Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om endogene RNA binding sites of "Footprints" van RNA: proteïne (RNP) complexen uit zoogdiercellen te verrijken. Deze aanpak omvat twee immunoprecipitaties van RNP-subeenheden en wordt daarom nagesynchroniseerde RNA-immunoprecipitatie in tandem (RIPiT).

Samenvatting

RNA-immunoprecipitatie in tandem (RIPiT) is een methode voor het verrijken van RNA-voetafdrukken van een paar eiwitten binnen een RNA: proteïne (RNP)-complex. RIPiT maakt gebruik van twee zuiveringsstappen. Ten eerste wordt immunoprecipitatie van een gelabelde RNP-subeenheid gevolgd door milde RNase-spijsvertering en daaropvolgende niet-denaturerende affiniteits elutie. Een tweede immunoprecipitatie van een andere RNP-subeenheid maakt verrijking van een gedefinieerd complex mogelijk. Na een denaturerende elutie van Rna's en eiwitten worden de RNA-voetafdrukken omgezet in bibliotheken met een hoge doorvoer voor DNA-sequencing. In tegenstelling tot de meer populaire ultraviolet (UV) crosslinking gevolgd door immunoprecipitatie (clip) benadering om RBP binding sites te verrijken, ripit is UV-crosslinking onafhankelijk. Vandaar RIPiT kan worden toegepast op talrijke eiwitten aanwezig in het RNA interactome en daarbuiten die essentieel zijn voor RNA verordening, maar niet direct contact op met het RNA of UV-crosslink slecht om RNA. De twee zuiveringsstappen in RIPiT bieden een bijkomend voordeel van het identificeren van bindende locaties waar een eiwit van belang in samenwerking met een andere cofactor fungeert. De dubbele zuiverings strategie dient ook om het signaal te verbeteren door de achtergrond te beperken. Hier bieden we een stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van RIPiT en het genereren van high-throughput sequencing-bibliotheken van geïsoleerde RNA-voetafdrukken. We schetsen ook de voordelen en toepassingen van RIPiT en bespreken enkele van de beperkingen.

Inleiding

Binnen cellen bestaat RNA in complex met eiwitten om RNA te vormen: eiwitcomplexen (RNPs). RNPs worden geassembleerd rond RNA bindende eiwitten (RBPs, die direct binden RNA) maar ook bestaan uit niet-RBPs (die binden RBPs maar niet RNA), en zijn vaak dynamisch van aard. RBPs en hun cofactoren functioneren collectief binnen RNPs om regelgevende functies uit te voeren. Bijvoorbeeld, in de nonsens-gemedieerde mRNA Decay (NMD)-pathway herkennen de UPF-eiwitten (UPF1, UPF2 en UPF3b) het voortijdig beëindigde ribosome. Elk van de UPF eiwitten kan binden aan RNA, maar het is pas wanneer ze samen assembleren dat een actief NMD-complex begint te vormen. Binnen dit complex wordt UPF1 verder geactiveerd door fosforylering door een niet-RBP SMG1, en een dergelijke UPF1 activering leidt uiteindelijk tot de werving van mRNA Decay inducerende factoren^1,2. In dit voorbeeld vereisen Rbp's niet-RBP-cofactoren voor werving en activering van het RNP-complex dat NMD activeert. Nog een andere eigenschap van RNPs is hun compositorische heterogeniteit. Overweeg de spliceosome, die bestaat in verschillende E, A, B of C complexen. Verschillende spliceosoom complexen hebben overlappende en uitgesproken eiwitten³. Om RNP-functies te bestuderen, is het belangrijk om te verhelmaken welke Rna's gebonden zijn aan een RBP en de bijbehorende eiwitten. Er zijn veel methoden om dit te bereiken, waarbij elke benadering zijn duidelijke voor-en nadelen heeft^4,5,6,7.

De meest populaire methoden om RBP binding sites te identificeren-crosslinking gevolgd door immunoprecipitatie (clip) en de verschillende variaties-vertrouw op ultraviolet (UV) licht om een RBP te crosslinken naar RNA⁸. Echter, dit is niet een effectieve aanpak voor niet-RBPs binnen RNPs, die niet rechtstreeks contact opnemen met het RNA. Hier beschrijven we een alternatieve aanpak die van toepassing is op Rbp's en niet-RBPs, om hun RNA binding-sites te isoleren en te identificeren. Deze aanpak genoemd RNA-immunoprecipitatie in tandem (ripit) bestaat uit twee immunoprecipitatie-stappen, die helpen bij het bereiken van een hogere specificiteit in vergelijking met een enkele zuivering (Figuur 1)^9,10. Aangezien de individuele immunoprecipitatie (IP)-stappen met een lagere stringentie kunnen worden uitgevoerd in vergelijking met de clip, is ripit niet afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen die de aanwezigheid van sterke detergenten tijdens immunoprecipatie kunnen weerstaan. Het meest unieke voordeel van RIPiT is de mogelijkheid om twee verschillende eiwitten te targeten in twee zuiveringsstappen; Dit biedt een krachtige manier om een compositioneel verschillend RNP-complex van andere vergelijkbare complexen¹¹te verrijken.

