Oncogene Genfusie detectie met behulp van verankerde multiplex polymerase kettingreactie gevolgd door sequenties van de volgende generatie

Samenvatting

Dit artikeldetails het gebruik van een verankerde multiplex polymerase keten reactie gebaseerde bibliotheek Voorbereidingspakket gevolgd door de volgende generatie sequencing om te beoordelen voor oncogene gen fusies in klinische solide tumormonsters. Zowel de natte bank als de gegevensanalyse stappen worden beschreven.

Samenvatting

Gen-fusies dragen vaak bij aan het oncogene fenotype van veel verschillende soorten kanker. Bovendien beïnvloedt de aanwezigheid van bepaalde fusies in monsters van kankerpatiënten vaak rechtstreeks de diagnose, prognose en/of therapie selectie. Als gevolg hiervan is de nauwkeurige detectie van genfusies een essentieel onderdeel van het klinisch beheer voor vele ziekte types geworden. Tot voor kort werd klinische genfusie detectie voornamelijk bewerkstelligd door het gebruik van enkelvoudige assays. De steeds groeiende lijst van genfusies met klinische significantie heeft echter een noodzaak gecreëerd om de fusie status van meerdere genen gelijktijdig te beoordelen. Tests van de volgende generatie sequencing (NGS) hebben aan deze vraag voldaan door het vermogen om nucleïnezuur te sequentiëren in massaal parallelle mode. Meerdere op NGS gebaseerde benaderingen die verschillende strategieën hanteren voor gendoel verrijking zijn nu beschikbaar voor gebruik in klinische moleculaire diagnostiek, elk met zijn eigen sterke en zwakke punten. Dit artikel beschrijft het gebruik van verankerde multiplex PCR (AMP)-gebaseerde doel verrijking en bibliotheek voorbereiding gevolgd door NGS om te beoordelen op genfusies in klinische solide tumor specimens. AMP is uniek onder de op amplicon gebaseerde verrijkings benaderingen, omdat het genen fusies identificeert, ongeacht de identiteit van de fusie partner. Gedetailleerd hier zijn zowel de natte bank en data analysestappen die zorgen voor nauwkeurige genfusie detectie van klinische monsters.

Inleiding

De fusie van twee of meer genen in één transcriptionele entiteit kan optreden als gevolg van grootschalige chromosomale variaties, waaronder verwijderingen, duplicaties, inserties, Inversies en translocaties. Door veranderde Transcriptionele controle en/of veranderde functionele eigenschappen van het uitgedrukte genproduct, kunnen deze fusie genen oncogene eigenschappen toekennen aan kankercellen¹. In veel gevallen, Fusion genen zijn bekend om op te treden als primaire oncogene drivers door het direct activeren cellulaire proliferatie en overleving trajecten.

De klinische relevantie van genfusies voor kankerpatiënten werd voor het eerst duidelijk met de ontdekking van het Philadelphia-chromosoom en het overeenkomstige BCR-ABL1-fusie- gen in chronische myeloïde LEUKEMIE (CML)². De kleine molecule remmer Imatinib mesylate werd ontwikkeld om specifiek te richten op dit fusie-gen en toonde opmerkelijke werkzaamheid bij BCR-ABL1-positieve cml patiënten³. Therapeutische targeting van oncogene genen fusies is ook succesvol geweest in solide tumoren, met remming van alk en ROS1 fusie genen in niet-kleincellige longkanker die fungeert als primaire voorbeelden^4,5. Onlangs was de NTRK-remmer larotrectinib FDA goedgekeurd voor NTRK1/2/3 fusie-positieve vaste tumoren, ongeacht de ziekte plaats⁶. Naast de selectie van de therapie, heeft genfusie detectie ook rollen in ziekte diagnoses en prognose. Dit komt vooral voor in verschillende Sarcoom en hematologische maligniteiten die door de aanwezigheid van specifieke fusies en/of voor de aanwezigheid van een fusie direct worden bepaald aan de hand van de prognose^{7,8 , 9 , 10 , 11}. Dit zijn slechts enkele voorbeelden van de klinische toepassing van genfusie detectie voor kankerpatiënten.

Vanwege de cruciale rol bij klinische besluitvorming is nauwkeurige genfusie detectie uit klinische monsters van vitaal belang. In klinische laboratoria zijn talrijke technieken toegepast voor de analyse van fusie-of chromosomale omlegging, waaronder: cytogenetische technieken, omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR), fluorescentie in situ-hybridisatie (vis), Immunohistochemie (IHC), en 5 '/3 ' expressie onbalans analyse (onder andere)^12,13,14,15. Op dit moment heeft de snel uitbreidende lijst van bruikbare gen-fusies in kanker geresulteerd in de noodzaak om de fusie status van meerdere genen tegelijkertijd te beoordelen. Bijgevolg zijn sommige traditionele technieken die slechts één of een paar genen tegelijk kunnen opvragen steeds inefficiënte benaderingen, vooral wanneer men bedenkt dat klinische tumormonsters vaak zeer eindig zijn en niet vatbaar zijn voor verdeling tussen verschillende assays. Next generation sequencing (NGS) is echter een analyseplatform dat goed geschikt is voor multi-Gene testen, en op NGS gebaseerde assays zijn gebruikelijk geworden in klinisch moleculaire diagnostische laboratoria.

