Methodenartikel

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59955

⸱

24 maart 2020

 ,  ,  , 
1Toxicology Program, ILS, Inc., 2Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.

Samenvatting

De komeettest wint aan populariteit als middel om DNA-schade in gekweekte cellen en weefsels te beoordelen, met name na blootstelling aan chemicaliën of andere milieustressoren. Het gebruik van de komeettest bij regelgevingstests op genotoxische mogelijkheden bij knaagdieren is in 2014 ingegeven door de goedkeuring van een testrichtlijn van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO). Komeettestdia's worden meestal bereid uit vers weefsel op het moment van obductie; echter, bevriezing weefsel monsters kunnen voorkomen dat logistieke uitdagingen in verband met gelijktijdige voorbereiding van dia's van meerdere organen per dier en van veel dieren per studie. Het invriezen maakt het ook mogelijk om monsters van de blootstellingsfaciliteit naar een ander laboratorium te verzenden voor analyse, en de opslag van bevroren weefsel vergemakkelijkt het uitstellen van een beslissing om DNA-schadegegevens voor een bepaald orgaan te genereren. De alkalische komeettest is nuttig voor het detecteren van blootstelling-gerelateerde DNA dubbele en single-streng pauzes, alkali-labiele laesies, en streng breekt geassocieerd met onvolledige DNA excisie reparatie. Echter, DNA-schade kan ook het gevolg zijn van mechanische scheren of onjuiste monster verwerking procedures, verstoren de resultaten van de test. Reproduceerbaarheid bij het verzamelen en verwerken van weefselmonsters tijdens de obductie kan moeilijk te controleren zijn als gevolg van fluctuerend laboratoriumpersoneel met wisselende ervaring in het oogsten van weefsels voor de komeettest. Het verbeteren van de consistentie door bijscholing of inzet van mobiele eenheden met ervaren laboratoriumpersoneel is kostbaar en mogelijk niet altijd haalbaar. Om consistente generatie van hoogwaardige monsters voor komeettestanalyse te optimaliseren, werd een methode geëvalueerd voor het homogeniseren van flash diepgevroren kubussen van weefsel met behulp van een aangepast weefselsnijdend apparaat. Monsters die met deze methode voor de komeettest zijn bereid, vergeleken in kwaliteit gunstig in kwaliteit met verse en bevroren weefselmonsters die tijdens de obductie worden geprikt. Bovendien werd een lage DNA-schade bij de uitgangswaarde gemeten in cellen van bevroren kubussen van weefsel na langdurige opslag.

Inleiding

De komeettest wordt steeds vaker gebruikt als middel om DNA-schade te evalueren in gekweekte cellen en weefsels die worden blootgesteld aan chemicaliën of andere milieustressoren1. De test kan detecteren DNA dubbele- en single-streng pauzes, alkali-galiele laesies, en single-streng pauzes geassocieerd met onvolledige DNA-reparatie. De richtsnoer van de Internationale Raad voor harmonisatie van de technische voorschriften voor farmaceutische producten voor menselijk gebruik (ICH) beveelt een DNA-strengbreuk zoals de komeettest aan als een tweede test ter aanvulling van de micronucleustest van knaagdieren voor de beoordeling van in vivo genotoxiciteit en als vervolgtest voor de beoordeling van de werkingswijze in doelorganen van tumorinductie2. De Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) beveelt de in vivo komeettest aan als een geschikte follow-uptest om de relevantie van een positief resultaat in een in vitro genotoxiciteitstest te onderzoeken3. In 2014 werd een OESO-testrichtlijn goedgekeurd voor de test van de knaagdierkomeet, waardoor de aanvaardbaarheid van de test voor gebruik bij het testen van genotoxische stoffen in de regelgeving werd verhoogd. De test is gebaseerd op de elektroforetische scheiding van ontspannen DNA-lussen en fragmenten die migreren uit nucleoids van lysed cellen. Kortom, enkele cellen zijn ingebed in agarose die is gelaagd op microscoop dia's. Dia's worden vervolgens ondergedompeld in lysis buffer gevolgd door een alkalische (pH > 13) oplossing, die het mogelijk maakt de strak opgerolde nucleaire DNA te ontspannen en te ontspannen. Dia's worden dan geplaatst in een elektrisch veld, dat migratie van negatief geladen DNA naar de anode stimuleert, waardoor beelden ontstaan die lijken op kometen; de relatieve hoeveelheid DNA in de komeetstaart in vergelijking met de komeetkop is rechtstreeks evenredig met de hoeveelheid DNA-schade; DNA-inhoud in de staart wordt meestal gekwantificeerd met behulp van digitale imaging software.

Omdat de komeettest gefragmenteerd DNA detecteert, kan nauwkeurige kwantificering van door blootstelling veroorzaakte DNA-schade worden verward met chromatinefragmentatie geassocieerd met necrose of apoptose als gevolg van door de behandeling veroorzaakte cytotoxiciteit of stress. Bovendien kan DNA-schade optreden als gevolg van mechanische afschuiaal of onjuiste monsterverwerking4. Het belang van het behoud van geoogst weefsel gekoeld voorafgaand aan dia voorbereiding om de basislijn niveau van DNA-schade te minimaliseren is eerder aangetoond5,6. Vele laboratoria bereiden komeettestdia's van vers weefsel; Dit kan echter logistiek uitdagend zijn bij het voorbereiden van dia's van meerdere weefseltypen per dier in een studie met een groot aantal dieren. Bovendien vormt dit een probleem wanneer diavoorbereiding en -analyse zich in een extern laboratorium moeten voordoen, waardoor de verzending van monsters noodzakelijk is. Bijvoorbeeld, het Amerikaanse National Toxicology Program bevat de komeet test als onderdeel van haar genetische toxicologie testen programma (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) en soms bevat de test in 28 of 90 dagen herhalen dosis toxiciteit studies; dit vereist het verzamelen van weefsel door het in-life laboratorium en de overdracht van monsters naar een ander laboratorium voor analyse. Om dit te bereiken, worden weefselstukken gehakt, en/of epitheelcellen van het maag-darmkanaal worden geschraapt en cellulaire suspensuspensie worden flash bevroren en opgeslagen in een vriezer voor latere verzending en opslag door het ontvangende laboratorium tot analyse7. Een goede behandeling van monsters is van cruciaal belang voor het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit met behulp van bevroren weefsel; echter, reproduceerbare manipulatie van weefselmonsters tijdens necropsies uitgevoerd door steeds veranderende personeel is moeilijk te controleren, vooral bij in-life laboratoria die niet routinematig oogsten weefsels voor de komeet test. Opfristraining van obductiepersoneel of het gebruik van een mobiele eenheid die wordt bemand door ervaren laboratoriumpersoneel om verse of bevroren weefselmonsters te verzamelen, is vaak te duur, niet haalbaar of gewoon ondergewaardeerd.

Om een consistente generatie van hoogwaardige weefselmonsters beter te garanderen voor overdracht naar een afgelegen locatie voor comettestanalyse, werd het nut van een gepubliceerde methode6 van weefselbehoud van vlambevroren kubussen van weefsel onderzocht. Bij deze methode worden bevroren blokjes weefsel geladen in een roestvrijstalen weefselverwikringsapparaat (figuur 1) dat in een microcentrifugebuis met koude buffer wordt geplaatst. De kubus van weefsel wordt vervolgens geduwd door een kleine meter gaas aan het einde van het apparaat. Herhaaldelijk dwingen van het weefsel suspensie door de mesh zeef in beide richtingen meerdere malen resulteert in een relatief uniforme eencellige suspensie. Monsters bereid door deze methode gunstig in kwaliteit vergeleken met zowel verse als bevroren weefsel monsters bereid door hakken. Als bijkomend voordeel, in tegenstelling tot gehakte monsters, kunnen weefselkubussen gedurende langere tijd bevroren worden opgeslagen en nog steeds resultaten van hoge kwaliteit opleveren in de komeettest.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Weefsels werden geoogst tijdens het uitvoeren van studies uitgevoerd in AAALAC-geaccrediteerde faciliteiten in NTP-contractlaboratoria in overeenstemming met de good laboratory practice regelgeving (21 CFR Deel 58) en diergebruik protocollen goedgekeurd door de Institutional Animal Commissie zorg en gebruik (IACUC) in elk laboratorium.

