Method Article

Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish

DOI:

10.3791/59956

⸱

January 28th, 2020

 ,  , 
1MRC Molecular Haematology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, University of Oxford, 2BHF Centre of Research Excellence, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, University of Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genbewerkingstechnologieën hebben onderzoekers in staat gesteld om zebravissen mutanten te genereren om de genfunctie relatief eenvoudig te onderzoeken. Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van parallelle embryogenotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen bij zebravissen. Deze onbevooroordeelde aanpak zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in fenotypische analyses op basis van in situ hybridisatie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In situ hybridisatie (ISH) is een belangrijke techniek die onderzoekers in staat stelt om mRNA-distributie in situ te bestuderen en al tientallen jaren een kritische techniek in ontwikkelingsbiologie is. Traditioneel, de meeste genexpressie studies gebaseerd op visuele evaluatie van het ISH-signaal, een methode die gevoelig is voor bias, met name in gevallen waarin monster identiteiten bekend zijn a priori. We hebben eerder gerapporteerd over een methode om deze bias te omzeilen en een nauwkeurigere kwantificering van ISH-signalen te bieden. Hier presenteren we een eenvoudige gids om deze methode toe te passen om de expressieniveaus van genen van belang in MET ISH bevlekte embryo's te kwantificeren en dat te correleren met hun overeenkomstige genotypen. De methode is bijzonder nuttig om ruimtelijk beperkte genexpressiesignalen te kwantificeren in monsters van gemengde genotypen en biedt een onbevooroordeeld en nauwkeurig alternatief voor de traditionele visuele scoringsmethoden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De introductie van genoombewerkingstechnologieën (ZFN, TALENs en meer recent, CRISPR/Cas9) heeft geleid tot een enorme toename van het aantal laboratoria over de hele wereld die gebruik maken van deze systemen om de functie van specifieke genen in vivo te bestuderen. Met name zebravissen zijn vatbaar voor genetische manipulatie en er zijn in het recente verleden veel mutanten gegenereerd1,2. Voor ontwikkelingsbiologen is een van de meest voorkomende methoden om de fenotypische gevolgen van genmutaties in de embryonale ontwikkeling te beoordelen in situ hybridisatie (ISH). Bij afwezigheid van duidelijke morfologische gebreken die homozygoot mutanten scheiden van hun wilde type of heterozygoot broers en zussen, is het essentieel om verschillende genotypen nauwkeurig te kunnen identificeren.

Het klassieke ISH baseert zich op kwalitatieve analyses van signaalintensiteiten om conclusies te trekken over regulerende interacties tussen het gen van belang en geselecteerde markergenen. Hoewel nuttig, deze analyses lijden aan technische variatie en kan worden beïnvloed door de verwachtingen van onderzoekers. Zo werd een methode ontwikkeld om genexpressie te kwantificeren na beeldvorming van ISH-gekleurde embryo's, zonder voorkennis van het overeenkomstige genotype. Dit werd gevolgd door een efficiënte DNA-extractie en genotypering die ons in staat stelde om het genotype kwantitatief te correleren met genexpressie3. Hoewel de genotypering van embryo's na ISH vóór4,5is gebruikt, is op beeld gebaseerde kwantificering van ISH-patronen niet op grote schaal gebruikt, afgezien van een paar studies6,7. De meest populaire alternatieven vertrouwen op visuele score of telling van ISH-gekleurde cellen8,9,10, zowel gevoelig voor slechte reproduceerbaarheid en onderzoeker bias. Deze methode is vooral nuttig om veranderingen in genen te bestuderen met expressiepatronen die ruimtelijk beperkt zijn, zoals runx1 of gata2b, beide uitgedrukt in een beperkte subset van aortabodemcellen, het hemogene endotheel11,12.

Hier streven we ernaar om een praktische gids te geven voor de implementatie van de kwantificering door beeldanalyse met behulp van Fiji13,evenals het DNA-extractie- en genotyperingsprotocol. Dit is bedoeld om onze eerder gepubliceerde methode3visueel te illustreren. Onze methode maakt een nauwkeurige weergave van de variatie in genexpressie gedetecteerd door ISH en een onpartijdige toewijzing van genexpressieniveaus aan specifieke genotypen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedures met betrekking tot proefpersonen zijn geregeld door de Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 en zijn goedgekeurd door het Ministerie van Binnenlandse Zaken en de lokale Animal Welfare and Ethical Review Body.

