Optimalisatie, ontwerp en Vermijd valkuilen in handmatige multiplex fluorescerende immunohistochemie

Summary

Multiplex fluorescerende immunohistochemie is een opkomende technologie die het mogelijk maakt de visualisatie van meerdere celtypen binnen intact formalin-vaste, paraffine ingesloten (FFPE) weefsel. Gepresenteerd zijn richtlijnen voor het waarborgen van een succesvol 7-kleuren multiplex met instructies voor het optimaliseren van antilichamen en reagentia, het voorbereiden van dia's, ontwerp en tips voor het vermijden van veelvoorkomende problemen.

Abstract

Micro-milieuevaluatie van intact weefsel voor analyse van celinfiltratie en ruimtelijke ordening zijn essentieel in het begrijpen van de complexiteit van ziekteprocessen. De in het verleden gebruikte principe technieken omvatten immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF) die visualisatie van cellen mogelijk maken als een momentopname in de tijd met behulp van tussen 1 en 4 markeringen. Beide technieken hebben tekortkomingen, met inbegrip van moeilijkheid kleuring slecht antigene doelen en beperkingen met betrekking tot kruis soorten reactiviteit. IHC is betrouwbaar en reproduceerbaar, maar de aard van de chemie en het vertrouwen op het zichtbare lichtspectrum maakt het mogelijk slechts een paar markers te gebruiken en maakt co-lokalisatie uitdagend. Gebruik van als verbreedt potentiële markers maar meestal vertrouwt op bevroren weefsel als gevolg van de uitgebreide weefsel auto fluorescentie na formaline fixatie. Flow Cytometry, een techniek die gelijktijdige labeling van meerdere epitopes mogelijk maakt, abrogates veel van de tekortkomingen van IF en IHC, echter, de noodzaak om cellen te onderzoeken als een eencellige suspensie verliest de ruimtelijke context van cellen die belangrijke biologische Relaties. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) overbrugt deze technologieën waardoor multi-epitope cellulaire fenotyping in formaline vaste paraffine ingebed (FFPE) weefsel met behoud van de algehele micro-omgeving architectuur en ruimtelijke relatie van cellen binnen intact onverstoorde weefsel. Hoge fluorescentie intensiteit fluoroforen die covalent binding aan de weefsel epitoop maakt meerdere toepassingen van primaire antilichamen zonder zorgen van soort specifieke Kruisreactiviteit door secundaire antilichamen. Hoewel deze technologie heeft bewezen betrouwbare en nauwkeurige beelden voor de studie van de ziekte te produceren, het proces van het creëren van een nuttige mfIHC kleuring strategie kan tijdrovend en veeleisende als gevolg van uitgebreide optimalisatie en ontwerp. Om robuuste beelden te maken die nauwkeurige cellulaire interacties in situ vertegenwoordigen en om de optimalisatie periode voorhand matige analyse te verzachten, worden hier gepresenteerd zijn methoden voor de voorbereiding van dia's, het optimaliseren van antilichamen, multiplex ontwerp en fouten vaak aangetroffen tijdens het kleuringsproces.

Introduction

Visualisatie van een intact tumor micro Environment (TME) is essentieel bij het evalueren van niet alleen cellulaire infiltratie in vaste maligniteiten, maar cel naar celinteracties ook. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfihc) is ontstaan als een effectief hulpmiddel voor multi-antigen fenotyping van cellen in de studie van kanker en geassocieerde ziekten^{1,2,3,4, 5,6,7}. Dit, in combinatie met nieuwe software en Programma's die....

Protocol

Al het werk is goedgekeurd door de Universiteit van Michigan interne Review Board.

1. optimaliseren van primaire antilichamen en Slide voorbereiding

1. Bepaal de ideale concentratie van antilichamen voor multiplex met conventionele IHC.
   1. Test de antilichamen voor de multiplex door handmatige conventionele immunohistochemie (IHC)¹³.
   2. Gebruik specifieke weefsels die een overvloedig celtype hebben voor elke geteste antilichaam, zoals het gebruik van tonsillen weefsel voor CD3 antilichaam testen.
   3. Gebruik de referentie concentratie voor IHC aanbevolen door het bedrijf en voltooi vervolgens I....

Results

Het totale proces van het verkrijgen van een multiplex test met 7 kleuren volgt een repetitief patroon. Figuur 1 beschrijft het proces in een diagrammatische vorm. Zodra de glaasjes worden geknipt en gedroogd of van het laboratorium worden ontvangen en in een hybridisatie oven bij 60 °C gedurende 1 uur worden gebakken, gaat u verder naar deparaffinisatie en rehydratatie, herstelt u de glaasjes in formaline opnieuw gevolgd door antigeen-ophaling. Elke ronde van multiplexing begint bij het oph.......

Discussion

Intact weefsel specimens van solide tumor biopsie en chirurgische resectie blijven belangrijke diagnostische en voorspellende instrumenten voor ziekte-analyse, evenals de prognose van de patiënt. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) is een nieuwe techniek die de voordelen van immunohistochemie (IHC), immunofluorescentie (IF) en Flowcytometrie combineert. Eerdere methoden voor sonde cellen in situ hebben toegestaan voor de evaluatie van cel-naar-cel regelingen in een weefsel omgeving⁸.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm versie 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 druppels in TBST of PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-groen
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	met invertertechnologie
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutraal gebufferd formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL