Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Summary

De karakterisering van circulerende tumorcellen (Ctc's) is een populair onderwerp in translationeel onderzoek. Dit protocol beschrijft een semiautomatische immunofluorescentie (IF)-test voor PD-L1-karakterisering en inventarisatie van Ctc's in niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-patiënt monsters.

Abstract

Circulerende tumorcellen (Ctc's) afgeleid van de primaire tumor worden vergoten in de bloedbaan of lymfatisch systeem. Deze zeldzame cellen (1 − 10 cellen per mL bloed) rechtvaardigen een slechte prognose en zijn gecorreleerd met een kortere totale overleving in verschillende kankers (bijv. borst, prostaat en colorectale). Momenteel is het met anti-EpCAM gecoate, op magnetische kraal gebaseerde CTC-opnamesysteem de gouden standaard test die is goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor het inventariseren van Ctc's in de bloedbaan. Deze test is gebaseerd op het gebruik van magnetische kralen bekleed met anti-EpCAM markers, die specifiek gericht zijn op epitheliale kankercellen. Veel studies hebben aangetoond dat EpCAM niet de optimale marker is voor CTC-detectie. Inderdaad, Ctc's zijn een heterogene subpopulatie van kankercellen en kunnen een epitheliale-naar-mesenchymale overgang ondergaan (EMT) in verband met gemetastaseerde proliferatie en invasie. Deze Ctc's zijn in staat om de expressie van celoppervlak epitheliale marker EpCAM verminderen, terwijl het verhogen van mesenchymale markers zoals vimentin. Om deze technische hindernis aan te pakken, zijn er andere isolatie methoden ontwikkeld op basis van fysische eigenschappen van Ctc's. Microfluïdische technologieën maken een etiket vrije benadering van CTC-verrijking van volledige bloedmonsters mogelijk. De spiraalvormige microfluïdische technologie maakt gebruik van de inertiële en Dean Sleep krachten met continue stroming in gebogen kanalen gegenereerd binnen een spiraal microfluïdische chip. De cellen worden gescheiden op basis van de verschillen in grootte en plasticiteit tussen normale bloedcellen en tumorale cellen. Dit protocol Details de verschillende stappen om de geprogrammeerde Death-ligand 1 (PD-L1) expressie van CTCs te karakteriseren, waarbij een spiraal microfluïdisch apparaat wordt gecombineerd met aanpasbare immunofluorescentie (IF) marker set.

Introduction

Tumor antigen-specifieke cytotoxische T-lymfocyten (Ctl's) spelen een cruciale rol in de reactie op kanker door middel van een proces dat bekend staat als kanker "immuun surveillance". Hun anti-tumor functies worden versterkt door immuun Checkpoint blokkade antilichamen zoals CTLA-4 remmers en PD-1/PD-L1-remmers. Bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) resulteren anti-PD-1/PD-L1 therapieën in responspercentages variërend van 0%-17% bij patiënten met PD-L1-negatieve tumoren en 36%-100% in degenen die PD-L1 uitdrukken. De robuuste responsen op PD-1/PD-L1-blokkade waargenomen bij melanoom en NSCLC worden aangetoond door het bewijs van een verbeterde algehele responsrati....

Protocol

Monsters werden prospectief verzameld in het kader van de CIRCAN ("circulerende kanker") cohort in het universitair ziekenhuis van Lyon na schriftelijke toestemming van de patiënt. Deze studie werd geïntegreerd in de CIRCAN_ALL cohort. De studie CIRCAN_ALL werd erkend als niet-Interventioneel door de CPP Zuid-Oost IV gedateerd 04/11/2015 onder de referentie L15-188. Een gewijzigde versie werd erkend als niet-Interventioneel op 20/09/2016 onder referentie L16-160. De CIRCAN_ALL studie werd verklaard aan de correspondent voor IT en vrijheid van de Hospices civils de Lyon op 01/12/2015, onder de referentie 15-131. Bloedafname werd uitgevoerd wanneer artsen de vroegste in....

Results

De eerste vereiste was om ongecontamineerde (infectieuze agent-Free) collecties van Ctc's voor weefselkweek te verkrijgen en te voorkomen dat de achtergrond wordt gegenereerd. Het decontaminatie protocol zorgde voor reiniging van alle leidingen en pompen, en resulteerde in de verzameling van Ctc's met een goede herstelsnelheid zonder bacteriële besmetting. De verrijkte monsters werden vergeleken zonder en met de decontaminatieprotocol-workflow van het spiraalvormige microfluïdische apparaat. Om het decontaminatie protoco.......

Discussion

Twee belangrijke punten zijn in de huidige studie aan de orde gesteld, de eerste met betrekking tot de prestaties van de workflow voor de overdracht ervan naar klinische toepassingen, en de tweede over de afname van subjectiviteit voor de analyse van de verkregen fluorescentie beelden.

Een performante en geoptimaliseerde workflow voor CTC-inventarisatie werd aanvankelijk bepaald met aanpasbare IF-assay na celverrijking via een CTC-label vrij microfluïdisch systeem (spiraal microfluïdisch appar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4 °C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4 °C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4 °C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4 °C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software