Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59950

⸱

19 september 2019

 ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels, met behulp van immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot-methoden.

Samenvatting

In het genoom van zoogdieren zijn meerdere DNA-modificaties geïdentificeerd. Van die, 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine-gemedieerde Epigenetische mechanismen zijn intensief bestudeerd. 5-hydroxymethylcytosine toont dynamische kenmerken tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling van de hersenen, speelt een regelgevende functie in genexpressie, en is betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen. Hier beschrijven we de gedetailleerde methoden, waaronder immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot om 5-hydroxymethylcytosine in gekweekte cellen en hersenweefsels van de muis te detecteren.

Inleiding

Epigenetische modificaties, waaronder DNA modificatie, Histon modificatie en RNA modificatie, is aangetoond dat het spelen van essentiële functies in diverse biologische processen en ziekten1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. voor een lange tijd, DNA-methylatie (dat wil zeggen, 5-methylcytosine (5-mC)) is gezien als een zeer stabiele epigenetische marker en kan niet verder worden gewijzigd in het genoom. Onlangs, het is gebleken dat 5-mC kan worden geoxideerd tot 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) door TET (ten-elf translocaties) familie-eiwitten, met inbegrip van TET1, TET2, en TET38,9. Verdere studies tonen aan dat 5-HMC kan dienen als een stabiele marker en spelen biologische rollen door het reguleren van genexpressie4,10,11,12.

De huidige bewijzen geven aan dat 5-HMC sterk is verrijkt in neuronale weefsels/cellen ten opzichte van andere soorten weefsels in zoogdieren, en vertoont dynamische kenmerken tijdens neuronale ontwikkeling13,14. In het neuronale systeem, 5-hmC gemedieerde epigenetische modificaties spelen een belangrijke rol bij het reguleren van neurale stamcellen, neuronale activiteit, leren en geheugen, en is betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen met inbegrip van Rett syndroom, autisme, Alzheimer ziekte, de ziekte van Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.

Er zijn verschillende benaderingen voor het opsporen van 5-HMC in cellen en weefsels14,21,22,23,24. Hier beschrijven we twee methoden om het bestaan van 5-hmC te detecteren en het wereldwijde niveau van 5-hmC te kwantificeren: immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot. Deze twee methoden zijn handig en gevoelig, en zijn met succes gebruikt in eerdere studies25,26,27,28,29,30. De belangrijkste stappen van deze twee methoden zijn DNA-denaturatie. Voor immunofluorescentie kleuring van 5-hmC is pre-behandeling van monsters met 1 M HCl vereist. Voor 5-hmC dot-Blot wordt DNA-denaturatie uitgevoerd met NaOH-oplossing. Deze twee methoden samen met de volgende generatie sequencing zijn zeer nuttig hulpmiddelen voor het onderzoeken van de functie van 5-hmC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dier procedures zijn goedgekeurd door het Dierenethische Comité van de Zhejiang University.

1. de cultuur van volwassen neurale stamcellen en neuronen

  1. Isoleer volwassen neurale stamcellen uit het voor brein van een volwassene (8-10 week oud) C57/BL6 mannelijke muis zoals eerder beschreven31,32.
  2. Cultuur volwassen neurale stamcellen in DMEM/F-12 medium bevattende 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 supplement, 1% antibioticum-antimycotic, en 2 mM L-glutamine in een 5% CO2 incubator bij 37 °c. Induceren van de differentiatie van volwassen neurale stamcellen met 1 μm retinoïnezuur en 5 μm Forskolin voor 48 h zoals eerder beschreven31,32.
  3. Isoleer neuronen van de embryonale dag 17 (E17) hippocampi van de muis en cultuur met neurobasal medium bevattende 0,25% L-glutamine, 0,125% GlutaMax en 2% B27 supplement in een 5% CO2 incubator bij 37 °c zoals eerder beschreven33.

2. transcardial perfusie van de muis

  1. Bereid een dag voor het experiment 10% chloraalhydraat, 4% Paraformaldehyde (PFA) en fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar bij 4 °C.
  2. Anesthetiseer een volwassen mannelijk of vrouwelijk C57 BL/6J muis met 10% Chloraalhydraat (50 mg/kg, i.p.), en zorg ervoor dat het dier diep verdoerd is door het controleren van de lichaams reactie. Bevestig elke ledemaat met plakband op een plastic bord (in een face-up positie).
  3. Snijd de huid en dan de spier met chirurgie schaar. Open de thoracische holte met een chirurgische schaar. Stel het hart bloot en knip een klein deel van het rechter Atrium af met een fijne chirurgische schaar.
  4. Parfuseer de muis met een 10 mL wegwerpbare, gesteriliseerde spuit van de linker ventrikel met koude PBS (ongeveer 30 mL per volwassen muis).
  5. Parfumeer de muis met 4% PFA (ongeveer 30 mL in 10 minuten per volwassen muizen) totdat het stijf is.
  6. Open de schedel van de muis met bot Tang. Verwijder de hersenen en breng in 5 mL van 4% PFA in een centrifugebuis van 15 mL voor na fixatie bij 4 °C.
    Opmerking: Reinig het chirurgische gebied nadat de operatie is voltooid.
  7. Ten minste 24 uur later, breng de hersen monsters over in een 30% sucrose-oplossing voor volledige uitdroging bij 4 °C.

