Multiplex fluorescerende immunohistochemie is een opkomende technologie die het mogelijk maakt de visualisatie van meerdere celtypen binnen intact formalin-vaste, paraffine ingesloten (FFPE) weefsel. Gepresenteerd zijn richtlijnen voor het waarborgen van een succesvol 7-kleuren multiplex met instructies voor het optimaliseren van antilichamen en reagentia, het voorbereiden van dia's, ontwerp en tips voor het vermijden van veelvoorkomende problemen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optimalisatie, ontwerp en Vermijd valkuilen in handmatige multiplex fluorescerende immunohistochemie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Micro-milieuevaluatie van intact weefsel voor analyse van celinfiltratie en ruimtelijke ordening zijn essentieel in het begrijpen van de complexiteit van ziekteprocessen. De in het verleden gebruikte principe technieken omvatten immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF) die visualisatie van cellen mogelijk maken als een momentopname in de tijd met behulp van tussen 1 en 4 markeringen. Beide technieken hebben tekortkomingen, met inbegrip van moeilijkheid kleuring slecht antigene doelen en beperkingen met betrekking tot kruis soorten reactiviteit. IHC is betrouwbaar en reproduceerbaar, maar de aard van de chemie en het vertrouwen op het zichtbare lichtspectrum maakt het mogelijk slechts een paar markers te gebruiken en maakt co-lokalisatie uitdagend. Gebruik van als verbreedt potentiële markers maar meestal vertrouwt op bevroren weefsel als gevolg van de uitgebreide weefsel auto fluorescentie na formaline fixatie. Flow Cytometry, een techniek die gelijktijdige labeling van meerdere epitopes mogelijk maakt, abrogates veel van de tekortkomingen van IF en IHC, echter, de noodzaak om cellen te onderzoeken als een eencellige suspensie verliest de ruimtelijke context van cellen die belangrijke biologische Relaties. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) overbrugt deze technologieën waardoor multi-epitope cellulaire fenotyping in formaline vaste paraffine ingebed (FFPE) weefsel met behoud van de algehele micro-omgeving architectuur en ruimtelijke relatie van cellen binnen intact onverstoorde weefsel. Hoge fluorescentie intensiteit fluoroforen die covalent binding aan de weefsel epitoop maakt meerdere toepassingen van primaire antilichamen zonder zorgen van soort specifieke Kruisreactiviteit door secundaire antilichamen. Hoewel deze technologie heeft bewezen betrouwbare en nauwkeurige beelden voor de studie van de ziekte te produceren, het proces van het creëren van een nuttige mfIHC kleuring strategie kan tijdrovend en veeleisende als gevolg van uitgebreide optimalisatie en ontwerp. Om robuuste beelden te maken die nauwkeurige cellulaire interacties in situ vertegenwoordigen en om de optimalisatie periode voorhand matige analyse te verzachten, worden hier gepresenteerd zijn methoden voor de voorbereiding van dia's, het optimaliseren van antilichamen, multiplex ontwerp en fouten vaak aangetroffen tijdens het kleuringsproces.
Inleiding
Visualisatie van een intact tumor micro Environment (TME) is essentieel bij het evalueren van niet alleen cellulaire infiltratie in vaste maligniteiten, maar cel naar celinteracties ook. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfihc) is ontstaan als een effectief hulpmiddel voor multi-antigen fenotyping van cellen in de studie van kanker en geassocieerde ziekten1,2,3,4, 5,6,7. Dit, in combinatie met nieuwe software en Programma's die zijn ontworpen om grote gegevenssets te analyseren, maakt observatie van complexe interacties tussen cellen1,2,4mogelijk. De snelheids beperkende factor bij het verzamelen van gegevens is vaak de kwaliteit van het gekleurd weefsel voorafgaand aan de analyse.