1. Weefseloogst en -verwerking

LET OP: Het is nuttig om dubbele monsterbuizen (bijvoorbeeld lever) voor te bereiden of ongeveer de helft van een monster over te brengen naar een andere opslagbuis (bijvoorbeeld twaalfvingerige darm, maag) om indien nodig een heranalyse mogelijk te maken. Om de potentiële variabiliteit van monster tot monster voor darmkanaalweefsels te minimaliseren, wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat hetzelfde weefselgebied ten opzichte van de maag voor elk dier wordt bemonsterd en een monster wordt verdeeld om dubbele monsters te genereren. Plastic tangen worden aanbevolen voor het overbrengen van kleverige weefsels zoals de hersenen. Als optie kunnen gehakte, geschraapte of gehomogeniseerde weefselpreparaten worden gefilterd om homogene eencellige suspensuspensuspen te bereiken met behulp van een 40 μm celzeef die aan een conische buis is bevestigd.

  1. Verwijder alle bijgevoegde verbindende weefsel, organen en puin van orgaan (en) van belang. Onmiddellijk na verwijdering, zwiepen het orgel krachtig in een middelgrote weegboot met ~ 7 mL van koude vers bereide snijden oplossing (Mg++, Ca++ en fenol rood-vrije Hank's Balanced Salt Solution, 10% v / v DMSO, en 20 mM EDTA pH 7.5) om restbloed en puin te verwijderen.
  2. Breng elk orgaan over naar een andere schone weegboot met voldoende (~ 7 mL) koude snijdende oplossing om het weefsel onder water te houden, op ijs, tot verdere verwerking.
  3. Verwijder een gedeelte van elk orgaan van belang en plaats het in een inbedding scassette. Fix in 10% neutraal gebufferd formaline, trim, en paraffine insluiten volgens de standaard procedures van het laboratorium voor mogelijke toekomstige histopathologie evaluatie.
  4. Snijd voor de lever een 5 mm lengtegedeelte van de linkerkwab en swish in ~ 7 mL koude snijoplossing. Plaats de strook weefsel in een schone middelgrote weegboot met ~ 7 mL koude snijden oplossing en handhaven op ijs tot klaar om verder te verwerken (stap 1.8 of 1.11).
  5. Snijd voor de twaalfvingerige darm een 10 mm gedeelte van de twaalfvingerige proximal in de maag. Met behulp van een 21-25 G naald, spoelen om vuil en bacteriën te verwijderen.
    1. Steek de naald in het ene uiteinde van de twaalfvingerige darm en spoel met 1 mL koude snijdenoplossing.
    2. Spoel de andere richting door het omdraaien van de twaalfvingerige darm over en herhalen met nog eens 1 mL van het snijden oplossing. Gooi de naald weg.
    3. Snijd de twaalfvingerige darm open en spoel het in ~ 7 mL van snijoplossing alvorens het in een middelgrote weegboot met ~ 7 mL van schone snijoplossing; op ijs te houden totdat het verder kan worden verwerkt (stap 1.8 of 1.11).
  6. Voor de hersenen kan het nuttig zijn om de hersenen eerst in twee hemisferen te verdelen; een halfrond kan worden opgeslagen voor mogelijke histopathologie (zie stap 1.2).
    1. Ontleed de hersenen regio (s) van belang en zachtjes swish in ~ 7 mL van koude snijden oplossing.
    2. Breng weefsel(en) over naar een schone middelgrote weegboot met ~ 7 mL koude snijoplossing en onderhoud op ijs totdat het klaar is om verder te verwerken (stap 1.8 of 1.11; merk op dat kleine regio's zoals het cerebellum en de hippocampus mogelijk geen verdere trimmen nodig hebben).