3. Brain snijden

  1. Insluiten van de hersenen monsters in optimale snijtemperatuur Compound (OCT) in een kleine container, en afkoelen bij-20 °C gedurende ten minste 1 uur.
  2. Sectie hersenen monsters met een dikte van 20-40 μm met een cryostaat microtoom.
  3. Verzamel secties in PBS en bewaar deze bij 4 °C.

4. immunofluorescentie kleuring

  1. Pak de secties met de beoogde hersengebieden en zet ze in een 24-put plaat met PBS. Voor gekweekte cellen op een dekslip, ga direct naar stap 4,2.
  2. Wassen met PBS op de shaker bij kamertemperatuur 10 min. Herhaal dit twee keer.
  3. Verwijder PBS en behandel met voorverwarmde 1 M HCl gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    Opmerking: Bereid 1 M HCl voor met toevoeging van 1 mL zoutzuur (36-38%) in 10 mL water in een chemische afzuigkap. Verwarm 1 M HCl in de incubator bij 37 °C.
  4. Was de monsters met PBS gedurende 5 min. Herhaal dit twee keer.
  5. Blok monsters met PBS met 3% normaal geiten serum en 0,1% Triton X-100 voor 1 uur op de shaker bij kamertemperatuur.
  6. Incuberen delen met specifieke primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C op de shaker.
    Opmerking: Gebruik de volgende primaire antilichamen: polyklonale konijn-antilichamen anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000), monoklonaal antilichaam anti-NeuN van de muis (1:500).
  7. Neem de monsters, en verder inbroed bij kamertemperatuur 1 uur.
  8. Was de monsters met PBS gedurende 10 min. Herhaal dit twee keer.
  9. Inincuberen met secundaire antilichamen overeenkomend met de primaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op de shaker. Bedek de plaat met aluminium.
    Opmerking: Gebruik de volgende secundaire antilichamen: Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG (1:500), Alexa Fluor 568 geit anti-muis IgG (1:500). Contrits-kernen met 4 ′ -6-diamidino-2-fenylindole (DAPI).
  10. Was de monsters met PBS gedurende 10 minuten op de shaker. Herhaal dit twee keer.
  11. Monteer de hersen secties op de dia's, voeg de juiste hoeveelheid anti fade-montage medium (rond 100-150 μL) toe en dek af met een hoogwaardig afdekglas. Zegel met nagellak.
  12. Neem beelden met een reguliere of confocale fluorescentiemicroscoop.

5. genomische DNA-isolatie

  1. Euthanize een volwassen C57 BL/6J muis (mannelijk of vrouwelijk) door cervicale dislocatie en verwijder de hersenen.
  2. Dissect de hippocampus, cortex en cerebellum weefsels op een ijsgekoelde schotel. Grind weefsels met een weefsel slijper in 1 mL DNA lysisbuffer en overdracht in een schone micro centrifugebuis. Voeg 250 μg proteïnase K toe per 600 μL lysisbuffer. Voor celpellets, voeg direct lysisbuffer, proteïnase K, en meng grondig.
    Opmerking: DNA-lysisbuffer voorbereiden: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl in 100 mM tris-HCl, pH 8,5. Was en autoclaaf de weefsel slijper voor het experiment.
  3. De tweede dag, voeg ongeveer 50 μg RNase A per monster voor ten minste 12 uur bij 37 °C.
  4. Voeg een gelijk volume fenol toe: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) en meng volledig.
  5. Centrifugeer bij 20.817 x g gedurende 15 minuten en verwijder het supernatant in een nieuwe microcentrifuge buis.
  6. Voeg 600 μL chloroform toe aan het supernatant om DNA te precipderen en meng grondig.
  7. Centrifugeer bij 20.817 x g gedurende 15 minuten en verwijder het supernatant in een andere nieuwe buis.
  8. Voeg 500 μL isopropanol toe aan het supernatant en meng grondig.
  9. Centrifugeer bij 20.817 x g gedurende 15 minuten en verwijder het supernatant volledig.
  10. Was de neerslag met 1 mL 70% ethanol, centrifugeer bij 20.817 x g gedurende 1 minuut en verwijder het supernatant volledig. Eenmaal herhalen.
  11. Droog de DNA-pellet volledig.
  12. Los DNA-pellet met tris-HCl-buffer (pH 8,5) op naar de juiste concentratie.