Kleine variaties op de RIPiT-procedure kunnen de RNP-verrijking verder verbeteren. Sommige interacties van RNA-eiwit of eiwit-eiwit binnen RNPs zijn bijvoorbeeld van voorbijgaande aard en het kan moeilijk zijn om voetafdrukken van dergelijke complexen efficiënt te zuiveren. Om dergelijke interacties te stabiliseren, kan rnps worden gecrosslinkt in cellen met formaldehyde voorafgaand aan cel lysis en ripit. We hebben bijvoorbeeld geconstateerd dat een zwakke interactie tussen de kernfactor van Exon Junction (EJC), EIF4AIII en de disassemblage factor van EJC, PYM¹² kan worden gestabiliseerd met een formaldehyde-behandeling, zodat meer RNA-voetafdrukken worden verrijkt (gegevens niet weergegeven). Voorafgaand aan de celoogst en de RIPiT, cellen kunnen ook worden behandeld met drugs te stabiliseren of te verrijken RNPs in een bepaalde staat. Bijvoorbeeld, bij het bestuderen van eiwitten die worden verwijderd uit mRNA tijdens de vertaling (bijvoorbeeld, de EJC¹³, UPF1¹⁴), behandeling met Vertaal remmers zoals puromycine, haring of harringtonine kan leiden tot verhoogde bezetting van eiwitten op Rna's.

De hoeveelheid RNA teruggewonnen uit RIPiT is meestal laag (0,5-10 pmollen, dat wil zeggen, 10-250 ng RNA gezien een gemiddelde RNA-lengte van 75 NT). De belangrijkste reden hiervoor is dat slechts een klein deel van een gegeven eiwit aanwezig is in complex met andere eiwitten binnen RNPs (elk "vrij" eiwit dat IP'ed in de eerste stap gaat verloren tijdens het tweede IP). Om RNA-SEQ-bibliotheken van dit RNA te genereren, schetsen we hier ook een aanpassing van het eerder gepubliceerde protocol dat geschikt is voor dergelijke lage RNA-ingangen^15,16 (Figuur 2), die een high-throughput sequencing voorbereide samples in 3 oplevert Dagen.

Protocol

1. vaststelling van stabiele HEK293 cellijnen die tetracycline-induceerbaar markeren-gelabeld proteïne van belang (POI)

1. Seed HEK293 cellen met een stabiel geïntegreerde FLP recombinatie target (FRT)-site met een dichtheid van 10 x 10⁴ cellen/ml in het groeimedium (dulbecco's gemodificeerde eagle's medium [DMEM] + 10% foetaal runderserum [FBS] + 1% penicillaire-streptomycine [Penn/STREP]) in 6- goed borden. Laat cellen 's nachts groeien in een bevoficeerde incubator bij 37 °C en 5% CO₂ (standaard groeicondities voor alle volgende stappen).
2. De volgende dag moeten cellen ~ 70% Confluent zijn. Volgens transfectie reagens protocol, transfect de FRT site-bevattende HEK293 cellen met een 9:1 verhouding van pcDNA5-Teto-Flag-POI: pOG44.
   Opmerking: De vlag tag heeft de sequentie motief DYKDDDDK (D = Aspartic acid acid, Y = tyrosine, en K = lysine).
3. Na 24 h, beginnen met antibiotica selectie. Verwijder media en voeg een nieuw groeimedium toe, aangevuld met 100 μg/mL hygromycine. Binnen 72 h moeten niet-getransfunde cellen beginnen te sterven.
4. Elke 48-72 h, verander de groeimedia en vul aan met verse hygromycine.
5. Na ~ 2 weken van selectie, zullen discrete kolonies van stabiel getransfunde cellen beginnen te verschijnen. Als kolonies zichtbaar zijn voor het blote oog, voeg dan 1 mL trypsine toe aan de plaat en inincuberen gedurende 5 minuten bij 37 °C. Respendeer cellen in DMEM, breng cellen over in een nieuwe 10 cm plaat en pas het volume aan op 10 mL vers groeimedium aangevuld met 100 μg/mL hygromycine. Laat de plaat ~ 80% confluentie bereiken om cellen verder uit te breiden om permanente voorraden voor te bereiden.
6. Bepaal de hoeveelheid tetracycline (tet) die nodig is om het optimale niveau van de vlag-POI-expressie voor het experiment te verkrijgen. Kweekcellen in 12-well formaat en voer een titratie van Tet tussen 0-1000 ng/mL bereik voor 16-24 h. Voer westerse blots uit op de titratie monsters met antilichamen tegen de POI.
   Opmerking: Voor eiwitten tot ~ 60 kDa, de vlag-Tagged en de endogene kopie van het eiwit kan worden opgelost op de natriumdodecyl sulfaat-Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) om expressieniveaus van FLAG-POI te vergelijken met de endogene tegenhanger. Voor grotere eiwitten, signaalintensiteit in Tet-geïnduceerde monsters kan worden vergeleken met niet-geïnduceerde monster. De tetracycline stockoplossing kan worden bereid op 1 mg/mL in 100% ethanol. Verdunningen van de kolf voor celkweek werk moeten in steriel water of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zijn. Tetracycline voorraad moet eenmaal per maand vers worden bereid.

