert van 46%-84% afhankelijk van de reeks, en succesvolle re-biopsie (betekenis met histologische en volledige moleculaire analyse) varieert van 33%-75%. Dit betekent dat 25%-67% van de patiënten geen uitgebreide re-biopsie-analyse kan ontvangen tijdens de eerste progressie5,6,7,8.

De komst van "Liquid biopsies" heeft dus veel enthousiasme gegenereerd in deze specifieke setting, omdat het cruciale herbeoordeling van moleculaire veranderingen tijdens ziekteprogressie mogelijk maakt door het onderzoeken van Circulerend vrij DNA (cfDNA) afgeleid van circulerende tumorcellen (Ctc's). Deze levende cellen worden vrijgelaten uit de tumor in de bloedbaan, waar ze vrij circuleren. Hoewel niet routinematig gebruikt, lijkt de analyse van Ctc's veelbelovend te zijn in het geval van moleculaire en fenotypische karakterisering, prognose en voorspellende betekenis bij longkanker (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna en eiwitanalyse). Inderdaad, Ctc's haven waarschijnlijk fenotypische kenmerken van de actieve ziekte in plaats van de initiële markers (gedetecteerd op weefsel biopsieën bij de diagnose). Bovendien, Ctc's omzeilen het probleem van de ruimtelijke heterogeniteit van het tumorweefsel, die een cruciale kwestie in kleine biopsieën kan zijn. Bijgevolg kan PD-L1-expressie op Ctc's mogelijk licht werpen op de verschillen die voortvloeien uit het gebruik ervan als een voorspellende biomarker met behulp van tumorweefsel.

Onlangs is PD-L1 Expression getest in Ctc's van NSCLC. Bijna alle geteste patiënten9 waren PD-L1 positief, compliceren de interpretatie van het resultaat en het klinisch gebruik ervan. In totaal werden PD-L1-positieve Ctc's gedetecteerd in 69,4% van de monsters van gemiddeld 4,5 cellen/mL10. Na aanvang van de radiotherapie nam het aandeel PD-L1-positieve Ctc's significant toe, wat duidt op de upregulatie van PD-L1-expressie in reactie op straling11. Daarom kan PD-L1 CTCs-analyse worden gebruikt om dynamische veranderingen van de tumor en de immuunrespons te monitoren, die de respons op chemotherapie, straling en waarschijnlijke immunotherapie (IT)-behandelingen kunnen weerspiegelen.

Tot op heden zijn de ctcs-isolatie en de PD-L1-karakterisering afhankelijk van verschillende methoden, zoals anti-epcam gecoate, op magnetische kraal gebaseerde CTC-vastlegging, verrijkings vrije analyse en op maat gebaseerde12,13 CTC-opname testen. Ctc's werden echter alleen gedetecteerd bij 45%-65% van de patiënten met gemetastaseerde NSCLC, waardoor hun vermogen om informatie te verstrekken voor meer dan de helft van gemetastaseerde NSCLC-patiënten werd beperkt. Bovendien was de CTC-telling laag in de meeste van deze onderzoeken met behulp van op grootte gebaseerde benadering10. Bovendien, deze methode heeft geleid tot discrepanties zoals de detectie van CD45 (-)/DAPI (+) cellen met "cytomorphological patronen van maligniteit" in de bloedbaan van gezonde donoren. Deze zorgen wijzen op de noodzaak van een zeer gevoelige methode van CTC-verzameling in verband met immuun-fenotyping van atypische CD45 (-) cellen van gezond volbloed met behulp van extra kanker biomarkers (d.w.z. TTF1, Vimentin, EpCAM en CD44) in NSCLC.

Daarom evalueerden we een spiraal microfluïdisch apparaat dat inertiële en Dean Sleep krachten gebruikt om cellen te scheiden op basis van grootte en plasticiteit door middel van een microfluïdische chip. De vorming van Dean Vortex stroomt in de microfluïdische chip resulteert in grotere Ctc's gelegen langs de binnenwand en kleinere immuuncellen langs de buitenste wand van de chip. Het verrijkingsproces wordt voltooid door de grotere cellen in de opvang uitlaat te sibellen als de verrijkte CTC-Fractie. Deze methode is bijzonder gevoelig en specifiek (detectie van ongeveer 1 CTC/mL volbloed)14 en kan worden geassocieerd met aangepaste immunofluorescentie (if) analyses. Deze instrumenten zullen het opzetten van een positieve drempel voor klinische interpretatie mogelijk maken. Zo wordt een workflow beschreven die biologen in staat stelt om ctc's met een hoge mate van terugwinning en specificiteit te isoleren en aspecten. Het protocol beschrijft het optimale gebruik van het spiraal microfluïdische apparaat om Ctc's te verzamelen, de geoptimaliseerde IF-testen die kunnen worden aangepast aan het type kanker, en het gebruik van gratis open-source software voor het meten en analyseren van celafbeeldingen om een semi-automatische de numatie van de cellen volgens fluorescerende kleuring. Bovendien kan multiplexen van de Microscoop worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal beschikbare fluorescerende filters/markers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monsters werden prospectief verzameld in het kader van de CIRCAN ("circulerende kanker") cohort in het universitair ziekenhuis van Lyon na schriftelijke toestemming van de patiënt. Deze studie werd geïntegreerd in de CIRCAN_ALL cohort. De studie CIRCAN_ALL werd erkend als niet-Interventioneel door de CPP Zuid-Oost IV gedateerd 04/11/2015 onder de referentie L15-188. Een gewijzigde versie werd erkend als niet-Interventioneel op 20/09/2016 onder referentie L16-160. De CIRCAN_ALL studie werd verklaard aan de correspondent voor IT en vrijheid van de Hospices civils de Lyon op 01/12/2015, onder de referentie 15-131. Bloedafname werd uitgevoerd wanneer artsen de vroegste indicatie van de progressie van de tumor waargenomen.

Opmerking: Gebruik alle reagentia en materialen die zijn beschreven in de tabel met materialen met de respectieve opslagcondities voor pre-analytische monstervoorbereiding en immunofluorescentietest. Het vervangen van reagentia en/of het wijzigen van opslagcondities kan resulteren in een suboptimale test prestaties.

1. ontsmetting van spiraal Microfluïdisch apparaat

Opmerking: Ontsmetting van het spiraalvormige microfluïdische apparaat is een vereiste om alle immunofluorescentie achtergrond die wordt gegenereerd door besmetting met bacteriën te verwijderen, de cytomorfologie van Ctc's te verkennen en ze te kunnen onderscheiden van normale immuuncellen. Het protocol is geoptimaliseerd voor bloedmonsters verzameld in K2EDTA buizen binnen 6 h na bloed bemonstering en verrijkt met behulp van de spiraal microfluïdische apparaat in schone omstandigheden. Het gebruik van deze test voor andere soorten monsters (andere biologische vloeistoffen) kan extra optimalisatie vereisen. Dit decontaminatieprotocol moet eenmaal per week worden uitgevoerd.