6. DNA dot Blot

  1. Bereid de oplossingen voor: 2 M NaOH, tris-HCl buffer (pH 8,5), 6x zoute Natriumcitraat (SSC).
  2. Maak het monster mengsel als tabel 1.
  3. Denature DNA monsters bij 100 °C gedurende 10 min, en afkoelen op ijs.
  4. Snijd de juiste maat van het nylon membraan (bijv. Hybond-N +) en spoel af met 6x SSC.
  5. Plaats het membraan op een dot-Blot-apparaat en maak verbinding met de vacuümpomp. Spot 6 μL mengsel per stip op het membraan.
  6. Hybridize gedurende 30 minuten bij 80 °C en Blokkeer het monster membraan met vetvrije melk in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 1 uur.
  7. Incuberen met primair antilichaam bij 4 °C 's nachts.
    Opmerking: het volgende primaire antilichaam: polyklonale konijn anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000).
  8. Op de tweede dag, incuberen de monster membranen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. was met TBS gedurende 10 min. Herhaal deze Wash twee keer meer.
  9. Inbroed het membraan met anti-konijn secundair antilichaam (1:5000) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
  10. Wassen met TBS voor 10 min. Herhaal deze Wash twee keer meer.
  11. Visualiseer de chemiluminescentie signalen en kwantificeer signaal intensiteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de verdeling van 5-hmC in de hippocampus van volwassen muizen te onthullen, hebben we immunofluorescentie uitgevoerd met antilichamen tegen neuronale cellen (NeuN) en 5-hmC. In de hippocampus, 5-hmC co-gelokaliseerd goed met neuronale cel marker NeuN (Figuur 1a-H), suggereren een verrijking van 5-HMC in neuronen.

Om de dynamiek van 5-hmC tijdens neuronale ontwikkeling te bepalen, werd eerst een dot-Blot uitgevoerd met DNA-monsters geïsoleerd va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Epigenetische modificaties spelen essentiële rollen tijdens de ontwikkeling van de hersenen, rijping, en functie. Als een stabiele marker voor DNA-modificatie, reageert Dynamic 5-hmC op gedrags aanpassing, neuronale activiteit, en is positief gecorreleerd met genexpressie; Dus, het is betrokken bij de normale functie van de hersenen en neurologische aandoening4. Om zijn functie in cellen en weefsels te verkennen, is het noodzakelijk om het bestaan van 5-hmC te detecteren en het niveau voor en na d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er bestaan geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

XL werd deels gesteund door de nationale sleutel R & D-programma van China (2017YFE0196600), en de National Natural Science Foundation of China (Grant NOS. 31771395, 31571518). Q.S. werd gesteund door de National Key Research and Development Program van China (2017YFC1001703) en de belangrijkste onderzoeks-en ontwikkelingsprogramma van de provincie Zhejiang (2017C03009). W.X. werd gesteund door de Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY18H020002) en Science Technology Department van de provincie Zhejiang (2017C37057).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )Sigma-AldrichD8417
Adobe Photoshop softwareAdobe Inc./
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo FisherA11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgGThermo FisherA11001
anti-5-hydroxymethylcytosineActive Motif39769
anti-NeuNMilliporeMAB377
B27 supplementGibco12587-010
B27 supplementGibco12580-010
B27 supplementGibco17504-044
Cryostat microtomeLeicaCM1950
DMEM/F-12 mediumOmegaScientificDM25
Epidermal growth factorPeproTech100-15
Fibroblast growth factor-basicPeproTech100-18B
ForskolinSigma-AldrichF6886
GlutaMaxThermo35050061
L-GlutamineGibco25030-149
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal goat serumVector LaboratoriesZ0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ )Amersham BiosciencesRPN303B
OCTLeica14020108926
Pen StrepGibco15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )Sigma-Aldrich516726
Poly-D-LysineSigmaP0899-10
Proteinase KVVR39450-01-6
Retinoic acidSigma-AldrichR2625
Triton X-100SolarbioT8210

Referenties

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905(2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194(2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903(2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Detectie van 5-hydroxymethylcytosineimmunofluorescentiekleuringDNA dot-blotmuizenbreinweefselweefselcoupescryostaat-microtoomprimaire antilichamensecundaire antilichamenconfocale microscopie
De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.