2. culturing cellen voor tetracycline inductie en RIPiT procedure

1. Zaad stabiel geïntegreerde FLAG-POI HEK293 bij een dichtheid van 3 x 10⁵ cellen/ml in groeimedium in 15 cm platen. Laat cellen groeien bij 37 °C en 5% CO₂.
   Opmerking: Over het algemeen zullen drie tot 5 15 cm platen ~ 2-20 pmol van RNA voetafdrukken opleveren, afhankelijk van de overvloed van de RNP van belang. Als rnps formaldehyde-gecrosslinkt is en onder strikte voorwaarden wordt gezuiverd, kan er tweemaal zoveel invoer nodig zijn.
2. Voeg tetracycline aan vooraf bepaalde optimale concentratie aan de media voor het opwekken van de uitdrukking van de vlag-POI (zie stap 1,6) 16-24 h voordat cellen zullen worden geoogst.
   Opmerking: Het is niet nodig om het groeimedium te veranderen. Cellen moeten klaar om te oogsten over 72 h na zaaien of wanneer platen zijn ~ 80% Confluent. Het is belangrijk om te voorkomen dat cellen Confluent worden.

3. celoogsten, formaldehyde behandeling en Celllysis

1. Was de monolaag cellen voorzichtig met 15 ml gekoelde PBS voor elke 15 cm plaat. Plak vervolgens cellen in 30 mL PBS. Als cellen werden behandeld met drugs voorafgaand aan de oogst, supplement PBS met de drug. Verzamel alle cellen in 50 mL conische buis.
   Opmerking: Voor het behoud van zwakke interacties kunnen cellen worden gecrosslinkt met formaldehyde: Voeg formaldehyde toe aan de celsuspensie van stap 3,1 tot een eindconcentratie van 0,1% en inincubatie op een rocker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg 3 mL van de afschrikkings buffer toe (tabel 1 ) en 5 extra minuten om te rocken.
2. Pellet cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi supernatant weg.
3. Lyse cellen in 4 mL ijskoude hypotone lysisbuffer (HLB; Tabel 1). Gebruik een P1000 pipet om cellen te respenderen. Breng op een 5 ml tube en incubeer lysaat op ijs gedurende 10 minuten.
4. Plaats het lysaat in een ijsbad en sonificeren met een amplitude van 10% voor 30 s met 1 s pulsen met 2 s pauzes. Pas vervolgens de zoutconcentratie aan tot 150 mM door 108 μL van 5 M NaCl toe te voegen.
   Opmerking: Met formaldehyde-gecrosslinkt monsters kunnen strengere lysis en zuivering worden verkregen door 0,1% van de SDS en het natrium deoxycholaat in de lysisbuffer op te slaan.
5. Wis het lysaat door centrifugeren bij 21.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Verzamel 20 μL supernatant (celextract) in een gelabelde buis voor de analyse van eiwit niveaus in de Western Blot (Zie Figuur 3a).
   Opmerking: Terwijl lysaat in centrifuge is, kunnen de vlag agarose kralen worden gewassen (zie stap 4,1). Markeer agarose kralen worden voorgespoeld 3x in 4 mL ijskoude isotone wasbuffer (IsoWB, tabel 1).