Eerdere technieken die worden gebruikt voor fenotype cellen in de TME omvatten immunohistochemie (IHC), immunofluorescentie (IF) en Flowcytometrie die allemaal significante beperkingen hebben. IHC maakt gebruik van formaline vaste paraffine ingesloten (FFPE) weefsel secties die zijn gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd voordat ze worden gekleurd door meestal één antilichaam. Gebruik van een mierikswortelperoxidase (HRP) gebonden secundair antilichaam en een chemische reactie maakt visualisatie van een enkele antigene epitoop8. Hoewel IHC betrouwbaar is en wordt uitgevoerd op FFPE-weefsel dat gemakkelijk te werken is, betekent beperkingen voor het zichtbare lichtspectrum dat slechts één of twee markeringen betrouwbaar kunnen worden onderscheiden en colokalisatie van antigenen heel moeilijk8. Een manier om de beschikbare markers uit te breiden en daarom antigenen die op een enkele sectie kunnen worden geproteand, is om te veranderen in fluorescentie die het mogelijk maakt om een breder bereik van het visuele spectrum te gebruiken. Voor als, bevroren of FFPE weefsel wordt overgebracht op dia's en antilichamen gebruikt die zijn geconjugeerd aan verschillende fluor Foren. Terwijl dit verhoogt het aantal antigenen die kunnen worden geprobed, er zijn verschillende belangrijke beperkingen. Ten eerste, omdat elk antilichaam meestal slechts één de heeft bevestigd, is de helderheid vaak niet sterk genoeg om weefsel autofluorescentie te overwinnen. Het is om deze reden, de meeste als wordt uitgevoerd op bevroren weefsel dat is duur om op te slaan en moeilijk om mee te werken. Een beperkt aantal fluorescerende Tags zijn beschikbaar voor gebruik als gevolg van spectrale overlapping en kruis soorten reactiviteit, vooral wanneer niet-geconjugeerde antilichamen worden gebruikt. Flow cytometrie, dat bestaat uit de verwerking van vers weefsel tot een enkele celsuspensie en labeling met fluorescerende antilichamen is de gouden standaard voor immunofenotypering voor decennia9,10. Een voordeel van flow cytometrie is de mogelijkheid om meerdere antilichamen zonder bezorgdheid te labelen voor soorten Kruisreactiviteit, omdat de meeste zijn geconjugeerd. Omdat de cellen worden "gevisualiseerd" door een machine en geen menselijke ogen, er zijn veel meer fluor Foren beschikbaar, maar dit komt met een kostprijs. De compensatie moet handmatig worden uitgevoerd, waardoor de resultaten van valse positieve en negatieve populaties aanzienlijk kunnen worden gewijzigd. De meest significante beperking van flow cytometrie is dat weefsel architectuur en vervolgens alle ruimtelijke informatie verloren gaat door de noodzaak voor de schorsing van de enkelvoudige cellen.
Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfihc) met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende Microscoop in combinatie met nieuwe software combineert de voordelen van IHC, if en flow flowcytometrieonderzoeken door het toestaan van multi-antigen weefsel kleuring met signaalversterking en behoud van ruimtelijke relaties zonder de noodzaak van compensatie. FFPE weefsel wordt geplaatst op geladen glijbanen die, na antigeen opvraging, een ronde van primaire antilichamen ondergaan op het doel antigeen van belang, gevolgd door een secundair antilichaam met een HRP chemisch plaatje, vergelijkbaar met IHC. Na de plaatsing van het secundaire antilichaam resulteert een HRP-specifieke reactie in een covalente binding van de aan de epitoop van belang11. Zodra het weefsel is gelabeld, een andere ronde van de verwarming van de dia's is voltooid het verwijderen van de eerder toegepaste primaire en secundaire antilichaam complex verlaten alleen de fluorescerende tag gebonden aan de weefsel epitoop11. Dit maakt het mogelijk om meerdere antilichamen van elke soort opnieuw toe te passen zonder zorgen voor Kruisreactiviteit11,12. Om de behoefte aan handmatige compensatie van meerdere fluorescerende kleurstoffen te minimaliseren, wordt een verzameling van fluor Foren met weinig spectrale overlap met inbegrip van een nucleaire Counter vlek gebruikt om de mfIHC te voltooien. Om rekening te houden met de autofluorescentie die met ffpe-weefsel is aangetroffen, trekt de software de autofluorescentie van de uiteindelijke afbeelding af met behulp van een afbeelding van een blanco dia die mogelijk is vanwege de sterkte van antigeen specifieke fluorescentie na de signaalversterking. Met behulp van nieuwe Programma's die zijn ontworpen voor grote gegevenssets, kunnen cellocaties worden geïdentificeerd en geanalyseerd voor ruimtelijke context1,2,4. De meest significante beperking van deze techniek is de optimalisatie tijd. Een gedetailleerde methodologie met instructies voor experimentele ontwerp-en kleurings-en beeldvormings strategie vindt u hier. mfIHC is nuttig voor laboratoria die momenteel geen geoptimaliseerd geautomatiseerd kleurings systeem hebben dat de ruimtelijke context van cel-naar-celinteracties in intact FFPE-weefsel met behulp van de handmatige techniek beter zou willen begrijpen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het werk is goedgekeurd door de Universiteit van Michigan interne Review Board.