  1. Bereiding van de reagentia
    1. Bereiding van de verdunnings vloeistof buffer
      1. Steriliseer 20 mL verdunnings additief reagens met een spuit filter van 0,22 μm en voeg direct toe aan 1 L 1x fosfaatbuffer Saline (PBS) Ultra-zuivere kwaliteit (tabel van materialen).
    2. Sterilisatie van reagentia en het ingangs stro
      1. Steriliseren de RBC lysis buffer en resuspensie buffer (RSB; Tabel met materialen) met behulp van een 0,22 μm spuit filter en voorraad in een nieuwe polypropyleen conische buis van 50 mL voor elke oplossing.
      2. Steriliseer het ingangs stro door bij kamertemperatuur (RT) voor 1 uur in het All-Purpose reinigings reagens (tabel van de materialen) te inbroed. Breng het rietje over naar het reinigingsmiddel op basis van Bleach (tabel met materialen) en INBROED bij RT gedurende 1 uur.
      3. Spoel de invoer stro tweemaal met steriele PBS voor 1 uur per stuk en bewaar de gesteriliseerde invoer stro in een chirurgisch steriele zak (tabel met materialen).
  2. Het decontamineren van de spiraal microfluïdische inrichting
    1. Desinfectie met behulp van het multifunctionele reinigings reagens
      1. Koppel de fles dop van het verdunningsmiddel los van de verdunnings poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef los te schroeven. Breng in een microbiologische veiligheidskast tot 250 mL multifunctionele reinigings reagens (tafel van de materialen) over in een nieuwe lege fles.
      2. Draai de fles dop en het stro van het verdunningsmiddel op de fles van 250 mL multifunctionele reinigings reagens onder een microbiologische veiligheidskast. Bevestig deze fles aan de verdunnings vloeistof poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef terug te schroeven.
      3. Overdracht tot 100 mL bleekmiddel (1% eindconcentratie; Tabel met materialen) de afvalcontainer die in de run Kit wordt geleverd (Figuur 1A).
      4. Laad een nieuw steriel invoer stro op het spiraalvormige microfluïdische apparaat (Inhoudsopgave) in de ingangspoort. Laad een nieuwe centrifugebuis van 50 mL in de ingangspoort. Laad een nieuwe centrifugebuis van 50 mL in de uitgangspoort.
      5. Ga verder met de Prime van de spiraal microfluïdische apparaat door te klikken op Prime op de spiraal microfluïdische apparaat (3 min). Verwijder de ingangs buis nadat de Prime is voltooid.
      6. Breng tot 15 mL multifunctionele reinigings reagens aan op een nieuwe centrifugebuis van 50 mL met een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast en bevestig de buis aan de ingangspoort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat.
      7. Controleer voordat u begint met lopen of de oplossing vrij is van overmatige luchtbellen. Als er bubbels aanwezig zijn, verwijder ze dan met een langzame aspiratie met een pipet.
      8. Laad een decontaminatie microfluïdische chip in het spiraalvormige microfluïdische apparaat. Run een programma 3 op de spiraal microfluïdische apparaat door te klikken op lopen en het selecteren van het programma 3 (31 min).
        Opmerking: het programma 3 van het spiraalvormige microfluïdische apparaat maakt een snelle verrijking van Ctc's in 31 minuten mogelijk.
      9. Ga verder met de reinigingsstap van het spiraalvormig microfluïdisch apparaat met behulp van het resterende volume van het multifunctionele reinigings reagens in de ingangs buis.
      10. Gooi de ingangs buis weg nadat de reinigingsstap is voltooid en laat de ingangs stro achter.
    2. Ontsmetting met behulp van het reinigingsmiddel op basis van bleekmiddel
      1. Koppel de multifunctionele reinigings reagensfles dop los van de verdunnings poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef los te schroeven. Breng in een microbiologische veiligheidskast tot 250 mL op bleekmiddel gebaseerde reinigingsmiddelen (tabel metmaterialen) in een nieuwe lege fles (Figuur 1a).
      2. Schroef de multifunctionele reinigings reagensfles en het stro op de fles met het reinigingsmiddel op basis van bleekwater onder een microbiologische veiligheidskast. Bevestig deze fles aan de verdunnings vloeistof poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef terug te schroeven.
      3. Breng tot 15 mL op bleekmiddel gebaseerde reinigingsmiddelen over in een nieuwe centrifugebuis-ingangs buis van 50 mL met behulp van een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast. Laad de ingangs positie van de centrifugebuis van 50 mL. Laad een lege buis in de uitgangspositie.
      4. Voordat de uitvoering wordt uitgevoerd, controleert u of het monster vrij is van overmatige luchtbellen en indien aanwezig, verwijdert u de bubbels door ze langzaam met een pipet te aspireren.
      5. Voerprogramma 3 uit door op uitvoeren te klikken en het programma 3 (31 min)te selecteren. Ga na de run direct naar de reinigingsstap met behulp van het resterende volume bleekmiddel op basis van de reinigingsmiddelen in de ingangs buis.
      6. Gooi de invoer-en uitvoer buizen weg.
    3. Spoel het spiraalvormige microfluïdische apparaat af.
      1. Koppel de dop van de reinigingsmiddelen op basis van bleekmiddel los van de verdunnings poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef los te schroeven. Breng in een microbiologische veiligheidskast het stro van de fles met het reinigingsmiddel op basis van bleekwater over in de nieuwe fles met de verdunnings vloeistof buffer. Schroef de fles op het spiraalvormige microfluïdische apparaat.
      2. Breng tot 15 mL gesteriliseerd water (tabel van materialen) over in een nieuwe 50 ml centrifugebuis ingangs buis met behulp van een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast. Laad de ingangs positie van de centrifugebuis van 50 mL. Laad een lege buis in de uitgangspositie.
      3. Voordat de uitvoering wordt uitgevoerd, controleert u of het monster vrij is van overmatige luchtbellen en indien aanwezig, verwijdert u de bubbels door ze langzaam met een pipet te aspireren.
      4. Voerprogramma 3 uit door op uitvoeren te klikken en het programma 3 (31 min)te selecteren. Ga na de run direct naar de reinigingsstap met behulp van het resterende volume gesteriliseerd water in de ingangs buis.
      5. Gooi de invoer-en uitvoer buizen weg.