4. Markeer Immunoprecipitation

1. Breng de resterende supernatant van stap 3,5 tot 750 μL vooraf gewassen vlag agarose kralen in een 5 mL buis (bed volume van gewassen vlag agarose kralen zal zijn 375 μL). Inincuberen vlag agarose kralen en celextract voor 1-3 h bij 4 ° c met zachte menging.
   Opmerking: Dit volume van de vlag agarose kralen moet voldoende zijn voor een breed scala aan eiwitten, maar kan worden geoptimaliseerd, indien nodig.
2. Pellet vlag agarose kralen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 1 minuut bij 4 °c. Verzamel 20 μL van het supernatant in een gelabelde buis voor analyse van het eiwitgehalte in de Western Blot in het extract van verarmd cellen (Zie Figuur 3a). Gooi de overgebleven supernatant weg.
3. Voor het wassen van de vlag agarose kralen, Voeg 4 mL IsoWB en respenderen. Pellet kralen bij 400 x g gedurende 1 minuut bij 4 °c. Verwijder voorzichtig supernatant. Herhaal 4x.
   Opmerking: Voor strenge wassing van de formaldehyde-gecrosslinkt IPS, kan 0,1% elk SDS en natriumdeoxycholaat in de wasbuffer worden opgenomen voor de eerste twee wasstappen.

5. RNase I spijsvertering

1. Verdun RNase I tot 0.002-0,01 eenheden/mL in 750 μL IsoWB (de juiste concentratie voor de gewenste afmetingen van de voetafdruk moet empirisch worden bepaald). Voeg IsoWB-RNase I toe aan gewassen vlag agarose kralen en inincuberen met zacht mengen bij 4 °C gedurende 10 minuten.
2. Pellet kralen bij 400 x g gedurende 1 minuut bij 4 °c. Verzamel 20 μL supernatant (RNase I elution) in een gelabelde buis voor Western Blot-analyse. Gooi IsoWB-RNase I en Wash vlag agarose kralen 4x met IsoWB zoals beschreven in stap 4,3.

6. affiniteit-elutie

1. Maak een voorraad van elutie buffer (vlag peptide bij 250 ng/mL in IsoWB). Breng 375 μL elutie buffer aan op de vlag van agarose-kralen en schud zachtjes bij 4 °C voor 1-2 h. pellet vlag agarose kralen en verzamel een 15 μL aliquot van de elutie voor Western Blot van eiwitten in FLAG IP (Zie Figuur 3a).
   Opmerking: Wanneer de affiniteits-elutie aan de gang is, kan sectie 7 worden uitgevoerd.

7. magnetische kraal-antilichaam conjugatie

1. Wassen 50 μL magnetische kralen (dat wil zeggen, Dynabeads; Tabel met materialen) 3x in 1 mL IsoWB in 1,5 mL buis. Respendeer magnetische parels in 100 μL conjugatie buffer. Voeg de juiste hoeveelheid antilichaam toe (exacte hoeveelheid antilichaam voor gebruik voor IP moet empirisch worden bepaald voor elk antilichaam).
   Opmerking: Eiwitten een magnetische kralen zijn optimaal voor antilichamen geproduceerd in konijn terwijl proteïne G magnetische kralen zijn meer geschikt voor muis antilichamen. Magnetische kralen compatibiliteitsgrafiek is beschikbaar op de website van de leverancier om kralen te kiezen die geschikt zijn voor elk antilichaam.
2. Was magnetische parels 2x in conjugatie buffer (tabel 1). Inbroed mengsel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 min. Rebreng magnetische kralen in 375 μL RIPiT verdunningsbuffer. Opslaan op ijs tot de volgende stap.

8. tweede immunoprecipitatie

1. Resterende vlag affiniteit elutie van stap 6,1 toepassen op magnetische kralen gekoppeld aan antilichamen tegen het eiwit van belang. Inbroed met zacht mengen bij 4 °C voor 1-2 h. Leg magnetische parels vast op een magneet en verzamel 15 μL supernatant voor analyse van ongebonden eiwitten via Western Blot. Was de magnetische kralen 7X met 1 mL IsoWB.

9. denaturerende elutie

1. Voeg 100 μL heldere monster buffer (tabel 1) toe aan magnetische kralen en respendeer met een P200 pipet. Inincuberen op ijs voor 10 min. Veeg zachtjes om de kralen periodiek te hervatten.
2. Leg magnetische parels vast op een magneet en verzamel 15 μL elutie voor analyse van eiwitten in ripit elutie via Western Blot (Zie Figuur 3a). Overdracht resterende elutie in een nieuw gelabelde 1,5 mL buis.
   Opmerking: Als de monsters formaldehyde-crosslinked zijn, moeten de monsters gedurende 1 uur bij 65 °C worden geïnfiltreerd om de dwarsbinding te keren.
3. Voer westerse blots op monsters verzameld op verschillende stappen (input, vlag IP uitputting, vlag IP, tweede IP-uitputting, tweede IP-elutie). DEP met antilichamen tegen de twee aas-eiwitten, hun andere interactoren indien bekend, en ten minste één niet-interagerende RBP als een negatieve controle (Figuur 3a).

10. RNA-extractie en eind uitharding

1. Aan de RIPiT elution, voeg 320 μL RNase-vrij ddH₂O, 400 μL fenol-chloroform isoamyl alcohol (PCIAA, pH 4,5) en Vortex gedurende 30 sec. en spin bij kamertemperatuur bij 12.000 x g gedurende 5 min. Verzamel 350 μL waterige fase in een aparte buis. Voeg 35 μL Natriumacetaat van 3 M, 1 μL van 1 M MgCl₂, 10 μg glycogeen en 1 ml 100% ethanol toe. Inincuberen bij-20 °C.
2. Tot pellet RNA, centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c. Was RNA in 70% ethanol.
3. Verwijderen van 3 ' fosfaat links op RNA na RNase I decolleté, regenereren RNA pellet in 17 μL RNase-vrij ddH₂O, en voeg 2 ΜL 10x T4 polynucleotide kinase (PNK) buffer (tabel van de materialen) en 1 μL T4 PNK. Incuberen bij 37 °C gedurende 30 minuten.
   Opmerking: De 3 ' fosfatase activiteit van T4 PNK heeft een optimale activiteit bij pH 6¹⁷. De PNK-reactiebuffer is geoptimaliseerd voor de 5 ' kinase activiteit van T4 PNK en heeft een pH van 7,6. Tijdens het aanpassen van de pH van de einduithardings reactie is geprobeerd, deze stap kan verder worden geoptimaliseerd.
4. Voeg 380 μL RNase-vrije ddH₂O en 400 ΜL PCIAA pH 4,5 toe aan de buis. Vortex voor 30 s, centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 min. Verzamel een waterige fase en voeg 35 μL Natriumacetaat van 3 m, 1 μL van 1 m MgCl₂, 10 μg glycogeen en 1 ml 100% ethanol toe.
5. Inincuberen bij-20 °C. Pellet en Wash RNA met 70% ethanol zoals hierboven. Respendeer RNA in 4,5 μL RNase-vrij water.

11. schatting van de grootte en abundantie van de RNA-voetafdruk

1. Er wordt verwacht dat een succesvolle RIPiT 1 pmol of meer RNA-fragmenten oplevert. Om de werkelijke opbrengst te kwantificeren, breng 0,7 μL RIPiT RNA (~ 1/6 van de totale opbrengst) over in een nieuwe buis. Voeg 2 μL 10x T4 PNK-buffer, 1 μL van 1 mM ATP, 40 μCi γ³²P-ATP (0,5 − 1,0 μL van de kolf) en 1 ΜL T4 PNK toe. Stel het volume in op 10 μL en inincuberen bij 37 °C gedurende 30 minuten.
   1. In parallel PNK reacties, label een lage bereik DNA-ladder en 0,1 pmol van een synthetische RNA of DNA-oligo (20-40 NT) om een grootte en kwantiteit normen te gebruiken.
2. Oplossen gelabeld RNA/DNA op 26% ureum-pagina gel (20 x 27 x 0,45 mm³). De gel moet gedurende 30 minuten worden uitgevoerd bij 35 W. Spoel putten vóór de pre-run en vóór het laden van samples en lopen bij 35 W totdat Broom fenol Blue Dye front bijna het einde van de gel heeft bereikt.
3. Verwijder voorzichtig gel van glasplaten op een stuk van 8 x 11 inch filtreerpapier. Met gel bovenop papier, plaats in een gel droogapparaat en bedek met een stukje plastic folie. Droge gel bij 80 °C gedurende 1 uur met vacuüm.
4. Bloot gedroogde gel 's nachts aan een fosfoscreen of totdat er voldoende signaal wordt gedetecteerd. Beeld fosfoscreen. Goede kwaliteit RNA van een RIPiT moet verschijnen als een uitstrijkje in de rijstrook, met minimale prominente bands (Figuur 3B). Om RNA te kwantificeren, vergelijk de signaalintensiteit van de gewenste grootte RNA-fragmenten in RIPiT Lane naar het signaal van 0,1 pmol van gelabelde synthetische oligo.
   Opmerking: Als alternatief kunnen de grootte en bedragen van de RNA-voetafdruk worden geverifieerd met behulp van een zeer gevoelige bioanalyzer (Figuur 3C).