Momenteel gebruikte NGS assays voor fusie/herschikking detectie variëren met betrekking tot de gebruikte input materiaal, de chemici gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek en de doel verrijking, en het aantal genen opgevraagd binnen een assay. NGS-testen kunnen worden gebaseerd op RNA of DNA (of beide) geëxtraheerd uit het monster. Hoewel RNA-gebaseerde analyse wordt belemmerd door de neiging van klinische monsters om sterk aangetast RNA te bevatten, omzeilt het de noodzaak om grote en vaak herhaalde intron te sequenties die de doelwitten zijn van DNA-gebaseerde fusie tests, maar die moeilijk zijn voor ngs gegevensanalyse¹⁶. Doel verrijkings strategieën voor op RNA gebaseerde NGS-testen kunnen grotendeels worden onderverdeeld in hybride Capture of amplicon-gemedieerde benaderingen. Hoewel beide strategieën met succes zijn gebruikt voor fusie detectie, bevat elk voordelen ten opzichte van de andere^17,18. Hybrid Capture assays resulteren meestal in complexere bibliotheken en verminderen allel dropout, terwijl amplicon gebaseerde assays in het algemeen lagere input vereisen en resulteren in minder doel volgorde¹⁹. Echter, misschien is de primaire beperking van traditionele amplicon gebaseerde verrijking de noodzaak voor primers aan alle bekende fusie partners. Dit is problematisch omdat veel klinisch belangrijke genen bekend zijn met tientallen verschillende partners, en zelfs als het ontwerp van de primer de detectie van alle bekende partners toestaat, blijven nieuwe fusie gebeurtenissen onopgemerkt. Een recent beschreven techniek genaamd verankerde multiplex PCR (of AMP voor short) lost deze beperking op²⁰. In amp wordt een ' half-functionele ' ngs-adapter geligeerd aan cDNA-fragmenten die zijn afgeleid van input RNA. Doel verrijking wordt bereikt door versterking van genspecifieke primers en een primer op de adapter. Dientengevolge moeten alle fusies met genen die van belang zijn, zelfs als er een nieuwe fusie partner bij betrokken is, worden opgespoord (Zie Figuur 1). Dit artikel beschrijft het gebruik van de ArcherDx FusionPlex Solid tumor Kit, een op NGS gebaseerde assay die AMP gebruikt voor doel verrijking en bibliotheek voorbereiding, voor de detectie van oncogene gen fusies in vaste tumormonsters (Zie aanvullende tabel 1 voor volledige genlijst). Het NAT-Bench protocol en de stappen voor gegevensanalyse zijn grondig gevalideerd in een laboratorium voor de verbetering van de klinische laboratorium wijzigingen (CLIA).