2. onderhoud om de spiraal Microfluïdische apparaat bacterievrij te houden

Opmerking: Het routineonderhoud moet aan het eind van de dag worden uitgevoerd tijdens de laatste reinigingsstap.

  1. Breng tot 7 mL op bleekmiddel gebaseerde reinigingsmiddelen in de nieuwe centrifugebuis van 50 mL met behulp van een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast. Schroef de reinigings buis op basis van bleekmiddel in de ingangspoort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat.
  2. Voordat de Clean run wordt verwerkt, controleert u of het invoer monster vrij is van overmatige luchtbellen en indien aanwezig, verwijdert u de bubbels door ze langzaam met een pipet te aspireren.
  3. Voer de Clean op het spiraalvormige microfluïdische apparaat.

3. pre-analytische verrijking van CTC bij bloedmonsters van patiënten

  1. Verzamel 7,5 mL bloed in de K2EDTA-buis en blijf onder zachte opwinding om celsedimentatie en stolling te voorkomen. Proces binnen 6 uur.
    Opmerking: Als het bloed wordt opgevangen in een cel-vrij DNA bloed inzamelings buis met conserveringsmiddel, bewaren bij 4 °C tot de verwerking. Zorg ervoor dat het bloedmonster, de RBC lysis-buffer en de RBS-buffer zich op RT bevinden voordat u doorgaat met de stap verrijking.
  2. Breng tot 7,5 mL volbloed over in een nieuwe centrifugebuis-ingangs buis van 50 mL met behulp van een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast.
  3. Centrifugeer op 1.600 x g gedurende 10 minuten bij RT. Verzamel de plasma fractie met een pipet zonder de Buffy coat te verstoren. Vervang de plasma breuk door direct equivalent volume van PBS toe te voegen tot 7,5 mL.
  4. Voeg voorzichtig RBC lysisbuffer (tabel met materialen) toe aan het bloedmonster tot een eindvolume van 30 ml (voor een K2EDTA-buis) of 37,5 ml (voor een cel-vrij DNA-bloedopvangbuisje). Keer de bloedplaatjes buis 10x voorzichtig om en laat 10 minuten inbroelen bij RT.
    Opmerking: Het bloedmonster verandert donkerder rood tijdens RBC lysis. Als er na 10 minuten geen verandering (van donkerrood en ondoorzichtig) wordt waargenomen, Inverteer dan de buis 3x en laat voor een ander maximum van 5 minuten staan. Laat het monster niet langer dan 15 minuten in de RBC lysisbuffer staan, omdat het de monster kwaliteit en de test prestaties in gevaar kan brengen.
  5. Centrifugeer het gelyseerd bloedmonster gedurende 10 minuten bij RT met 500 x g , met centrifuge remmen (of de hoogste vertragings snelheid). Gebruik een Pasteur-pipet of serologische pipet om het supernatant voorzichtig te verwijderen totdat het volume het 4-5 mL-teken bereikt. Gebruik vervolgens de gefilterde micro pipettips om de resterende supernatant te verwijderen.
  6. Gebruik een P1000 micro pipet met een gefilterde tip om 1,0 mL RSB toe te voegen aan de wand van de ingangs buis van de centrifugebuis van 50 mL. Om te voorkomen dat er bubbels in de mix worden gebracht, moet u de celpellet hervatten door voorzichtig op en neer te pipetteren totdat het monster homogeen is.
  7. Voeg een extra 3 mL RSB toe aan de wand van de 50 mL centrifugebuis ingangs buis (totaal volume 4 mL). Vermijd het inbrengen van bubbels in de mix. Meng de celsuspensie zachtjes door voorzichtig op en neer te pipetteren.
    Opmerking: In het onwaarschijnlijke geval dat regelmatig pipetteren niet in staat is om celklonten af te breken (gedefinieerd door zichtbaar te zijn of de pipetpunt te blokkeren), filtert u het monster door een celzeef van 40 μm om eventuele klontjes te verwijderen. Voeg 150 μL RSB toe aan het monster om volumeverlies door filtering te maken. Merk op dat deze methode spaarzaam moet worden gebruikt en alleen wanneer grote klonters worden waargenomen.
  8. Voordat u doorgaat naar de verrijkings stap, Controleer of het monster vrij is van overmatige luchtbellen en indien aanwezig, verwijder de bellen en zorg dat u geen monsters wegneemt. Als er kleine bubbels aanwezig zijn, is het verwijderen ervan niet nodig.
  9. Verwerk het monster op het spiraalvormige microfluïdische apparaat.