12. Ligatie van de adapter

1. Bereid RIPiT RNA zodanig dat ten minste 3 pmol RNA wordt opgelost in 3,8 μL water.
2. In een 0,2 mL polymerase kettingreactie (PCR) buis, combineren 3,8 μL RNA, 1 μL miR-CAT-33 pre-adenylated adapter (7 μM) (tabel van de materialen). Inbroed de mix op een thermische cycler bij 65 °C gedurende 10 min, 16 °C gedurende 5 minuten en houd vervolgens vast aan 4 °C.
   Opmerking: De pre-adenylated linker kan worden besteld bij oligo synthese service, of een aangepaste unadenylated DNA-oligo uit elke oligo synthese dienst kan worden geadenyleerd met behulp van mth RNA ligase (tabel van materialen) en gel gezuiverd.
3. Aan dezelfde buis, voeg 1,5 μl van 10x T4 RNA ligase buffer, 7,5 μl 50% polyethyleenglycol 8000 (peg-8000), 0,75 μl van 20 mm dithiotreïtol (DTT), en 0,45 μl T4 RNL2 tr. K227Q (tabel van de materialen).
   Opmerking: 50% PEG-8000 wordt geleverd met RNA ligase en buffer aangeschaft. PEG-8000-oplossingen zijn visceus en moeten langzaam worden pipetteren.
4. Inincubate reactie in de thermische cycler bij 30 °C gedurende 6 uur, Verwarm de ligase bij 65 °C gedurende 10 minuten en houd vervolgens bij 4 °C.

13. omgekeerde transcriptie

1. Aan de buis met de ligatie-mix van stap 12,4, voeg 11,25 μl van 4x deoxynucleotide trifosfaat (dNTP) mix toe, die een mengsel van reguliere en biotinyleerd dntp's bevat (Zie tabel 1), 1,0 μl 10 μM RT primers (tabel met materialen) en 6,8 μL RNase-vrij water. Inincuberen bij 65 °C gedurende 5 min, dan vasthouden bij 4 °C.
2. Breng buizen over naar ijs en voeg 9,0 μL van 5x eerste-streng (FS) buffer toe zonder MgCl₂ (tabel 1), 2,25 ΜL van 100 mM DTT, 1,2 μL reverse transcriptase enzym tot een eindvolume van 45 μL (Inhoudsopgave).
3. Inincuberen in een thermische cycler bij 55 °C gedurende 30-60 min. Verwarm de omgekeerde transcriptase gedurende 15 minuten bij 70 °C en houd het monster bij 4 °C.

14. zuivering van het RT-product

1. Voeg 45 μL van 2x ureum belasting buffer (tabel 1) toe aan de RT-reactie. Verdun 1 μg DNA-ladder met een laag bereik in 45 μL en voeg 45 μL van 2x ureum belasting buffer toe.
2. Bereid 10% ureum-pagina gel (20 x 28 x 0,15 cm³; Tabel 1) met 8-well kam. Gebruik spuit of Pipet, spoel putten met 0,5 x tris/borate/EDTA (TBE)-buffer.
   Opmerking: De zelfgemaakte gels hierboven bieden betere resolutie bij het scheiden van het uitgebreide RT-product van de niet verlengde RT primer. Als alternatief kunnen ook Pre-cast urea-pagina gels worden gebruikt (tabel metmaterialen). Aangezien Pre-cast gels kleinere maximum volumes per putje toestaan, moeten de monsters worden onderverdeeld in meerdere putten. Pre-cast gels moeten worden uitgevoerd bij 150 − 200 V.
3. Pre-run de gel op 35 W voor 30 min. Spoel Wells opnieuw, laad samples en run gel op 35 W totdat Broom fenol Blue Dye front is gemigreerd naar ongeveer 1 inch vanaf het einde van de gel.
   Opmerking: Gebruik metalen koellichaam tijdens de pre-run en de laatste run om gel oververhitting te voorkomen.
4. Vlek de gel 5 min in 1x goud nucleïnezuur gel vlek oplossing bereid in 0.5 x TBE. Deze kleurstof is lichtgevoelig, dus Vermijd blootstelling aan licht.
5. Image gel op fluorescerende scanner voor documentatiedoeleinden met behulp van 520 nm excitatie en 580 nm-emissie filters. Als een fluorescerende scanner niet beschikbaar is, gebruik dan een blauwe licht transilluminator. Het RT-product moet worden weergegeven als een uitstrijkje dat begint boven de niet-verlengde RT-primer (Figuur 4).
   Opmerking: Hoewel de gouden nucleïnezuur gel kleuring kleurstof gemakkelijk wordt gevisualiseerd op een gel-doc met UV-lichtbron, is het essentieel om het waardevolle RT-product niet bloot te stellen aan UV om schade te voorkomen.
6. Visualiseer de gel op een blauw licht transverlichter en accijns het RT-product uit de gel. Het wordt aanbevolen om DNA te knippen met extensies variërend van 30-200 NT (Figuur 4). Plaats de bekrachtigd gelstukken op een schoon oppervlak en snijd het schijfje in kleine stukjes om de oppervlakte te vergroten. Breng voorzichtig over in een buis van 1,5 mL en voeg 800 μL DNA-elutie buffer toe (tabel 1).
7. Inbroed de gelstukken met zachte menging met DNA-elutie buffer gedurende de nacht bij kamertemperatuur.
8. Scheid de elutie buffer van de gel door de slurry door te geven via een cellulose acetaat filter kolom (tabel met materialen) die in een 2 ml opvang buisje wordt geplaatst.
9. In 1,5 mL buis, wassen 10 μL streptavidine magnetische kralen met 500 μL streptavidine kraal Wash buffer (tabel 1). Herhaal dit voor drie totale wasses. Laat de kralen niet uitdrogen. Respendeer kralen in 10 μL DNA-elutie buffer (tabel 1).
10. Breng de elutie buffer, gescheiden van de gelstukken in stap 14,8, over naar de buis die de magnetische kralen van de gewassen streptavidine bevat.
11. Inincuberen met zachte menging gedurende ten minste 8 uur bij kamertemperatuur. Leg parels op een magneet, verwijder supernatant en rebreng magnetische parels in 10 μL RNase-vrij water en breng over naar een PCR-buis van 0,2 mL.