Protocol

1. voorbereiding en sequencing van bibliotheken

1. Algemene assay-overwegingen en pre-assay stappen
   1. Test runs bestaan meestal uit zeven klinische monsters en één positieve controle (hoewel het aantal monsters per bibliotheek voorbereidings uitvoering kan worden aangepast indien nodig). Gebruik een positieve controle die ten minste meerdere gen-fusies bevat (de testdoelen) die door een fabrikant zijn bevestigd en/of zijn bevestigd door een orthogonale methodologie. Een non-template Control (NTC) moet worden opgenomen als een extra monster in elke assay run, maar wordt alleen uitgevoerd door de tweede streng cDNA synthese en pre-sequentiëren kwaliteitscontrole (pre-SEQ QC; om ervoor te zorgen geen cDNA synthese). Gebruik monster verdunningsmiddel (10 mM tris HCl pH 8,0) voor de NTC.
   2. Voer totale nucleïnezuur (TNA) extractie van formalin-vaste paraffine-ingesloten (FFPE) weefsel.
   3. Kwantificeer de RNA component van de TNA met behulp van een fluorometrische test.
      Opmerking: Voorkom RNA afbraak in de monsters door het beperken van vries-dooi cycli, het houden van ontdooide nucleïnezuur bij lage temperatuur (gekoeld blok, ijs of alternatief), en het voorkomen van RNase verontreiniging (het dragen van handschoenen, met behulp van een RNase decontaminator spray).
2. Willekeurige priming
   Opmerking: de gewenste input voor de assay is 200 ng RNA (gebaseerd op fluorometrische kwantatie van de TNA). Lagere ingangen kunnen worden gebruikt als 200 ng niet kan worden bereikt. Als het voorbeeld na sequentiëren QC mislukt, herhalen met hogere invoer kan resulteren in acceptabele QC metrische gegevens.
   1. Verdun TNA in 10 mM tris HCl pH 8,0 om de gewenste RNA-concentratie te bereiken. Breng voor elk monster 20 μL van de verdunning over in de aselecte priming reagens strook buizen (geplaatst in voorgekoeld aluminium blok) en meng door pipetteren op en neer 6 − 8 keer. Draai kort naar beneden en breng het volledige volume over naar een 96 goed PCR-plaat en Seal met RT-film.
   2. Insert plaat in Thermocycler blok, afdekking met Compression pad, en sluit deksel. Incuberen bij 65 °C gedurende 5 minuten (verwarmd deksel).
   3. Verwijder de plaat van de thermocycler en plaats deze 2 min op het ijs.
3. Eerste streng cDNA synthese
   1. Breng het volledige volume van het willekeurige priming-product over in de eerste streng reagens strook buizen (geplaatst in voorgekoeld aluminium blok). Meng door Pipetteer op en neer 6 − 8 keer. Draai kort, breng het volledige volume over naar een 96 goed PCR-plaat en Seal met RT-film.
   2. Insert plaat in Thermocycler blok, afdekking met Compression pad, en sluit deksel. Run Thermocycler programma: 25 °C 10 min, 42 °C 30 min, 80 °C 20 min, 4 °C Hold (verwarmd deksel).
4. Tweede onderdeel cDNA synthese
   1. Maak in een nieuwe reeks PCR-strip buizen een 1:10 verdunning van het eerste streng product door 1 μL eerste streng product toe te voegen aan 9 μL Nuclease vrij water. Zet de verdunning opzij voor gebruik in de pre-SEQ-QC-test.
   2. Voeg 21 μL Nuclease vrij water toe aan het overgebleven eerste strand product. Breng 40 μL van het eerste streng product en Nuclease vrij water over naar de tweede streng reagens strook buis (geplaatst in voorgekoeld aluminium blok). Meng door Pipetteer op en neer 6 − 8 keer. Draai naar beneden, breng het volledige volume over naar een 96 goed PCR-plaat en Seal met RT-film.
   3. Insert plaat in Thermocycler blok, afdekking met Compression pad, en sluit deksel. Run Thermocycler programma: 16 °C 60 min, 75 °C 20 min, 4 °C Hold (verwarmd deksel).
      Opmerking: dit is een acceptabel stoppunt. De plaat kan bij-20 °C worden bewaard.
5. Pre-SEQ QC
   Opmerking: deze test van kwaliteitscontrole (QC) wordt voornamelijk gebruikt voor de verificatie van geen cDNA-synthese van het NTC. De gegevens kunnen echter ook informatief zijn bij het oplossen van problemen. Als een voorbeeld bijvoorbeeld een goede pre-SEQ QC-waarde heeft, maar slechte assay-metrieken (zie hieronder), kan dit een indicatie zijn van een probleem in de assay-run, wat een herhaling noodzakelijk maakt.
   1. Voer elk voorbeeld en de NTC in tweevoud. Ook opnemen in de pre-SEQ QC uitvoeren van een reactie NTC, dat is Nuclease gratis water (ook uitgevoerd in tweevoud). Voeg aan elk toepasselijk goed van een optisch 96-goed plaat 5 μL van de assay Master Mix, 1 μL 10x VCP-primer en 4 μL van de 1:10 verdunning van het eerste streng product toe die in stap 1.4.1 is gemaakt.
   2. Sluit de plaat af met de RT-film, draai naar beneden en laad in een kwantitatief PCR (qPCR)-instrument. Voer het programma uit: pre-amp: 1 cyclus 95 °C 20 s, amp: 35 cycli 95 °C 3 s (4,4 °C/s helling snelheid) − 60 °C 30 s (2,2 °C/s helling snelheid).
   3. Bevestig het ontbreken van een cyclus drempelwaarde (CT) voor zowel de assay NTC als de reactie NTC.
      Opmerking: als er geen CT wordt waargenomen in de assay-NTC, wordt deze niet meer in de test getransporteerd. De waarneming van een CT-waarde in de reactie NTC vereist een herhaling van de pre-SEQ-QC-test. Observatie van een CT in de assay NTC suggereert monster besmetting op een bepaald punt voorafgaand aan de test, waardoor wordt geëist dat de volledige test (alle monsters) wordt gestart. De pre-SEQ QC CT waarde voor een adequate kwaliteit monster moet lager zijn dan 30 (lagere CT-waarden correleren met meer product en dus hogere kwaliteit RNA). Waarden boven 30 zijn geen absolute indicatoren van falen en deze steekproef moet in de test worden voortgezet. Alle gegevens die van dergelijke monsters afkomstig zijn, moeten echter zorgvuldig worden geëvalueerd, met name in gevallen waarvoor geen fusie wordt genoemd.
6. Einde reparatie en kraal zuivering
   1. Breng 40 μL van het tweede streng product over in de eind reparatie reagens strook buis (geplaatst in voorgekoeld aluminium blok). Meng door Pipetteer op en neer 6 − 8 keer, draai naar beneden en plaats in Thermocycler-blok (Houd het verwarmde deksel open) en voer het Thermocycler-programma uit: 25 °C 30 min, 4 °C vasthouden.