1. optimaliseren van primaire antilichamen en Slide voorbereiding
- Bepaal de ideale concentratie van antilichamen voor multiplex met conventionele IHC.
- Test de antilichamen voor de multiplex door handmatige conventionele immunohistochemie (IHC)13.
- Gebruik specifieke weefsels die een overvloedig celtype hebben voor elke geteste antilichaam, zoals het gebruik van tonsillen weefsel voor CD3 antilichaam testen.
- Gebruik de referentie concentratie voor IHC aanbevolen door het bedrijf en voltooi vervolgens IHC met antilichaamconcentraties in de aanbevolen concentraties, evenals concentraties boven en onder de aanbevolen concentratie.
- Bereid formaline vast paraffine ingesloten weefsel op dia's.
- Met behulp van een microtoom, snijd blokken van FFPE weefsel met een dikte tussen 4 en 6 μm en toepassen op opgeladen dia's.
Opmerking: het gebruik van gedistilleerd water zorgt voor de juiste weefsel montage en hechting in de multiplex. - Plaats de glijbanen plat, weefsel zijde omhoog, en laat drogen bij 37 °C 's nachts.
- Sla dia's op in een Slide Box weg van extreme temperatuur tot klaar om de multiplex te voltooien.
- Met behulp van een microtoom, snijd blokken van FFPE weefsel met een dikte tussen 4 en 6 μm en toepassen op opgeladen dia's.
2. algemene kleurings methode
- Bereiding van de oplossingen voor het ophalen van was en antigeen
- Bereid de wasoplossing van 0,1% TBST door het mengen van 9 L gedeïoniseerd water, 1 L tris gebufferde zout (TBS) en 10 mL Polysorbaat 20.
- Bereid beide antigeen oplossingen voor het ophalen (pH 6 en pH 9; Tabel met materialen) door te verdunen naar 1x met gedeïoniseerd water.
- Deparaffinisatie en rehydratatie
- Bakken glijbanen, plat liggen, weefsel zijde omhoog bij 60 °C gedurende 1 uur in een hybridisatie oven1. Verwijder de glaasjes uit de oven en laat minstens 5 − 10 min afkoelen en plaats in een verticaal schuif rek.
- Behandel de dia's in de volgende oplossingen opeenvolgend: xyleen in drievultaat, gevolgd door een enkelvoudige behandeling van 100% ethanol, 95% ethanol en ten slotte 70% ethanol gedurende 10 min, elk met een dia-Kleurset1.
- Was het rek van de glijbanen gedurende 2 minuten met gedeïoniseerd water door onderdompeling in een plastic glijbaan, gevolgd door fixatie door onderdompeling in een plastic glijbaan gevuld met neutrale gebufferde formaline gedurende 30 min13. Was de glaasjes in gedeïoniseerd water gedurende 2 min en ga verder naar antigeen-opvraging.
- Antigeen-opvraging
- Plaats het rek van de glijbanen in een hittebestendige doos gevuld met de interne lijn (ongeveer 300 mL) met pH 6 of pH 9 antigeen ophaalbuffer.
Opmerking: antigeen-ophaal buffer kan ofwel pH 6 of pH 9 zijn, die mogelijk moet worden geoptimaliseerd per epitope. Begin echter met het gebruik van pH 9 voor antilichamen die binden aan nucleaire epitopen en pH 6 voor alle andere antilichamen. - Bedek de doos met plastic folie en gebruik een rubberen band om te beveiligen. Plaats de doos in de magnetron aan de rand van de roterende plaat (magnetron moet worden uitgerust met inverter technologie voor zelfs verwarming). Verwarm de dia's voor 45 s bij 100% vermogen gevolgd door 15 min bij 20% vermogen13.
Opmerking: microgolf behandeling kan optimalisatie nodig hebben, afhankelijk van de gebruikte magnetron. - Laat de lantaarnplaten ongeveer 15 − 20 minuten afkoelen.
- Plaats het rek van de glijbanen in een hittebestendige doos gevuld met de interne lijn (ongeveer 300 mL) met pH 6 of pH 9 antigeen ophaalbuffer.