15. circularisatie van RT-product

1. RT producten gevangen op streptavidine kralen worden gecircuariseerd terwijl gebonden aan kralen. Aan de magnetische kraal slurry, voeg 2,0 μL van 10x circularisatie reactiebuffer, 1,0 μL van 1 mM ATP, 1,0 μL van 50 mM MnCl₂, 4,0 μL van 5 M betaïne, 1,0 μl van ssdna ligase I (tabel van de materialen), en 1,0 μl RNase-vrij water.
2. Incureer de circularisatie reactie op een thermische cycler bij 60 °C gedurende 4 uur. Verwarm de ssDNA ligase I door te verwarmen bij 80 °C gedurende 10 minuten en houd dan bij 4 °C.

16. test PCR

1. Voordat u doorgaat naar een grootschalige PCR, gebruik een deel van circularized product om te bepalen van het ideale aantal van de amplificatie cycli voor elk monster. Deze stap helpt overmatige versterking te voorkomen en PCR-artefacten te beperken, omdat componenten van PCR-reacties worden beperkt bij hogere PCR-cycli.
2. Bereid een PCR-reactie van 45 μL met 4,0-6,0 μL van het circularized product uit stap 15,2, 9,0 μL 5x-reactiebuffer, 0,9 μL 10 M dNTPs, 2,25 μL van 10 μM PE 1.0 primer (tabel met materialen), 2,25 μl van 10 μm PE 2.0 primer (inhoudstafel) en 0,045 μL High-Fidelity DNA-polymerase (tabel van materialen) en water.
3. Meng de reactie goed en splits in 3 15 μL reacties. Elk van deze drie reacties zal worden onderworpen aan een variabel aantal PCR-cycli. Het ideale aantal cycli is naar verwachting tussen 7 en 14. Voer dus test-PCRs uit voor 8, 11 en 14 cycli.
4. Gebruik de volgende PCR-voorwaarden: 98 °C-30 s; 98 °C-5 s; 65 °C-10 s; 72 °C-15 s; 72 °C-2 min; 12 °C-vasthouden.
5. Voeg 3 μL 6x gel loading Dye toe en los op 10% native PAGE gel totdat Blue Dye Front 3/4 van de gel heeft gemigreerd. Vlek de gel met behulp van gouden nucleïnezuur gel vlek en afbeelding zoals in de stappen 14,4 en 14,5 (Figuur 5).
6. Om het ideale aantal PCR-cycli te kiezen, vergelijk PCR-producten van toenemend aantal cycli. Kies het cyclusnummer dat de grootste hoeveelheid product van de verwachte grootte oplevert zonder overversterkings artefacten (bijvoorbeeld, DNA-uitstrijkje veel groter dan het verwachte product, en waar geen noemenswaardige uitputting van de PE 1.0 en PE 2.0 primers wordt gezien (zie rode pijl in Figuur 5).