1. Beeld ISH-bevlekte embryo's

  1. Bereid een glyceroloplossing (50%–80% in 1x PBS-buffer) en meng om de oplossing te homogeniseren (bijvoorbeeld minstens 5 min in een roller laten staan). Deze oplossing kan maandenlang op kamertemperatuur worden gehouden.
  2. Na in situ hybridisatie14,15,16,17, breng embryo's naar de glycerol oplossing met een 3 mL Pasteur pipet en laat genoegen nemen met ten minste 5 min. Als imaging embryo's ouder zijn dan 24 pk (uren na bevruchting), kunnen ze worden gebleekt zoals beschreven18.
    1. Bereid en label voldoende PCR-buizen om MET ISH bevlekte embryo's na beeldvorming over te brengen.
  3. Voeg 100% glycerol toe aan de bodem van de put in een glazen depressieglijbaan met een Pasteur pipet van 3 mL.
  4. Breng met behulp van een 3 mL Pasteur pipet een ENKEL ISH-glas-in-loodembryo over naar de glazen glijbaan en oriënteer zo nodig onder een stereomicroscoop uitgerust met een digitale camera en onder- en bovenverlichting.
    OPMERKING: Gebruik gel laden pipet tips om de embryo's te positioneren voor beeldvorming, maar andere instrumenten (bijvoorbeeld forceps, ontleden naald) zal even adequaat zijn.
  5. Stel met het eerste embryo de verlichting en belichtingstijd aan bij de gewenste vergroting. Gebruik deze voorwaarden voor alle embryo's in hetzelfde experiment (d.w.z. als imaging 40 embryo's van een heterozygoot mutant incross, zorg ervoor dat de verlichting, belichtingstijd en vergroting voor iedereen hetzelfde zijn).
  6. Beeld zoveel embryo's als nodig is. Label elke afbeelding met een uniek nummer. Breng het embryo na beeldvorming over naar een PCR-buis/plaat met hetzelfde nummer.
    OPMERKING: Afbeeldingen moeten worden opgeslagen als TIF-bestanden, maar andere indelingen zijn ook voldoende.
    1. Verwijder indien nodig overtollige glycerol in de PCR-buizen/platen.
      LET OP: Op dit punt kunnen de embryo's enkele weken bij kamertemperatuur in de PCR-buizen worden opgeslagen.

2. DNA extraheren en genotype de MET ISH bevlekte embryo's

OPMERKING: Gebruik hier een betrouwbare en goedkope methode om genomic DNA te isoleren op basis van de HoTSHOT-methode19 met een DNA-extractie-efficiëntie van 95%-100%3.

  1. Nadat de beeldvorming is voltooid, voegt u 40-75 μL alkalische lysisbuffer (bijvoorbeeld HoTSHOT) toe aan elke buis.
  2. Incubeer bij 95 °C gedurende ongeveer 30 min en koel de buizen af tot 4 °C voordat u een gelijk volume neutralisatiebuffer toevoegt. Een nachtelijke incubatie bij 4 °C kan de EFFICIËNTIE van de PCR verbeteren.
    OPMERKING: Op dit punt kan het genomische DNA worden gebruikt voor genotypering of opgeslagen bij -20 °C totdat het nodig is.
  3. Genotype monsters met een geschikte methode (bijvoorbeeld HRMA, RFLP)3,20,21 indien vereist voor de mutatie van belang.
  4. Let op het genotype dat overeenkomt met elk monster (bijvoorbeeld met behulp van een spreadsheetsoftware).

3. Kwantificeer de pixelintensiteit van met ISH bevlekte embryo's (beeldanalyse met Fiji-software)

  1. Om de in situ hybridisatie (ISH) kleursignaalintensiteit te kwantificeren, zet u alle afbeeldingen om in 8-bits grijswaarden zoals beschreven3. Als de afbeeldingen zijn opgeslagen als . TIF-bestanden, gebruik een Fiji-macro voor batchconversie3. U ook afbeeldingen converteren in andere indelingen (bijvoorbeeld. JPG) naar . TIF met behulp van de juiste software en vervolgens converteren naar 8-bits grijswaarden met behulp van Fiji. Voor het gemak, hier is de stap-voor-stap procedure die eerder werd gepubliceerd3, met een aantal wijzigingen.
  2. Open afbeeldingen in Fiji en keer de afbeelding om met Bewerken > Omkeren. Wijzig vervolgens het afbeeldingstype in 8-bits(Afbeelding > Tekst > 8-bits).
  3. Met behulp van het veelhoekselectiegereedschap trekt u het gebied van belang (ROI) handmatig op de afbeelding rond het gebied met het signaal.
  4. Druk op t om de ROI manager te openen. Gebruik de opdracht Meting van de ROI-manager om de intensiteit van de ROI te meten. Kopieer de gemiddelde waarde van het venster Resultaten naar een spreadsheetsoftware.
  5. Verplaats dezelfde ROI, zorgen voor dezelfde grootte en vorm als de oorspronkelijke regio, naar een gebied van de zebravis die geen vlekken bevat. Herhaal stap 3.4 om de achtergrond te meten.
  6. Als u de gemiddelde pixelintensiteit van het ISH-signaal wilt verkrijgen, trekt u de gemiddelde intensiteitswaarde van het achtergrondgebied af van die van het gekleurde gebied voor elk embryo.
  7. Elke intensiteitswaarde toewijzen aan een genotype (vanaf stap 2.3).

4. Analyseer de resultaten met passende statistische tests

  1. Zet alle waarden op één Q-Q-plot in kaart om eventuele afwijkingen van de normale verdeling te identificeren.
    LET OP: Normale distributie kan ook worden geverifieerd met de Kolmogorov-Smirnov test of de Shapiro-Wilk test. Voor grote steekproefmaten is er echter een hoog risico op false positives in deze tests.
  2. Als er sterke afwijkingen van de normale verdeling zijn, transformeert u alle waarden (met ln- of sqrt-functies) om ervoor te zorgen dat ze normaal worden verdeeld voordat u verdergaat.
  3. Analyseer de verschillen tussen de waarden (indien nodig getransformeerd) toegewezen aan elk genotype (wt vs. heterozygoot vs. mutant) met 2-tailed ANOVA met 95% betrouwbaarheidsniveaus, goed voor de gelijkheid van varianties met een Levene's test en Welch correctie. Gebruik voor vergelijkingen tussen elk paar genotypen de post-hoctest van Tukey (gelijke varianties) of Games-Howell (ongelijke varianties).
    1. Als de waarden normaal gesproken niet worden verdeeld ondanks de transformatie, gebruikt u een niet-parametrische test (Kruskall-Wallis) om de verschillen tussen gerangschikte waarden en een post-hoc Dunn's meervoudige vergelijkingentest met Bonferroni-correctie voor pairwise te analyseren Vergelijkingen.
  4. Zet de niet-getransformeerde waarden (vanaf stap 3.6) in als puntpercelen voor de beste weergave van de resultaten.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de praktische toepassing van de pijplijn voor beeldgekwantitie en embryogenotyping zoals elders gepubliceerd3. De werkstroom voor de methode wordt weergegeven in figuur 1. Om te illustreren hoe deze methode te gebruiken, werd ISH uitgevoerd voor dnmt3bb.1 in 33 hpf embryo's van een runx1W84X/+22 incross ( figuur2). 130 embryo's werden afgebeeld met dezelfde verlichtingsomstandigheden als beschreven in het protocol en labelen ze met een uniek nummer. Na beeldvorming werd elk embryo overgebracht naar een PCR-buis voor genotypering. Op dit punt werd de beeldanalyse uitgevoerd om een pixelintensiteitswaarde toe te schrijven aan elke afbeelding. Het genotype werd vervolgens toegewezen aan de overeenkomstige afbeelding en de pixelintensiteitswaarden gegroepeerd op basis van hun genotype voor statistische analyse. Een daling van de dnmt3bb.1-expressie werd gedetecteerd in runx1W84X/W84X mutanten (figuur 2A,B)3, in overeenstemming met eerdere waarnemingen5. Interessant is dat runx1W84X/+ heterozygoot embryo's geen significante verschillen in dnmt3bb.1-expressie (figuur 2A,B)vertoonden in vergelijking met zijn broers en zussen in het wilde type, wat suggereert dat één exemplaar van Runx1 voldoende is om dnmt3bb.1-expressie op geschikte niveaus te handhaven.

Veel zebravis mutanten niet aan een embryonale fenotype dat anders kan worden gedetecteerd met behulp van andere verlies van functietechnologieën zoals morpholino oligonucleotiden (MOs) tonen. Deze discrepantie kan worden toegeschreven aan een aantal oorzaken, waaronder off-target effecten, maternale eiwitcompensatie, een hypomorfe allel23 of het recent ontdekte fenomeen van genetische compensatie24,25,26,27. In dit voorbeeld vroegen we of runx1 expressie werd verminderd of verloren in lmo4auob100 mutanten sinds eerder gepubliceerde gegevens met behulp van een lmo4a MO gesuggereerd dat runx1 is verminderd in lmo4a morphants28. Hier, de analyse bleek geen significante verschillen in runx1 expressie tussen wild type en lmo4auob100 homozygous mutanten3 (Figuur 3A, B). Verdere analyse door enkel embryo qPCR toonde aan dat er een kleine maar significante daling van runx1 expressie in lmo4auob100 mutanten (Figuur 3C). Het is dus mogelijk dat beeldkwantificering mogelijk geen kleine verschillen in expressieniveaus kan detecteren. Als alternatief is het gebrek aan verschil tussen genotypen die we hebben ontdekt echt en detecteren de qPCR-experimenten veranderingen in runx1-expressie in andere weefsels zoals de telenchephalon waar zowel lmo4a als runx1 worden uitgedrukt. Onderzoekers moeten hun resultaten altijd verifiëren met een onafhankelijke methode zoals qPCR, maar idealiter verrijkend voor het weefsel van belang door flow cytometrie, bijvoorbeeld.

In zeldzame gevallen waarin de ISG een hoge achtergrond heeft(figuur 3D),is de pixelintensiteit van dit gebied zo hoog dat aftrekking van de signaalwaarde een negatief getal oplevert en in dergelijke gevallen zouden deze embryo's van de analyse worden uitgesloten. In onze ervaring gebeurde dit in ongeveer 0,4% van de runx1-gesondeerde embryo's3, maar kan variëren tussen experimenten, sondes of batches van reagentia. Hoewel dat een beperking van de methode zou kunnen zijn, is het zeer onwaarschijnlijk dat de lage frequentie van een hoge achtergrond de algemene resultaten zal beïnvloeden.

Om het effect van het selecteren van verschillende gebieden voor achtergrondcorrecties te testen, hebben we eerst de pixelintensiteit van het runx1 ISH-signaal gemeten in 28 hpf-embryo's, waarbij we verschillende regio's gebruikten voor achtergrondcorrecties(figuur 4). Er werden vier verschillende regio's geselecteerd: twee in het stamgebied (R1 en R2), één in het dooiergebied (onbevlekt, maar waarschijnlijk achtergrondkleuring) en een kleiner gebied voor de ROI (R4, figuur 4B). Het meten van de pixelintensiteit in deze regio's vertoonde een relatief stabiel verschil in intensiteit tussen ROI en achtergrondgebied(figuur 4C). Echter, R3 toonde altijd zeer hoge waarden (boven die in de ROI). Na inversie en conversie naar 8-bit, de dooier gebied lijkt zeer helder en dus niet geschikt voor gebruik als achtergrondcorrectie. R2 was dichter bij de ROI, maar bevatte een aantal ISH-signaal, en het gebruik ervan voor correctie verminderde de gemiddelde pixelintensiteit in vergelijking met een van beide R1 (zich verder dorsale, weg van het ISH-signaal) of R4. Zo zijn R1 of R4 geschikte gebieden die kunnen worden gebruikt voor achtergrondcorrectie (ondanks dat het gebied van R4 kleiner is dan dat van R1). Vervolgens wilden we vergelijken hoe het gebruik van R1 of R4 de resultaten beïnvloedde bij het vergelijken van runx1-expressie. Hiervoor kruisten we dll4+/- heterozygoten29 en analyseerden runx1 expressie in willekeurig geselecteerde wilde type en dll4-/-embryo's (Figuur 4E). Hoewel het gebruik van R1 of R4 voor achtergrondcorrectie van invloed was op individuele waarden, waren de gemiddelde pixelintensiteiten binnen hetzelfde genotype niet significant verschillend(figuur 4E). Bovendien levert het vergelijken van runx1-expressie nog steeds vergelijkbare gemiddelde intensiteitswaarden op tussen genotypen die R1- of R4-gebieden gebruiken als achtergrondcorrectie (μR1=16.3 en μR4=18.2). Samen concludeerden we dat, hoewel de keuze van het achtergrondgebied belangrijk is, de belangrijkste criteria zijn dat het geen dooiergebieden omvat (gevoelig voor accumulatie van achtergrondkleuring) en dat het geen (specifieke) kleuring mag bevatten die de pixelintensiteitswaarden van de achtergrond zou kunnen scheeftrekken.