- Bereid werkoplossingen voor van antilichamen en fluoroforen terwijl het koel glijdt.
- Bereid het primaire antilichaam verdunningsmiddel door 0,5 g boviene serumalbumine korrels op te lossen in 50 mL TBST. U ook 50 mL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gebruiken om granules op te lossen.
- Zorg ervoor dat elke primaire antilichaam-werkoplossing de geoptimaliseerde concentratie is, bepaald in punt 1, in het primaire antilichaam verdunningsmiddel. Geschatte ongeveer 200 μL per dia.
- Bereid de de-werkoplossing door elke de in het de verdunningsmiddel te verdunen met een concentratie van 1:100.
Opmerking: dit moet mogelijk worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het antilichaam. Geschatte ongeveer 100 μL per dia. - Bereid op de laatste dag van de kleuring de 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) werkoplossing door 3 druppels DAPI toe te voegen in 1 mL TBST.
- Glij-kleuring (wassen en blokkeren)
- Verwijder de doos uit de magnetron na het koelen en opstijgen van de plastic wrap, was de dia's met gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten, gevolgd door een 2 min wassen in een plastic Slide box gevuld TBST13.
- Na het drogen van elke glijbaan rond het weefsel met een delicate taak veeg voorzichtig om het weefsel niet te laten uitdrogen, rond de buitenkant van het weefsel te traceren met behulp van een hydrofobe barrière pen. Raak het weefsel niet aan met het delicate taak doekje of de pen.
- Plaats elke dia in de bevoficeerde kamer en voeg een blokkerende oplossing (ongeveer 4 druppels) toe aan het weefsel. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Slide kleuring (primair antilichaam toepassing)
- Neem elke dia en verwijder de blokkerende oplossing door te tikken op de zijkant van de dia op een stapel papieren handdoeken en met behulp van een delicate taak wissen om overtollige blokkerende agent van rond het weefsel te verwijderen.
- Leg de schuif terug in de bevoficeerde kamer en voeg ongeveer 200 μL van het werkende primaire antilichaam toe. Incuberen in de bevoficeerde kamer gedurende 1 uur bij RT.
- Wassen met TBST voor 2 min door onderdompeling in drievoud13.
Opmerking: na elke wasstap zorgt het wijzigen van de TBST voor een schoner beeld.
- Slide kleuring (secundair antilichaam toepassing)
- DEP de resterende TBST van elke dia af en breng ongeveer 3 tot 4 druppels secundair antilichaam aan (mengsel van secundaire HRP-geconjugeerde antilichamen met konijn en muis). Inincuberen gedurende 10 min in de bevoficeerde kamer op RT13.
Opmerking: als u van plan bent een primair antilichaam te gebruiken dat een secundair antilichaam nodig heeft, anders dan muis of konijn, of ervoor kiest om een alternatief secundair antilichaam te gebruiken, breng dan de juiste HRP geconjugeerde op de dia's aan en incuberen bij RT gedurende 45 min. optimalisatie van Er kan een incubatietijd nodig zijn voor de alternatieve secundaire14. - Na incubatie, wassen met TBST voor 2 min in drievat13.
- DEP de resterende TBST van elke dia af en breng ongeveer 3 tot 4 druppels secundair antilichaam aan (mengsel van secundaire HRP-geconjugeerde antilichamen met konijn en muis). Inincuberen gedurende 10 min in de bevoficeerde kamer op RT13.
- Slide kleuring (fluorophore toepassing)
- Breng ongeveer 100 μL van de werkoplossing de aan en incubeer in de bevoficeerde kamer bij RT gedurende 10 min.13.
- Wassen met TBST voor 2 min in drievat13.
- Verwijdering van antilichamen
- Microwave glijbanen (45 s bij 100% dan 15 min bij 20%) in de hittebestendige doos (zie stap 2.3.2) voor het verwijderen van antilichamen13,14.
Opmerking: Hiermee is een ronde van de multiplex voltooid. Dit is het enige punt waarop het protocol kan worden onderbroken. Om het protocol te onderbreken, laat u de dia's in de buffer voor het ophalen van het antigeen overnachten bij kamertemperatuur.
- Microwave glijbanen (45 s bij 100% dan 15 min bij 20%) in de hittebestendige doos (zie stap 2.3.2) voor het verwijderen van antilichamen13,14.