17. grootschalige PCR-

1. Bereid een PCR-reactie van 45 μL, zoals in stap 16,2, en herhaal de PCR. Op te lossen PCR op 10% native pagina op 150 V, vlek met 1x goud nucleïnezuur gel vlek en afbeelding op een blauw licht transilluminator.
2. Accijns het PCR-product uit de gel en breng het over in een 3 mL spuit. Gebruik de spuit om de gel te verpletteren en extruderen in een tube van 1,5 mL.
   Opmerking: Het niet-verlengde RT-product bij circularisatie levert een PCR-product van 151 BP. Dus, bij deze stap moet men de maat selecteren producten die groter zijn dan 151 BP (Figuur 6).
3. Voeg 900 μL DNA-elutie buffer toe en inincuberen bij kamertemperatuur 's nachts met zachte menging.
4. Breng de gel slurry over naar een cellulose acetaat filter kolom geplaatst in een 2 mL opvang buisje. Spin bij 12.000 x g gedurende 3 minuten en verzamel supernatant in een frisse buis.
5. Voeg nog eens 400 μL DNA-elutie buffer toe aan de gemalen gel en breng deze over in een buis van 1,5 mL. Inincuberen met zacht mengen voor een extra 4 uur voor een tweede elutie.
6. Zwembad alle elutions en opgesplitst in 3 buizen met 400 μL elk. Precipitaat DNA door toevoeging van 1 mL 100% ethanol en 10 μg glycogeen. Vortex en inincuberen ten minste 2 uur bij-20 °C.
7. Pellet DNA bij 12.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c. Was DNA pellet met 70% ethanol.
8. Verwijder voorzichtig alle ethanol door pipetteren en snel respenderen DNA pellet in 20 μL water.
   Opmerking: In dit stadium is het belangrijk om de DNA-pellet niet droog te laten worden, want het drogen van DNA kan het denatureren.
9. Gebruik een klein deel van het DNA-monster om de grootte en concentratie van het PCR-product te bepalen via een fluor meter en een hoge gevoeligheid voor DNA-bioanalyzer. Samples kunnen nu worden ingediend voor sequencing op een van de platformen.
10. De gesequentieerde leesbewerkingen kunnen worden verwerkt (bijvoorbeeld het verwijderen van de adapter, trimmen om sequenties > 30 Phred score te houden), uitgelijnd met het referentie-genoom, en in een browser worden gevisualiseerd, zoals de UCSC genoome browser (Figuur 7).

Resultaten

Een succesvolle RIPiT zal resulteren in de immunoprecipitatie van zowel eiwitten van belang en andere bekende interactie eiwitten, en de afwezigheid van niet-interagerende eiwitten. Zoals te zien in Figuur 3A, werden zowel magoh als EIF4AIII aangetroffen in de ripit ELUTION, maar HNRNPA1 was niet (Lane 6). Tegelijkertijd werden RNA-voetafdrukken die samen met de RNP-complexen zijn gezuiverd, gedetecteerd via autoradiografie (Figuur 3B

Discussie

We bespreken hier enkele belangrijke overwegingen om RIPiT succesvol uit te voeren. In de allereerste plaats moeten individuele IPs worden geoptimaliseerd om bij elke stap de hoogst mogelijke efficiëntie te bereiken. De hoeveelheid vlag agarose kralen voor het ingevoerde aantal cellen die hier worden beschreven, heeft bewezen robuust te zijn voor een breed scala aan eiwitten die we hebben getest. Aangezien slechts een kleine fractie van partner eiwitten co-immunoprecipitated is met het vlag eiwit, is de hoeveelheid antil...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-FLAG Affinity Gel	Sigma	A2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi	PerkinElmer	BLU502A250UC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200)	Fisher	14-823-435
Betaine 5M	Sigma	B0300
biotin-dATP	TriLink	N-5002
biotin-dCTP	Perkin Elmer	NEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1	Branson
CircLigase I	VWR	76081-606	ssDNA ligase I
DMEM, High Glucose	ThermoFisher	11995-065
DNA load buffer NEB	NEB
Dynabeads Protein A	LifeTech	10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell Line	ThermoFisher	R78007
GeneRuler Low Range DNA Ladder	ThermoScientific	FERSM1203
Hygromycin B	ThermoFisher	10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well	Bio-Rad	4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel	Bio-Rad	4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Mirus transIT-X2 transfection reagent	Mirus	MIR 6004
Mth RNA ligase	NEB	E2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl)	Fisher	BP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x)	NEB	NEB #7025
Q5 DNA Polymerase	NEB	M0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000 U	Eppicenter	N6901K
SPIN-X column	Corning	CLS8160-24EA
Streptavidin beads	ThermoFisher	60210
Superscript III (SSIII)	ThermoScientific	18080044	reverse transcriptase enzyme
SybrGold	ThermoFisher	S11494	gold nucleic acid gel stain
T4 Polynucleotide Kinase-2500U	NEB	M0201L
T4RNL2 Tr. K227Q	NEB	M0351S
Tetracycline	Sigma	87128
Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase	NEB	M0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE8 5′