4. verrijking van Ctc's van patiënt volbloed met het spiraalvormige Microfluïdische apparaat

  1. Laad een nieuwe spiraal microfluïdische chip. Laad twee lege centrifugebuizen van 50 mL in de ingangs-en uitgangspoorten.
  2. Voer een priemgetal door te klikken op Prime op het spiraalvormige microfluïdische apparaat (3 min). Verwijder de invoer-en uitvoer buizen en laad het te verwerken monster in de ingangspoort.
  3. Laad een heldere 15 mL conische buis in de uitgangspoort om verrijkte Ctc's te verzamelen. run programma 3 door te klikken op rennen en het programma 3 (31 min)te selecteren.
  4. Ontlaad de uitgangs buis en centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 min (versnelling: 9; vertraging: 5). Verwijder met een serologische Pipet van 5 ml supernatant die stopt bij de 2 ml markering op de conische 15 ml buis. Met een micro pipet verwijdert u de supernatant die stopt bij een teken van 100 μL op de conische buis van 15 mL. Verwerk het verrijkte monster rechtstreeks voor immunofluorescentie kleuring.

5. immunofluorescentie kleuring

  1. Opsommen op een Chambered dia met een hemocytometer-type raster het aantal cellen per mL. Verdun het verrijkte monster met 0,2% anti-bindende oplossing (tabel met materialen) tot een concentratie van 100.000 cellen/100 μL per cytospin.
  2. Bevochtig de contour van de monsterkamer met behulp van katoen (tabel met materialen) met 50 μL 0,2% anti-bindende oplossing. Plaats een poly lysine glas-Slide in de sample kamer en sluit.
  3. Jas een tip met 0,2% anti-bindende oplossing door Pipetteer op en neer 3x. Hervat het verrijkte monster en breng de celoplossing over in de monsterkamer. Centrifugeer met een speciale centrifuge (tabel met materialen) bij 400 rpm gedurende 4 min (acceleratie laag).
  4. Plaats een silicium-isolator rond het gebied van depositie. Laat de glazen schuif gedurende 2 minuten onder een microbiologische veiligheidskast drogen.
  5. Bereid de fixatie oplossing door 1 mL 16% Paraformaldehyde (PFA) te verdunen met 3 mL steriele PBS. Voeg 100 μL fixatie oplossing (4% PFA) per monster toe en inbroed gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder de fixatie oplossing en voer drie spoelingen uit met 200 μL PBS en inbroed op RT elk gedurende 2 minuten.
    Let op: Gebruik PFA onder een chemische veiligheidskast om inademing te voorkomen.
  6. Bereid de verzadigings oplossing voor door verdunning van het foetaal runderserum (FBS) bij 5%, FC receptor (FcR) blokkerende reagens bij 5%, en boviene serumalbumine (BSA) bij 1% in steriele PBS (tabel van de materialen). Voeg een verzadigings oplossing van 100 μL per monster toe en inincubatie gedurende 30 minuten bij RT. Verwijder de verzadigings oplossing.
  7. Voeg 100 μL antilichaam oplossing per monster toe (CD45 antilichaam 1/20; PanCK antilichaam 1/500; PD-L1 antilichaam 1/200; QSP-verzadigings oplossing 100 μL) (tabel met materialen). Plaats de poly lysine glas-Slide in een 100 mm x 15 mm Petri schaaltje. Bevochtig een absorberend papier met 2 mL steriel water en sluit de Petri schaal met het deksel. Plaats bij 4 °C 's nachts en Bescherm tegen het licht.
  8. Verwijder de antilichaammix en voer 3 wasgewassen uit met 200 μL PBS die elke wasbeurt gedurende 2 minuten inbroed. Laat het monster 5 minuten drogen en Bescherm het tegen het licht. Plaats 10 μL montage oplossing (tabel van de materialen) op het gebied van depositie en afdekking met een Microscoop afdekplaat zonder een bubbel te maken. Sluit de dekslip af met nagellak.