  7. Voor de maag
    1. Verwijder en gooi de voormaag weg. Snijd de kliermaag open en was vrij van voedsel met behulp van ~ 7 mL van koude snijbuffer in een middelgrote weegboot.
    2. Verwijder een 5 mm strook kliermaag proximal aan de twaalfvingerige darm voor fixatie voor mogelijke histopathologie evaluatie (zie stap 1.2).
    3. Plaats de resterende maag in ~ 7 mL van koude hakken buffer in een middelgrote weegboot en incuberen op ijs voor 15-30 min.
      LET OP: Deze incubatiestap is wellicht niet nodig; deze stap is opgenomen in het JaCVAM-validatieprotocol, maar wordt niet vermeld in de OESO-testrichtlijn8.9
    4. Breng de maag naar een schoon stuk paraffine (of petrischaal of weegboot) en schraap het oppervlakteepitheel twee of meer keer voorzichtig met behulp van een scalpelmes of een polytetrafluoroetheen (PTFE) schraper om vuil te verwijderen. Pak het maagslijmvlies op met tangen en spoel met 1 mL koude snijdende buffer met behulp van een pipet. Breng het maagweefsel naar een schoon oppervlak of schaal.
    5. Schraap het maagepitheel 4-5 keer (indien nodig meer) zorgvuldig in een snijdende oplossing (meestal 250 μL/muis of 500-1.000 μL/rat) met de achterkant van een scalpelmes of PTFE-schraper om de cellen vrij te geven. Eventueel, spoel weefsel met een ongeveer gelijk volume van het snijden oplossing om meer cellen te herstellen. Verzamel de snijdende oplossing met vrijgekomen cellen met behulp van een pipet en breng over op een microcentrifugebuis op ijs.
  8. Snijd voor weefselmonsters een 3-4 mm sectie lever- of hersenweefsel of ~ 5 mm twaalfvingerige darm en breng over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 of 2,0 mL met 1 mL koude snijoplossing. Snel gehakt (≤30 s) met een schaar tot het fijn verspreid is, terwijl het monster koud blijft. Het monster moet er licht troebel uitzien; echter, het is gebruikelijk voor sommige stukken te blijven die zal vestigen op de bodem van de buis.
  9. Om het weefsel vers te gebruiken, onderhouden buizen met gehakt weefsel of geschraapte epitheelcellen op ijs; gebruik het weefsel om komeetdia's te bereiden binnen ongeveer 1 uur van de oogst (beschreven in punt 2).
  10. Voor het invriezen van de weefselmonsters, onmiddellijk na het snijden of verzamelen van geschraapte epitheelcellen
    1. Zet het buisdeksel en laat buis in een Dewar-kolf met vloeibare stikstof; buizen mogen gedurende de levensduur van de obductie (≤3 h) in vloeibare stikstof worden gehouden.
    2. Haal buizen met behulp van een pollepel en plaats op droogijs te sorteren. Breng buizen naar een vriesdoos op droogijs en bewaar de doos in een vriezer van -80 °C.
  11. Snijd voor het bereiden van bevroren blokjes weefsel verschillende kleine stukjes weefsel (≤4 mm in diameter en ~6 mm in lengte; Figuur 1).
    1. Laat ze individueel direct in een middelgrote weegboot of ander geschikt vat met vloeibare stikstof vallen.
    2. Wacht een paar seconden tot de stukken volledig bevriezen en breng individuele bevroren weefselblokjes over op een gelabelde microcentrifugebuis of cryobuis die op droogijs wordt gehouden; laat de stukken niet samenklonteren tijdens het vriesproces.
    3. Breng buizen naar een vriesdoos op droogijs en bewaar de doos in een vriezer van -80 °C.