   2. Verwijder zuiverings parels van 4 °C en laat toe om op kamertemperatuur te komen. Maak voldoende 70% ethanol om de hele bibliotheek voor te bereiden. Vortex kralen goed voor gebruik en Pipet 100 μL in het juiste aantal putjes van een U-bodemplaat.
      Opmerking: voor elke 8 monsters die worden uitgevoerd, zal 20 mL 70% ethanol nodig zijn.
   3. Voeg het volledige volume van het eind reparatie product toe aan de kralen. Pipet teren op en neer 6 − 8 keer om gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te mengen en te inbroed, gevolgd door een incubatie van 5 min op de magneet.
   4. Verwijder en gooi de supernatant weg en voer 2 200 μL 70% ethanol wassingen uit met 30-s incubaties. Verwijder na de laatste wasbeurt alle 70% ethanol en laat de lucht drogen gedurende 5 min.
   5. Verwijder de magneet en stop de kralen opnieuw in 22 μL van 10 mM tris HCl pH 8,0. Incuberen de magneet 3 minuten, gevolgd door een incubatie van 2 minuten op de magneet. Ga onmiddellijk naar de ligatie stap 1.
7. Ligatie stap 1 en kraal zuivering
   1. Breng 20 μL van de eind reparatie kraal zuiverings plaat (het verzorgen niet te storen kraal pellet) in de ligatie stap 1 strook buizen (geplaatst in voorgekoeld aluminium blok). Meng door Pipetteer op en neer 6 − 8 keer, draai omlaag en breng het volledige volume over in een 96 goed PCR-plaat.
   2. Inbouw plaat in Thermocycler-blok, afdekking met Compression pad en sluit deksel. Run Thermocycler programma: 37 °C 15 min, 4 °C Hold (verwarmd deksel).
   3. Verwijder zuiverings parels van 4 °C en laat toe om op kamertemperatuur te komen. Vortex kralen goed voor gebruik en pipet 50 μL in het juiste aantal putjes van een U-bodemplaat.
   4. Voeg het volledige volume van de ligatie stap 1 toe aan de kralen. Pipet teren op en neer 6 − 8 keer om gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te mengen en te inbroed, gevolgd door een incubatie van 5 min op de magneet.
   5. Verwijder en gooi de supernatant weg en voer 2 200 μL 70% ethanol wassingen uit met 30-s incubaties. Verwijder na de laatste wasbeurt alle 70% ethanol en laat de lucht drogen gedurende 5 min.
   6. Verwijder de magneet en stop de kralen opnieuw in 42 μL van 10 mM tris HCl pH 8,0. Incuberen de magneet 3 minuten, gevolgd door een incubatie van 2 minuten op de magneet. Ga onmiddellijk naar ligatie stap 2.
8. Ligatie stap 2 en kraal zuivering
   1. Verwijder Moleculaire barcode (MBC) adapter strip buis reagentia van 4 °C opslag. De juiste nummering van de MBC-adapterstrip is van cruciaal belang, omdat er op dit moment sample-specifieke indexen worden toegevoegd. Positioneer de buizen horizontaal met de scharnieren aan de achterzijde en gebruik een permanente marker om de buizen 1, 2, 3... van links naar rechts. Het is ook essentieel voor het vastleggen van de voorbeeld-specifieke indexen voor volgordebepaling doeleinden (ze moeten worden ingevoerd in het werkblad sequencer).
   2. Breng 40 μL over van de ligatie stap 1 kraal zuiverings plaat (verzorgen niet te storen kraal pellet) aan de MBC adapter strip buizen (geplaatst in voorgekoeld aluminium blok). Meng door Pipetteer op en neer 6 − 8 keer.
   3. Draai naar beneden en breng het volledige volume over naar de ligatie stap 2 reagens strook buizen (ook geplaatst in voorgekoeld aluminium blok). Meng door Pipetteer op en neer 6 − 8 keer, draai omlaag en plaats in Thermocycler-blok. Met het verwarmde deksel uit run het Thermocycler programma: 22 °C 5 min, 4 °C vasthouden.
      Opmerking: dit is een veilig stoppunt en monsters kunnen worden bewaard bij-20 °C.
   4. Verwijder ligatie-opruimings parels van 4 °C opslag en laat toe om op kamertemperatuur te komen. Bereid 1 mL verse 5 mM NaOH.
   5. Vortex de ligatie-opruimings parels en voeg 50 μL toe aan een nieuwe set PCR-strip buizen. Incuberen op de magneet gedurende 1 minuut. Na de incubatie van 1 minuut verwijderen en weggooien van supernatant. Verwijder de strook buizen uit de magneet en onderbreek in 50 μL van de ligatie opschoningsbuffer door pipetteren op en neer 6 − 8 keer.
   6. Overdracht van het gehele volume van de ligatie stap 2 product in de ligatie opruimen kraal strip buizen. Meng de monsters door grondig en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Meng monsters door grondig en inincuberen bij kamertemperatuur nog eens 5 min. Meng de monsters na de tweede incubatie van 5 minuten door vortexing, draai kort en inincuberen op de magneet gedurende 1 minuut.
   7. Verwijder en gooi supernatant weg. Voeg 200 μL ligatie Cleanup buffer en Vortex toe om opnieuw op te schorten. Voer een snelle spin en plaats op de magneet voor 1 min. Voer opnieuw een tweede wasbeurt uit met de ligatie Cleanup buffer.
   8. Na de twee spoelingen met de ligatie opruimingsbuffer een identieke wassing uitvoeren met ultrapuur water. Na de ultrapuur water Wash resuspendeer je de parels in 20 μL van 5 mm NaOH en breng je over naar een 96 goed PCR-plaat. Plaats de plaat in een Thermocycler-blok met een compression pad en voer het Thermocycler-programma uit: 75 °C 10 min, 4 °C Hold (verwarmd deksel).
   9. Draai de PCR-plaat af zodra de monsters zijn afgekoeld tot 4 °C. Plaats de plaat op de magneet gedurende ten minste 3 min en ga onmiddellijk naar de eerste PCR.
9. Eerste PCR-en kraal zuivering
   1. Verwijder de eerste PCR-reagens strook buizen van 4 °C opslag en plaats in een voorgekoeld aluminium blok. Verwijder ook de GSP1 primers van-20 °C en laat toe om op kamertemperatuur te komen.
   2. Voeg 2 μL van de GSP1 primers toe aan elk goed van de eerste PCR-reagens strook buizen. Breng 18 μL van het ligatie 2 Cleanup-product over naar de eerste PCR-reagens strook buizen en meng door pipetteren op en neer 6 − 8 keer.