6. acquisitie van immunofluorescentie beelden met een rechte fluorescerende Microscoop en bijbehorende software

  1. Gebruik een rechte fluorescerende Microscoop met een X/Y gemotoriseerd platform. Gebruik een 20x-doelstelling om 8-bits RGB TIFF-afbeeldingen te maken in vier kanalen die corresponderen met DNA-kleurstof (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), PanCK-kleurstof (fluorescein isothiocyanaten [FITC]), PD-L1 Dye (CY3) en CD45 Zet de Mercury-Lamp 15 minuten voor gebruik aan en pas de Microscoop en bijbehorende software aan de semi-geautomatiseerde shoot aan.
  2. Plaats de glazen schuif op het platform.
  3. Definieer in het menu acquisitie de vier kanalen en stel de belichtingstijd in (DAPI: 15 MS, FITC [PanCK]: 500 MS; CY3 [PD-L1]: 800 MS; CY5 [CD45]: 1.000 MS). Definieer de te scannen tegels. Klik op tegels. Definieer in Geavanceerd experimenthet gebied dat moet worden gescand.
  4. Pas de scherpstelling op het scherm aan. Klik op experiment starten.
  5. Exporteer TIF-bestanden van elk kanaal en noem het afbeeldingsbestand specifiek met deze informatie: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles. TIF (bijvoorbeeld Sample1_TR1_c1m01). Naam kleurstof als volgt: het DAPI-kanaal is C1, FITC-kanaal is C2, CY3 kanaal is C3 en CY5 kanaal is C4.

7. analyse van immunofluorescentie beelden met beeldanalyse software

  1. Download en installeer de gratis software voorbeeld analyse van de website van Broad Institute. Accepteer alle standaardwaarden tijdens de installatie. Open de software voorbeeld analyse en klik op bestand | Pijplijn uit bestand | Analysis_4channels_CTC. cppipe.
    Opmerking: De pijplijn converteert RGB-kleur afbeeldingen naar grijswaarden, verwijdert artefacten door afbeeldingen glad te maken met een mediaan filter, identificeert kernen en cytoplasma, kwantificeert fluorescentie intensiteiten van elk kanaal en exporteert ze naar een Excel-bestand.
  2. Bestanden in de bestandslijstneerzetten. Werk de metagegevens bij om de bestanden te groeperen op tegels.
    Opmerking: Alle instructies voor het groeperen van afbeeldingen worden gespecificeerd in de software. Naam bestanden verschenen in de Namesandtypes module en bestanden worden gegroepeerd op basis van het nummer van de tegel en het kanaal per samples.
  3. Klik op uitvoerinstellingen weergeven en geef een juiste standaarduitvoer op. Klik op afbeeldingen analyseren. Open het spreadsheetbestand dat overeenkomt met measure_intensity parameters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eerste vereiste was om ongecontamineerde (infectieuze agent-Free) collecties van Ctc's voor weefselkweek te verkrijgen en te voorkomen dat de achtergrond wordt gegenereerd. Het decontaminatie protocol zorgde voor reiniging van alle leidingen en pompen, en resulteerde in de verzameling van Ctc's met een goede herstelsnelheid zonder bacteriële besmetting. De verrijkte monsters werden vergeleken zonder en met de decontaminatieprotocol-workflow van het spiraalvormige microfluïdische apparaat. Om het decontaminatie protoco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Twee belangrijke punten zijn in de huidige studie aan de orde gesteld, de eerste met betrekking tot de prestaties van de workflow voor de overdracht ervan naar klinische toepassingen, en de tweede over de afname van subjectiviteit voor de analyse van de verkregen fluorescentie beelden.