2. Voorbereiding van de dia

  1. Voor gehakt/geschraapt weefsel
    1. Onderhoud buizen met verse weefsels op nat ijs.
    2. Plaats buizen van bevroren weefsel in een waterbad op kamertemperatuur totdat de monsters volledig ontdooid zijn, terwijl ze koud worden gehouden. Breng de buizen onmiddellijk op ijs.
    3. Onmiddellijk voorafgaand aan het terugtrekken van cellen voor overdracht naar agarose (stap 2.3), meng elke celsuspensie voorzichtig; voor niet-gefilterde monsters, laat grote brokken te vestigen op de bodem van de buis. Houd alle buizen op ijs totdat de glijbanen voor alle monsters zijn voorbereid.
  2. Voor in blokjes
    1. Haal buizen met weefselblokjes uit de vriezer van 80 °C en blijf op droogijs tot de voorbereiding van de dia.
    2. Aliquot 1 mL van merchant's medium (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) of snijden oplossing in een gelabelde 1,7 mL microcentrifuge buis voor elk monster en onderhouden op ijs.
    3. Snel werken om weefselontdooiing te voorkomen, plaats een blokje weefsel in het open uiteinde van een weefselvan de kamertemperatuur (Figuur 1). Er mogen meerdere weefselstukken worden gebruikt; indien nodig mag het bevroren weefsel met een koude mortel en stamper in kleinere stukken worden gesneden of gebarsten om de kubusgrootte te verkleinen om in het apparaat te passen.
    4. Plaats snel een op maat gemaakte spuitzuiger in het apparaat om het weefsel naar het gaasuiteinde te duwen, dat vervolgens in de microcentrifugebuis moet worden geplaatst die koude snijdende oplossing bevat; voorkomen dat de vloeistof wordt overlopen. Dompel het gaasuiteinde van het apparaat voor ongeveer 5-10 s onder in de koude snijdende oplossing om het weefsel volledig te laten ontdooien.
    5. Druk de zuiger volledig af totdat cellen worden gezien die door de mesh poriën extruderen. Trek vervolgens de zuiger ongeveer 2,5 cm omhoog en druk weer volledig naar beneden; herhaal het proces meerdere malen totdat de snijdende oplossing troebel wordt.
    6. Indien nodig kan het monster worden geconcentreerd om de celdichtheid te verhogen door gekoelde centrifugering gedurende 5 min bij 1100 rpm en verwijdering van een deel van de supernatant.
    7. Herhaal het proces voor alle monsters met behulp van een schoon weefsel snijden apparaat voor elk monster.
  3. Breng 50 μL celsuspensie over op een buis met 450 μL van 0,5% laag smeltpunt agarose bij 37 °C.
    LET OP: De volumes kunnen worden aangepast, maar de hoeveelheid agarose moet ≤1% zijn.
  4. Dia's voorbereiden en scoren zoals eerder beschreven10,11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Studie 1
Lever werd geoogst uit twee cohorten van mannelijke Sprague Dawley ratten toegediend maïsolie voor 4 dagen, gespreid door een week. Dia's werden bereid uit vers gehakt weefsel, bevroren gehakt weefsel, en bevroren blokjes weefsel verwerkt in medium merchant's of snijden oplossing met behulp van het weefsel snijden apparaat. Bevroren weefsels verkregen van dieren uit het eerste cohort werden geëvalueerd na de opslag van de vriezer voor ~ 3,5 maanden. Bevroren weefsels verkregen van dieren uit ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zoals eerder aangetoond7,12,13, goed behandeld flash bevroren gehakt weefsel biedt goede resultaten in de komeet test. In feite zijn de DNA-waarden van de basislijn % staart voor bevroren gehakte ratten- en muizenlever die in ons laboratorium worden bereid, doorgaans ≤6%, zoals aanbevolen door de OESO-testrichtlijn9 voor vers gehakte rattenlevermonsters. Er zijn goede resultaten behaald door meerdere labo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dit werk werd ondersteund door het Intramural Research Program van het NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) in opdracht van HHSN273201300009C; de daarin vervatte verklaringen, meningen of conclusies vertegenwoordigen echter niet noodzakelijkerwijs de verklaringen, meningen of conclusies van NIEHS, NIH of de regering van de Verenigde Staten.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn schatplichtig aan Lincoln Martin en Kelley Owens voor deskundige technische bijstand voorbereiden en scoren komeet dia's en Dr Carol Swartz voor het uitvoeren van statistische analyses. De auteurs erkennen ook de ondersteunende bijdragen van leden van de genetische toxicologie, onderzoekstoxicologie en obductie programma's op ILS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CryovialsCorning Costar430488
Dental Wax SheetsElectron Microscopy Sciences72670
Dissecting (Mincing) Micro ScissorsFisher Scientific08-953-1B
DMSOSigma-AldrichD8418
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175-079
KClTeknovaP0315-10
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
Low Melting Point AgaroseLonza50081
Microfuge Tubes (1.7 mL)Corning3207
Na2EDTASigma-AldrichE5134
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS6191
Neutral Buffered FormalinLeica600
Scalpel BladesMiltex4-110
Syringe Plunger (1 mL)Fisher Scientific or Vitality Medical14-826-88; 8881901014Becton Dickinson of Monoject tuberculine spuit
Tissue Mincing DeviceNorGenoTech (Oslo, Noorwegen)GeenKleine variabiliteit in diameter waargenomen die de precisie van de plunjer kan beïnvloeden.
Pincet, plasticTrade Winds DirectDF8088NVersterkt nylon, niet-steriel, stompe punt, autoclaveerbaar; tradewindsdirect.com
Weigh BoatsKrackler Scientific/Heathrow Scientific6290-14251B

Referenties

  1. van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
  2. ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
  3. EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).
  4. Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
  5. Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
  6. Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
  7. Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
  8. Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
  9. OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
  10. Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
  11. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833(2016).
  12. Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
  13. Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
  14. Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Weefselvermaalingvloeibare stikstofprepareren van objectglazengenotoxisch potentieelweefselbewaringmonstervoorbereidingmechanische afschuiving

Gerelateerde artikelen