   3. Spin naar beneden en breng over naar een 96 goed PCR-plaat. Plaats de plaat in een Thermocycler-blok met een compression pad en voer het Thermocycler-programma uit: 95 °C 3 min, 15 cycli 95 °C 30 s − 65 °C 5 min (100% helling), 72 °C 3 min, 4 °C Hold (verwarmde deksel).
      Let op: dit is een veilig stoppunt en monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C 's nachts of bij-20 °C voor lange termijn opslag.
   4. Verwijder zuiverings parels van 4 °C en laat toe om op kamertemperatuur te komen. Vortex kralen ruim voor gebruik en Pipet de 24 μL in het juiste aantal putjes van een U-bodemplaat.
   5. Breng 20 μL van het eerste PCR-product over in de 24 μL kralen. Pipet teren op en neer 6 − 8 keer om gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te mengen en te inbroed, gevolgd door een incubatietijd van 2 minuten op de magneet.
   6. Verwijder en gooi de supernatant weg en voer 2 200 μL 70% ethanol wassingen uit met 30-s incubaties. Verwijder na de laatste wasbeurt alle 70% ethanol en laat de lucht gedurende 2 minuten drogen.
   7. Verwijder de magneet en stop de kralen opnieuw in 24 μL van 10 mM tris HCl pH 8,0. Incuberen de magneet 3 minuten, gevolgd door een incubatie van 2 minuten op de magneet. Ga onmiddellijk naar de tweede PCR.
10. Tweede PCR-en kraal zuivering
    1. Verwijder de tweede PCR-reagens strook buizen van 4 °C en plaats deze in een voorgekoeld aluminium blok. De juiste nummering van de tweede PCR-strip buizen is van cruciaal belang, aangezien sample-specifieke indexen op dit moment worden toegevoegd. Positioneer de buizen horizontaal met de scharnieren aan de achterzijde en gebruik een permanente marker om de buizen 1, 2, 3... van links naar rechts. Verwijder ook de GSP2 primers van-20 °C en laat toe om op kamertemperatuur te komen.
       Opmerking: het is ook essentieel voor het vastleggen van de voorbeeld-specifieke indexen voor volgordebepaling doeleinden (ze moeten worden ingevoerd in het werkblad sequencer).
    2. Voeg 2 μL van de GSP2 primers toe aan elk goed van de tweede PCR-reagens strook buizen. Breng 18 μL van het eerste PCR-Schoonmaakproduct over naar de tweede PCR-reagens strook buizen en meng door pipetteren op en neer 6 − 8 keer.
    3. Spin naar beneden en breng over naar een 96 goed PCR-plaat. Plaats de plaat in een Thermocycler-blok met een compression pad en voer het Thermocycler-programma uit: 95 °C 3 min, 18 Cycles 95 °C 30 s − 65 °C 5 min (100% helling), 72 °C 3 min, 4 °C Hold (verwarmde deksel).
       Let op: dit is een veilig stoppunt en monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C 's nachts of bij-20 °C voor lange termijn opslag.
    4. Verwijder zuiverings parels van 4 °C en laat toe om op kamertemperatuur te komen. Vortex kralen ruim voor gebruik en Pipet de 24 μL in het juiste aantal putjes van een U-bodemplaat.
    5. Breng 20 μL van het tweede PCR-product over naar de kralen. Pipet teren op en neer 6 − 8 keer om gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te mengen en te inbroed, gevolgd door een incubatietijd van 2 minuten op de magneet.
    6. Verwijder en gooi de supernatant weg en voer 2 200 μL 70% ethanol wassingen uit met 30-s incubaties. Verwijder na de laatste wasbeurt alle 70% ethanol en laat de lucht gedurende 2 minuten drogen.
    7. Verwijder de magneet en stop de kralen opnieuw in 24 μL van 10 mM tris HCl pH 8,0. Incuberen de magneet 3 minuten, gevolgd door een incubatie van 2 minuten op de magneet. Breng 20 μL van het tweede PCR Cleanup product over naar een nieuwe 96 goed PCR-plaat.
       Opmerking: dit is een veilig stoppunt en bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij-20 °C voor lange termijn opslag of onmiddellijk doorgaan naar bibliotheek kwantificering.
11. Bibliotheek kwantatie
    1. Verwijder de Master Mix en standaarden van de Library quantitatie van-20 °C en laat deze op kamertemperatuur komen.
    2. Voer 1:5 verdunning uit van alle bibliotheken (tweede PCR-product) met 10 mM tris HCl pH 8,0 gevolgd door een seriële verdunning van 1:199, 1:199 en 20:80 met 10 mM tris HCl pH 8,0 0,05% polysorbaat. De laatste twee verdunningen van respectievelijk 1:200000 en 1:1000000 zullen in drievat worden uitgevoerd.
    3. Voeg 6 μL Master Mix toe aan elk goed van een optische 96-put, gevolgd door 4 μL geschikte verdunning of standaard. Draai de plaat naar beneden en laad deze op het qPCR-instrument. Gebruik de volgende fiets condities: 1 cyclus 95 °C 5 min, 35 cycli 95 °C 30 s (4,4 °C/s helling snelheid) − 60 °C 45 s (2,2 °C/s helling snelheid).
    4. Nadat bibliotheek kwantificering voltooid is en bibliotheek concentraties worden bepaald (door middel van beide geteste verdunningen), Normaliseer alle bibliotheken tot 2 nM met 10 mM tris HCl pH 8,0. Maak de bibliotheek pool door 10 μL van elke genormaliseerde bibliotheek te combineren tot één micro centrifugebuis van 1,5 mL.
12. Sequencing van bibliotheken
    1. Verwijder de sequencer-reagens cartridge van-20 °C opslag en plaats in gedeïoniseerd (DI) water tot aan de vullijn gedurende ten minste 1 uur. Verwijder ook de sequencer-reagens Kit van 4 °C en laat ten minste 1 uur op kamertemperatuur komen. Het maximum aantal bibliotheken dat kan worden geordend op dit sequentiëren platform is 8 (waarvan er één de positieve controle moet zijn).
    2. Maak de gedenatureerde ampliconlengte voor temp Library (dal) pool door 10 μl van het bibliotheek zwembad te combineren met 10 μl van 0,2 N NaOH en inincuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie van 5 minuten 10 μL 200 mM tris HCl pH 7,0 toe, gevolgd door 970 μL HT1 hybridisatie buffer.
    3. Maak de laatste last buis door een combinatie van 300 μL van HT1, 25 μL van 20 pM PhiX en 675 μL van het DAL zwembad. Vortex en draai de laad buis. Voeg het volledige volume van de laad buis toe aan het monster goed van de sequencer-reagens cartridge en laad de cartridge in de sequencer met 2 x 151 BP-leesbewerkingen met 2 x 8-index leesbewerkingen.