Een performante en geoptimaliseerde workflow voor CTC-inventarisatie werd aanvankelijk bepaald met aanpasbare IF-assay na celverrijking via een CTC-label vrij microfluïdisch systeem (spiraal microfluïdisch appar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jean-Philippe Aurel en Kathryn Weiqi Li zijn medewerkers van Biolidics Company die in dit artikel gebruikte instrumenten produceert. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door onderzoeksbeurzen van AstraZeneca (Londen, Verenigd Koninkrijk), Biolidics (Singapore) en de Ligue contre le Cancer (Saone et Loire, Frankrijk). De auteurs bedanken AstraZeneca en Biolidics bedrijven voor hun financiële steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4'6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)OzymeBLE 422801Opslagomstandigheden: +4 °C
BD Facs Clean – 5 LBD Biosciences340345Bleek-gebaseerd reinigingsmiddel. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Bleach 1% Reinigingsoplossing 100 mLBiolidicsCBB-F016012Bleekmiddel. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Bovine Serum Albumine (BSA) 7,5%SigmaA8412Opslagomstandigheden: +4 °C
CD45 monoklonaal antilichaam (clone HI30) Alexa Fluor 647BioLegendBLE304020Opslagomstandigheden: +4 °C
CellProfiler SoftwareBroad InstituteBeeldanalysesoftware
Centrifuge apparaatHettich4706Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Centrifuge buis 50 mLCorning430-829Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Centrifugebuis 15 mLBiolidicsCBB-F001004-25Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
ClearCell FX-1 SysteemBiolidicsCBB-F011002Spiral microfluïdisch apparaat. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Coulter Clenz Reinigingsmiddel – 5 LBeckman Coulter8448222Allroundreinigingsreagens. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
CTChip FR1SBiolidicsCBB-FR001002Microfluïdische chip. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Cytospin 4ThermoFisherA78300003Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Diluent Additief Reagens – 20 mLBiolidicsCBB-F016009Opslagomstandigheden: +4 °C
EZ CytofunnelsThermoFisherA78710003Monsterkamer met katoen. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
FcR blokkeermiddelMiltenyi Biotec130-059-901Opslagomstandigheden: +4 °C
Fetaal Kalfs Serum (FCS)Gibco10270-106Opslagomstandigheden: +4 °C
FluoromountSigmaF4680Montageoplossing. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Fungizone - 50 mgBristol-Myers-Squibb90129TB29Anti-schimmelreagens. Opslagomstandigheden: +4 °C
FX1 Invoerrietje met vergrendelingsdopBiolidicsCBB-F013005Ritje. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
KovaSlideDutscher50126Kamerslide. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
PanCK monoklonaal antilichaam (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisher53-9003-80Opslagomstandigheden: +4 °C
Paraformaldehyde 16%ThermoFisher11490570Fixatieoplossing. Opslagomstandigheden: +4 °C
PD-L1 monoklonaal antilichaam (clone 29E2A3) - FycoerythrineBioLegendBLE329706Opslagomstandigheden: +4 °C
PetrischaalDutscher632180Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)OzymeBE17-512FOpslagomstandigheden: +4 °C
Fosfaatgebufferde zoutoplossing Ultra Pure Grade 1x – 1 L1st Base LaboratoryBUF-2040-1X1LOpslagomstandigheden: kamertemperatuur
Pluronic F-68 10%Gibco24040-032Anti-bindingsoplossing. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Polylysine slidesThermoFisherJ2800AMNZOpslagomstandigheden: kamertemperatuur
Polypropyleen conische buis 50 mLFalcon352098Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
RBC Lysis Buffer – 100 mLG Biosciences786-649Opslagomstandigheden: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mLG Biosciences786-650Opslagomstandigheden: +4 °C
Resuspensie Buffer (RSB)BiolidicsCBB-F016003Opslagomstandigheden: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifugeThermoFisherA78300003Specifieke centrifuge. Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Siliconen IsolatorGrace bio-Labs664270Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Steriele gedeïoniseerde water – 100 mL1st Base LaboratoryCUS-4100-100mlOpslagomstandigheden: kamertemperatuur
Rechte fluorescentiemicroscoop Axio Imager D1ZeissOpslagomstandigheden: kamertemperatuur
Chirurgische steriele zakSPS Laboratoires98ULT01240Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Spuit BD Discardit II 20 mL sterielBD Biosciences300296Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Spuitfilter 0,22 µm 33 mm sterielClearLine51732Opslagomstandigheden: kamertemperatuur
Zen lite 2.3 Lite SoftwareZeissMicroscoop-geassocieerde software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
  2. Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
  3. Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
  4. Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
  5. Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
  6. Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
  7. Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175(2017).
  8. Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
  9. Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726(2016).
  10. Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
  11. Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566(2019).
  12. Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
  13. Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
  14. Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
  15. Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
  16. Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23(2014).
  17. Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597(2014).
  18. Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409(2014).
  19. Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
  20. Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
  21. Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Circulating Tumor CellsPD L1 CharacterizationSpiral Microfluidic DeviceImmunofluorescence StainingCTC EnrichmentCytospin PreparationImage Analysis SoftwareFluorescent MicroscopyBlood Sample ProcessingEpithelial to Mesenchymal Transition

Gerelateerde artikelen