Dit artikeldetails het gebruik van een verankerde multiplex polymerase keten reactie gebaseerde bibliotheek Voorbereidingspakket gevolgd door de volgende generatie sequencing om te beoordelen voor oncogene gen fusies in klinische solide tumormonsters. Zowel de natte bank als de gegevensanalyse stappen worden beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oncogene Genfusie detectie met behulp van verankerde multiplex polymerase kettingreactie gevolgd door sequenties van de volgende generatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gen-fusies dragen vaak bij aan het oncogene fenotype van veel verschillende soorten kanker. Bovendien beïnvloedt de aanwezigheid van bepaalde fusies in monsters van kankerpatiënten vaak rechtstreeks de diagnose, prognose en/of therapie selectie. Als gevolg hiervan is de nauwkeurige detectie van genfusies een essentieel onderdeel van het klinisch beheer voor vele ziekte types geworden. Tot voor kort werd klinische genfusie detectie voornamelijk bewerkstelligd door het gebruik van enkelvoudige assays. De steeds groeiende lijst van genfusies met klinische significantie heeft echter een noodzaak gecreëerd om de fusie status van meerdere genen gelijktijdig te beoordelen. Tests van de volgende generatie sequencing (NGS) hebben aan deze vraag voldaan door het vermogen om nucleïnezuur te sequentiëren in massaal parallelle mode. Meerdere op NGS gebaseerde benaderingen die verschillende strategieën hanteren voor gendoel verrijking zijn nu beschikbaar voor gebruik in klinische moleculaire diagnostiek, elk met zijn eigen sterke en zwakke punten. Dit artikel beschrijft het gebruik van verankerde multiplex PCR (AMP)-gebaseerde doel verrijking en bibliotheek voorbereiding gevolgd door NGS om te beoordelen op genfusies in klinische solide tumor specimens. AMP is uniek onder de op amplicon gebaseerde verrijkings benaderingen, omdat het genen fusies identificeert, ongeacht de identiteit van de fusie partner. Gedetailleerd hier zijn zowel de natte bank en data analysestappen die zorgen voor nauwkeurige genfusie detectie van klinische monsters.
Inleiding
De fusie van twee of meer genen in één transcriptionele entiteit kan optreden als gevolg van grootschalige chromosomale variaties, waaronder verwijderingen, duplicaties, inserties, Inversies en translocaties. Door veranderde Transcriptionele controle en/of veranderde functionele eigenschappen van het uitgedrukte genproduct, kunnen deze fusie genen oncogene eigenschappen toekennen aan kankercellen1. In veel gevallen, Fusion genen zijn bekend om op te treden als primaire oncogene drivers door het direct activeren cellulaire proliferatie en overleving trajecten.
De klinische relevantie van genfusies voor kankerpatiënten....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding en sequencing van bibliotheken
- Algemene assay-overwegingen en pre-assay stappen
- Test runs bestaan meestal uit zeven klinische monsters en één positieve controle (hoewel het aantal monsters per bibliotheek voorbereidings uitvoering kan worden aangepast indien nodig). Gebruik een positieve controle die ten minste meerdere gen-fusies bevat (de testdoelen) die door een fabrikant zijn bevestigd en/of zijn bevestigd door een orthogonale methodologie. Een non-template Control (NTC) moet worden opgenomen als een extra monster in elke assay run, maar wordt alleen uitgevoerd door de tweede streng cDNA synthese en pre-sequent....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Afgebeeld in Figuur 3, Figuur 4 en Figuur 5 zijn screenshots van de analyse gebruikersinterface die resultaten van een Long adenocarcinoom monster aantonen. In afbeelding 3wordt de voorbeeld samenvatting weergegeven (boven) die de aangeroepen sterke bewijs fusies, evenals de QC-status (rood omcirkeld). De ADCK4-numbl fusie (waarvan 3 isovormen worden vermeld) wordt onmiddellijk genegeerd omdat .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Verankerde multiplex PCR-gebaseerde doel verrijking en bibliotheek voorbereiding gevolgd door sequencing van de volgende generatie is zeer geschikt voor Multiplexed genfusie beoordeling in klinische tumormonsters. Door te focussen op RNA input in plaats van genomisch DNA, wordt de noodzaak om grote en repetitieve intronen te sequenties vermeden. Bovendien worden nieuwe fusies gedetecteerd, aangezien deze aanpak genfusies versterkt, ongeacht de identiteit van de fusie partner. Dit is een kritisch voordeel in de klinische .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
D.L.A. heeft advieskosten ontvangen van Bayer oncology, Genentech, AbbVie en Bristol Myers Squibb. K. D. D heeft gesponsorde reizen ontvangen van ArcherDx.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de moleculaire pathologie gedeelde bron van de Universiteit van Colorado (National Cancer Institute Cancer Center ondersteuning Grant No. P30-CA046934) en door het centrum van Colorado voor gepersonaliseerde geneeskunde.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Gebruikt voor TNA-verdunning |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Gebruikt in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir met verdeler | USA Scientific | 9173-2000 | Voor gebruik met multi-kanaals pipetters en grote reagentia volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plaat gebruikt voor thermocycler stappen |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Gebruikt in zuivering na verschillende assay stappen |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Gebruikt in TNA extractie |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | Deze kit bevat de meeste reagentia die nodig zijn om library preparatie uit te voeren voor Illumina sequencing (kits voor Ion Torrent sequencing zijn ook beschikbaar) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Gebruikt voor het koel houden van monsters in verschillende stappen |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Gebruikt voor bead wassen |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Gebruikt voor library kwantificatie |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Gebruikt voor library kwantificatie |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Gebruikt voor library kwantificatie |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Gebruikt in bead zuivering stappen |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters die sample-specifieke indexen bevatten om multiplex sequencing mogelijk te maken |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Gebruikt voor het centrifugeren van PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Gebruikt voor Pre-Seq QC library kwantificatie |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Gebruikt voor library kwantificatie |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Gebruikt voor het verzamelen van vloeistof op de bodem van plaat wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Bevat componenten die nodig zijn voor een MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Gebruikt voor verschillende stappen tijdens de assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Gebruikt als algemeen verdunningsmiddel |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Gebruikt voor Pre-Seq QC library kwantificatie |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay stappen worden uitgevoerd in deze 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Gebruikt in TNA extractie |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument gebruikt voor PreSeq en library kwantificatie |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Gebruikt voor het bepalen van RNA concentratie in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Gebruikt voor algemene RNase decontaminatie van werkgebieden |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Gebruikt als positieve controle voor de assay |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Gebruikt in opruim stappen en voor sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component van PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Gebruikt voor reagentia en monster mixen etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Gebruikt voor het afdekken van 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Gebruikt tijdens bead zuivering |
Referenties
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