2. gegevensanalyse

1. Verwerking en analyse van sequentiëren van gegevens
   1. Download sequentiemetrieken van het NGS-instrument.
   2. Zorg ervoor dat de volgorde gegevens in de onderstaande bereiken vallen (specifiek voor de kit die in dit voorbeeld wordt gebruikt). Cluster dichtheid (dichtheid [K/mm²]): 945 – 1600 K; % van leesbewerkingen doorgeven filter (clusters PF [%]): > 90%; kwaliteitsscores (% ≥ Q30): > 85%; PhiX-uitlijning (uitgelijnd%): 1,5 − 6,0%; PhiX-foutenpercentage (foutratio [%]): < 1,0%; leest doorgeven filter (leest PF [M]): > 22 miljoen.
      Opmerking: Sequentiëren wordt uitgevoerd niet voldoen aan deze metrische gegevens zijn onderhevig aan herhaling.
   3. Controleer de% van de leesbewerkingen toegeschreven aan elk voorbeeld (dat wil zeggen, elke sample-specifieke index). Voor een typische run waarin de PhiX Spike-in was ~ 5% en 8 monsters werden gesequenced, elk monster moet idealiter rekening voor ongeveer 11,9% van de leesbewerkingen. Het acceptabele bereik voor elk monster is 5 − 25%. Als er voorbeelden niet binnen dit bereik passen, herhaalt u de bibliotheek quantitatie en sequentiëren.
2. Verzending van onbewerkte sequentie gegevens naar het analyse algoritme
   Opmerking: versie 4.1.1.7 van ArcherDx-analyse wordt hier beschreven. In dit voorbeeld wordt de analyse software geïmplementeerd als een ' virtuele machine ' die wordt uitgevoerd op een interne server. Een centrale verwerkingseenheid (CPU) en 12 GB willekeurig geheugen (RAM) zijn vereist voor elk monster gelijktijdig worden geanalyseerd (meestal 8 monsters tegelijkertijd worden verwerkt waarbij 8 CPU en 96 GB RAM). De verwerking duurt doorgaans 3 − 8 uur.
   1. Gebruik standaard analyse-instellingen binnen het analysesysteem, met uitzondering van MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (dit wordt gewijzigd van 10 in 20) en READ_DEPTH_NORMALIZATION (dit is ingesteld op 0 om downsampling te voorkomen).
   2. Als u een analyse taak wilt starten, klikt u op analyse uitvoeren in de gebruikersinterface, verzendt u een naam voor de taak en selecteert u vervolgens de benodigde fastq-bestanden (zodat beide leesbewerkingen [R1 en R2] voor elk voorbeeld worden geselecteerd).
   3. Selecteer RNA Fusion voor RNA analyse types, Illumina (gekoppeld) voor platform, en Fusionplex Solid tumor panel voor target Region. Klik vervolgens op analyse verzenden.
3. Interpretatie van testgegevens
   1. Open de gebruikersinterface van het analysesysteem en selecteer de gewenste taak. Selecteer het voorbeeld van positieve controle. Zorg ervoor dat alle verwachte fusies en oncogene isovormen zijn gedetecteerd en worden vermeld op het tabblad sterke aanwijzingen .
      Opmerking: als een van de bijgehouden fusies in de positieve controle niet wordt gedetecteerd voor een bepaalde uitvoering van de test, kan dit een indicatie zijn van een probleem in die uitvoering, wat een herhaling noodzakelijk maakt (vanaf het begin van de test).
   2. Bekijk de Lees statistieken voor elk klinisch voorbeeld in de uitvoering door te klikken op het tabblad Lees statistieken . Elk monster moet worden vertegenwoordigd door ten minste 1.000.000 totaal fragmenten. Als minder dan 1.000.000, volg de hervolgorde van de bibliotheek met overwegingen voor opnieuw kwantificeren om ervoor te zorgen dat de initiële kwantatie niet aberrantly hoog was.
      Opmerking: monsters van goede kwaliteit worden over het algemeen weergegeven op doel% > 85% en de RNA- moleculaire bakken moeten > 20000 zijn en > 30% van de leesbewerkingen omvatten. Niet voldoen aan deze metrische gegevens wordt echter niet automatisch trigger voorbeeldfout.
   3. Inspecteer de gemiddelde unieke start sites per GSP2 controle waarde.
      Opmerking: deze waarde is een maatstaf voor de complexiteit van sequentiëren van primers tot vier huishoudelijke genen. Deze metriek is een kritische determinant van de RNA-kwaliteit in het monster (als de sequentie van genen die naar verwachting in het monster worden uitgedrukt slecht is, dan is het vertrouwen in het vermogen om een uitgesproken genfusie op te sporen laag). De cutoff voor deze statistiek is 20. Als een monster een waarde van minder dan 20 weergeeft, moeten de resultaten voor het monster worden gerapporteerd als niet-informatief als er geen high-Confidence fusie is gevonden. De status van deze statistiek kan ook worden bepaald op de overzichtspagina van de run (status wordt weergegeven als Fusion QC: Pass of Fusion QC: aantal unieke RNA GSP2 besturingselement start sites laag , afhankelijk van of de waarde groter dan of kleiner is dan 20). Een high-Confidence fusie in een steekproef die deze QC-metriek niet heeft doorstaan, kan nog steeds worden gerapporteerd als deze is vastbesloten om echt te zijn (zie hieronder). In het algemeen, hogere QC scores met behulp van deze metriek correleren met lagere PreSeq CT scores, zoals verwacht (Figuur 2).