- Verdere kleurings rondes voortzetten. Herhaal stap 2.5.1 − 2.9.1 voor de rest van de antilichamen-fluorophore paren. Nadat alle antilichamen en fluor Foren zijn gebruikt, gaat u verder met paragraaf 2,11.
- DAPI-toepassing en-montage
- Na de laatste kleurings ronde in de multiplex, verwijder de laatste antilichaam toepassing met antigeen opvraging oplossing pH 613. Wassen met gedeïoniseerd water gevolgd door TBST voor 2 min elke13.
- Breng ongeveer 150 μL van de werkende DAPI-oplossing aan op dia's en incuberen in de bevoficeerde kamer gedurende 10 minuten bij RT1.
- Was met TBST voor ongeveer 30 s en monteer de dekstroken met een anti fade mountant. Breng Clear vingernagel Polish aan op de vier hoeken van de Afdeklijst zodra de bevestigings media zijn gedroogd om de Afdeklijst te beveiligen (optioneel).
3. Details voor bibliotheek, monoplexen en multiplex
- Kies dia's voor het bouwen van een de Library.
- Voor een 7-kleuren multiplex verzamelen 7 immuun cel rijke weefsel dia's (dat wil zeggen, tonsil, milt, enz.) voor de bibliotheek.
Opmerking: Kies besturings dia's die moeten worden gebruikt voor een de-bibliotheek met elke dia die elke unieke de vertegenwoordigt die in de multiplex wordt gebruikt. Controle dia's moeten een overvloedige epitoop van keuze hebben en kunnen hetzelfde type weefsel voor elke fluorophore.
- Voor een 7-kleuren multiplex verzamelen 7 immuun cel rijke weefsel dia's (dat wil zeggen, tonsil, milt, enz.) voor de bibliotheek.
- Vlek-en afbeeldingsbibliotheek dia's voor gebruik met monoplexes en multiplexen.
- Volg de stappen 2.1 − 2.9.1 met behulp van de besturings dia's en besturings weefsel dia's van keuze. Plaats een andere de op elke dia met een concentratie van 1:100; Eén dia mag alleen DAPI bevatten.
- Ga verder met paragraaf 2,11 behalve DAPI-kleuring weglaten en gebruik in plaats daarvan TBST en Mount zoals beschreven.
- Na het laten drogen van de dia's 's nachts, afbeelding met alle kanalen DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas rood, Semiconductor Quantum dots, en fluoresceïne isothiocyanaten (FITC) instellen van de blootstelling aan 250 MS met de verzadiging bescherming functie1.
Opmerking: de belichtingstijden kunnen worden ingesteld op 50 − 250 MS13. - Upload de bibliotheek Afbeeldingen naar de software en gebruik deze in de analyse van de monoplexes en multiplex.
- Kies dia's voor monoplexen.
- Kies besturings dia's met een overvloedige belichamer keuze op basis van geoptimaliseerde antilichamen (sectie 1). Voor elke ronde van kleuring moet worden uitgevoerd in de multiplex, selecteert u dat aantal besturingselementen voor het maken van monoplexen.
Opmerking: het doel van de monoplex is het bepalen van de beste positie (orde) voor elk antilichaam dat in de multiplex moet worden gebruikt.
- Kies besturings dia's met een overvloedige belichamer keuze op basis van geoptimaliseerde antilichamen (sectie 1). Voor elke ronde van kleuring moet worden uitgevoerd in de multiplex, selecteert u dat aantal besturingselementen voor het maken van monoplexen.
- Vlek monoplexes.
- Volg de paragrafen 2.1 − 2.11 met behulp van het primaire antilichaam op een andere volgorde (positie) voor elk van de dia's. Elke dia moet slechts één primair antilichaam hebben dat wordt toegepast op een andere volgorde (positie) dan de andere dia's.
Opmerking: voor elke dia waar de ronde geen primair antilichaam of de aanroept, gebruikt u in plaats daarvan het verdunningsmiddel primair antilichaam en de verdunent13.
- Volg de paragrafen 2.1 − 2.11 met behulp van het primaire antilichaam op een andere volgorde (positie) voor elk van de dia's. Elke dia moet slechts één primair antilichaam hebben dat wordt toegepast op een andere volgorde (positie) dan de andere dia's.
- Afbeelding schuift en analyseert de monoplex.
- Met behulp van de Microscoop en het instellen van de belichtingstijd tot 250 ms voor alle kanalen vast te leggen elke afbeelding met behulp van DAPI om scherp te stellen.