4. Fusie oproep interpretatie
   1. Zorgvuldig te onderzoeken elke zogenaamde fusie onder de sterke bewijs tabblad (de meerderheid van de sterke bewijzen fusies door het systeem geroepen zijn artifeitelijk). Scan ook de zwakke evidence Fusion bin, hoewel de aanwezigheid van een niet-artifeitelijke fusie in deze afvalbak een uiterst zeldzaam voorval is. Voor het beoordelen van de geldigheid van een fusie, Noteer eerst de leesbewerkingen (#/%) en Start sites metrische gegevens.
      Opmerking: over het algemeen neemt het vertrouwen in een zogenaamde fusie toe hoe hoger deze metrische gegevens zijn. Fusies die worden ondersteund door minder dan 5 start locaties en met minder dan 10% van de leesbewerkingen van de ondersteunende primer moeten als zeer verdacht worden beschouwd als artifeitelijk.
   2. Noteer de pictogrammen die worden weergegeven in de kolom filters .
      Opmerking: verschillende van deze pictogrammen waarschuwen de gebruiker van een potentiële bron van een artifeitelijke aanroep. Frequente onder deze (en vooral te vinden in de zwakke bewijs afvalbak van de zogenaamde Fusions) zijn gevallen waarin de partners bekend paralogs zijn of vertonen gelijkenis met elkaar in volgorde (wat duidt op een waarschijnlijke verkeerd-priming of foutieve uitlijning). Een andere gemeenschappelijke bron van artifeitelijke fusie oproepen treedt op wanneer de Lees ondersteuning van de fusie bevatten een hoge foutratio die indicatief is voor slechte toewijzing aan het referentie-genoom, en dit is gekoppeld aan een duidelijk pictogram. Transcriptionele readthrough-gebeurtenissen worden geïdentificeerd via een ander pictogram. Deze zijn gebruikelijk en worden over het algemeen genegeerd. Verschillende andere pictogrammen worden ook gebruikt in de gebruikersinterface, maar een volledige beschrijving van alles valt buiten het bestek van dit artikel. Veelvoorkomende artefacten die over het algemeen zonder verder onderzoek kunnen worden genegeerd, zijn: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-erg, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, en FCGR2C-MAST.
   3. Visualiseer de ondersteunende leesbewerkingen voor elke potentiële fusie door te klikken op de Visualiseer link in de gebruikersinterface, die de gebruiker naar een webgebaseerde jbrowse-weergave van NHL van individuele Fusion-ondersteunende leesbewerkingen brengt. Bevestig dat de leesbewerkingen over het algemeen vrij van mismatch zijn (hoewel sommige lawaai te verwachten is), dat een significant deel (idealiter > 30 basen) van de leesbewerkingen uitlijnen op de fusie partner, en dat sequenties onmiddellijk grenzend aan het breekpunt tussen de genen en de primer binding sites zijn vrij van inserties of verwijderingen. Bevestig dat de uitgelijnde sequentie het 3 ' gedeelte van de primer bindende sequenties voor primers bevat die de fusie-leesbewerkingen ondersteunen (als 3 ' porties niet inbegrepen zijn, kan dit een indicatie zijn van verkeerd primen).
   4. Als Codeer sequenties van beide genen betrokken zijn bij de fusie, zorg er dan voor dat de 3 ' partner in-frame blijft. Klik op de Vertaal link in de interface (die een echte of valse status geeft voor elke combinatie van een referentie reeks) en bevestig ook handmatig dat de fusie in beeld is door middel van inspectie van de opgeroepen breekpunten in een genoom browser. De zogenaamde breekpunten kunnen worden bepaald door de muis over de rode stippen in het fusie schema te zweven.
      Opmerking: aangezien de meeste (maar niet alle) genomische breekpunten voor legitieme fusies optreden in intronic-gebieden en resulteren in het samen splitsen van hele exonen, worden fusies waarin Exon-grenzen de breekpunten voor beide partners vormen, over het algemeen met een hogere graad bekeken van vertrouwen. Aangezien er echter veel gepubliceerde voorbeelden zijn van mid-exonische breekpunten in fusies, mag dit niet worden gebruikt als absolute criteria bij de interpretatie van een fusie.
   5. Zorg er voor elke fusie handmatig voor dat de sequenties naast het breekpunt niet homoloog zijn voor de volgende verwachte aaneengesloten bases voor elke partner. Inspecteer alle mogelijke aaneengesloten exonen in een genoom browser.
      Opmerking: een gemeenschappelijke bron van articulaire fusie is een verkeerde uitlijning of verkeerd priming als gevolg van homologie tussen twee genpartners, en dit wordt niet altijd door het systeem opgeroepen via de hierboven beschreven pictogrammen.

Resultaten

Afgebeeld in Figuur 3, Figuur 4 en Figuur 5 zijn screenshots van de analyse gebruikersinterface die resultaten van een Long adenocarcinoom monster aantonen. In afbeelding 3wordt de voorbeeld samenvatting weergegeven (boven) die de aangeroepen sterke bewijs fusies, evenals de QC-status (rood omcirkeld). De ADCK4-numbl fusie (waarvan 3 isovormen worden vermeld) wordt onmiddellijk genegeerd omdat ...

Discussie

Verankerde multiplex PCR-gebaseerde doel verrijking en bibliotheek voorbereiding gevolgd door sequencing van de volgende generatie is zeer geschikt voor Multiplexed genfusie beoordeling in klinische tumormonsters. Door te focussen op RNA input in plaats van genomisch DNA, wordt de noodzaak om grote en repetitieve intronen te sequenties vermeden. Bovendien worden nieuwe fusies gedetecteerd, aangezien deze aanpak genfusies versterkt, ongeacht de identiteit van de fusie partner. Dit is een kritisch voordeel in de klinische ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 mM Tris HCl pH 8.0	IDT	11-05-01-13	Gebruikt voor TNA-verdunning
1M Tris pH 7.0	Thermo Fisher	AM9850G	Gebruikt in library pooling
25 mL Reagent Reservoir met verdeler	USA Scientific	9173-2000	Voor gebruik met multi-kanaals pipetters en grote reagentia volumes
96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural	USA Scientific	1402-9700	Plaat gebruikt voor thermocycler stappen
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	Gebruikt in zuivering na verschillende assay stappen
Agencourt Formapure Kit	Beckman Coulter	A33343	Gebruikt in TNA extractie
Archer FusionPlex Solid Tumor kit	ArcherDX	AB0005	Deze kit bevat de meeste reagentia die nodig zijn om library preparatie uit te voeren voor Illumina sequencing (kits voor Ion Torrent sequencing zijn ook beschikbaar)
Cold block, 96-well	Light Labs	A7079	Gebruikt voor het koel houden van monsters in verschillende stappen
Ethanol	Decon Labs	DSP-MD.43	Gebruikt voor bead wassen
Library Quantification for Illumina Internal Control Standard	Kapa Biosystems	KK4906	Gebruikt voor library kwantificatie
Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix	Kapa Biosystems	KK4973	Gebruikt voor library kwantificatie
Library Quantification Standards	Kapa Biosystems	KK4903	Gebruikt voor library kwantificatie
Magnet Plate, 96-well (N38 grade)	Alpaqua	A32782	Gebruikt in bead zuivering stappen
MBC Adapters Set B	ArcherDX	AK0016-48	Adapters die sample-specifieke indexen bevatten om multiplex sequencing mogelijk te maken
Micro Centrifuge	USA Scientific	2641-0016	Gebruikt voor het centrifugeren van PCR tubes
MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate	Thermo-Fisher	4483485	Gebruikt voor Pre-Seq QC library kwantificatie
Microamp Optical Film Compression Pad	Applied Biosystems	4312639	Gebruikt voor library kwantificatie
Mini Plate Spinner	Labnet	MPS-1000	Gebruikt voor het verzamelen van vloeistof op de bodem van plaat wells
MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)	Illumina	MS-102-3003	Bevat componenten die nodig zijn voor een MiSeq sequencing run
MiSeqDx System	Illumina		NGS Sequencing Instrument
Model 9700 Thermocycler	Applied Biosystems		Gebruikt voor verschillende stappen tijdens de assay
nuclease free water	Ambion	9938	Gebruikt als algemeen verdunningsmiddel
Optical ABI 96-well PCR plate covers	Thermo-Fisher	4311971	Gebruikt voor Pre-Seq QC library kwantificatie
PCR Workstation Model 600	Air Clean Systems	BZ10119636	Wet-bench assay stappen worden uitgevoerd in deze 'dead air box'
Proteinase K	Qiagen	1019499	Gebruikt in TNA extractie
QuantStudio 5	Applied Biosystems	LSA28139	qPCR instrument gebruikt voor PreSeq en library kwantificatie
Qubit RNA HS Assay Kit	Life Technologies	Q32855	Gebruikt voor het bepalen van RNA concentratie in TNA samples
RNase Away	Fisher	12-402-178	Gebruikt voor algemene RNase decontaminatie van werkgebieden
Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2	SeraCare	0710-0129	Gebruikt als positieve controle voor de assay
Sodium Hydroxide	Fisher	BP359-212	Gebruikt in opruim stappen en voor sequencing setup
SYBR Green Supermix	Bio Rad	172-5120	Component van PreSeq QC Assay
TempAssure PCR 8-tube Strips	USA Scientific	1402-2700	Gebruikt voor reagentia en monster mixen etc.
Template RT PCR film	USA Scientific	2921-7800	Gebruikt voor het afdekken van 96-well plates
U-Bottom 96-well Microplate	LSP	MP8117-R	Gebruikt tijdens bead zuivering