Opmerking: de belichtingstijden kunnen worden ingesteld op 50 − 250 MS14. - Met behulp van de analyse software evalueren elke monoplex Slide door te kijken naar de fluorescerende intensiteit van de bevlekt marker.
- Vergelijk deze intensiteit met de achtergrond. Als het ten minste 5 − 10 keer hoger is dan de achtergrond, is de positie van die glijbaan een optimale positie om te gebruiken in de uiteindelijke multiplex.
- Met behulp van de Microscoop en het instellen van de belichtingstijd tot 250 ms voor alle kanalen vast te leggen elke afbeelding met behulp van DAPI om scherp te stellen.
- Kies dia's voor de multiplex.
- Kies de dia's van belang en voeg een extra dia toe om te worden gebruikt als een lege dia voor het aftrekken van autofluorescentie na kleuring en beeldvorming.
- Vlekken op de multiplex.
- Op basis van de monoplex resultaten, kies de juiste volgorde (posities) voor elk antilichaam op basis van stap 3.5.3. Elke de aan een antilichaam toewijzen.
Opmerking: dit kan optimalisatie nodig hebben; echter, van plan om heldere antilichamen te gebruiken voor minder overvloedige markers1, co-localiserende antilichamen moeten worden geëvenaard met fluoroforen op Far spectrums van elkaar13, en fluoroforen met het spectrum 540 en 570 mag niet worden co-gelokaliseerd due naar spectrale overlap problemen1. - Ga verder met de paragrafen 2.1 − 2.11 om ervoor te zorgen dat de blanco Slide geen primair antilichaam, de of DAPI krijgt, gebruik in plaats daarvan het verdunningsmiddel, de diluent en TBST op zijn plaats.
- Op basis van de monoplex resultaten, kies de juiste volgorde (posities) voor elk antilichaam op basis van stap 3.5.3. Elke de aan een antilichaam toewijzen.
- Beeld multiplex en analyse voor de integriteit van de kleuring
- Met behulp van de Microscoop en het instellen van de belichtingstijd tot 250 ms voor alle kanalen, vastleggen van elke afbeelding met behulp van DAPI om scherp te stellen.
- Met behulp van de analyse software (tabel met materialen), Evalueer elke multiplex door fluorescerende False kleur.
Opmerking: een duidelijk beeld moet elke marker duidelijk aantonen. Als een markering diffuus en korrelig uitziet of niet bestaat, is het waarschijnlijk dat de marker niet werkte en opnieuw moet worden geoptimaliseerd. - Evalueer met behulp van de analyse software elke multiplex per pathologie-weergave. Pathologie-weergave zal de specificiteit van elke marker bevestigen. Vergelijk met IHC eerder geoptimaliseerd (paragraaf 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het totale proces van het verkrijgen van een multiplex test met 7 kleuren volgt een repetitief patroon. Figuur 1 beschrijft het proces in een diagrammatische vorm. Zodra de glaasjes worden geknipt en gedroogd of van het laboratorium worden ontvangen en in een hybridisatie oven bij 60 °C gedurende 1 uur worden gebakken, gaat u verder naar deparaffinisatie en rehydratatie, herstelt u de glaasjes in formaline opnieuw gevolgd door antigeen-ophaling. Elke ronde van multiplexing begint bij het oph...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Intact weefsel specimens van solide tumor biopsie en chirurgische resectie blijven belangrijke diagnostische en voorspellende instrumenten voor ziekte-analyse, evenals de prognose van de patiënt. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) is een nieuwe techniek die de voordelen van immunohistochemie (IHC), immunofluorescentie (IF) en Flowcytometrie combineert. Eerdere methoden voor sonde cellen in situ hebben toegestaan voor de evaluatie van cel-naar-cel regelingen in een weefsel omgeving8...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Ed stack, eerder van Perkin Elmer, bedanken voor zijn hulp bij het instellen en optimaliseren van de originele multiplex kleuring. De auteurs willen ook Kristen Schmidt van Akoya Biosciences bedanken voor tips met behulp van de analyse software. Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door de National Cancer Institutes of Health onder het Awardnummer P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (JS), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, HC), CA170568 (HC). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Extra ondersteuning werd geboden door Jeffery A. Colby Colon Cancer en Tom Liu Memorial Research funds.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm versie 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 druppels in TBST of PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-groen |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | met invertertechnologie |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutraal gebufferd formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Referenties
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880(2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32(2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