figure-results-1
Figuur 1: Werkstroom van het parallelle beeldquantitatie- en genotyperingsprotocol. Embryo's verzameld uit een incross van vis heterozygoot voor een gemuteerd allel worden onderzocht voor het gemeten gen met een standaard ISH-protocol. Na beeldvorming wordt genomic DNA geëxtraheerd met behulp van het HotSHOT-protocol door de lysisbuffer rechtstreeks aan het embryo toe te voegen in een PCR-buis van 0,2 mL, gevolgd door een incubatie van 30 min bij 95 °C. Dit DNA wordt gebruikt voor genotypering van de embryo's door PCR, PCR en beperking fragment lengte polymorfisme (RFLP), KASP testen of een andere geschikte methode. Tegelijkertijd worden de beelden voor elk embryo omgekeerd en omgezet in 8-bit grijswaarden. ROI's van identieke vorm en grootte die het ISH-signaal (geel) en achtergrond (blauw) bevatten, worden handmatig geselecteerd en gemeten. De metingen, toegewezen aan overeenkomstige genotypen, worden statistisch geanalyseerd. Figuur aangepast van Dobrzycki et al.3Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Beeldgekwantatie in runx1 mutanten onthult verminderde niveaus van dnmt3bb.1 expressie door ISH. (A) Voorbeeld beelden van ISH in 33 pkf wild type (blauw), runx1+/W84X (groen) en runx1W84X/W84X (oranje) embryo's, met dnmt3bb.1 expressie in de dorsale aorta. (B) Pixelintensiteitswaarden van dnmt3bb.1 mRNA in runx1W84X/W84Xembryo's (n=36) zijn aanzienlijk verlaagd in vergelijking met wilde soorten (n=32) en heterozygoten (n=62) (ANOVA, p < 0,001). De variatiecoëfficiënten zijn respectievelijk 24%, 22% en 21% voor wilde type-, heterozygoot- en gemuteerde groepen. Blauw, groen en oranje gegevenspunt komen overeen met de voorbeeldafbeeldingen van paneel A. De balken vertegenwoordigen gemiddelde ± s.d. ***p<0,001 (Games-Howell post-hoc test). Figuur aangepast van Dobrzycki et al.3Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Het meten van runx1 expressieniveaus per ISH in lmo4auob100mutanten. (A) Representatieve beelden van ISH voor runx1 in 28 pkf wild type (blauw), heterozygoot (groen) en lmo4auob100/uob100 (oranje) embryo's, met de uitdrukking in de rugaorta. (B) Kwantificering van het runx1 mRNA-signaal, gedetecteerd door ISH, van 28 pkf wild type (n=15), heterozygous lmo4a+/- (het) (n=34) en lmo4auob100/uob100 mutant (n=18) embryo's uit één koppeling vertoont geen significant verschil in runx1 pixelintensiteit tussen de verschillende genotypen (ANOVA,> p 0.6). Blauw, groen en oranje gegevenspunt komen overeen met de voorbeeldafbeeldingen van paneel A. De balken vertegenwoordigen gemiddelde ± s.d. (C) Boxplots met genormaliseerde runx1 mRNA-niveaus (2-ΔCt)in één wild type (blauw; n=12) en lmo4auob100/uob100 (mut, oranje; n=12) embryo's, gemeten door qRT-PCR, met een verlaagd runx1-gehalte in de mutanten in vergelijking met wild type. *p < 0,05(t test). (D) Voorbeeld van een ISH-experiment op een 28 pkf embryo (gekleurd voor runx1, gele pijlpunten) met een hoge achtergrond. Figuur aangepast van Dobrzycki et al.3Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Effect van achtergrondintensiteitscorrectie op meetresultaten. (A) Representatief beeld van runx1 ISH kleuring in een wild type embryo op 28 pkf. (B) Zelfde beeld na inversie en conversie naar 8-bits. De regio van belang (ROI) wordt gemarkeerd in het groen en vier verschillende gebieden die worden gebruikt voor achtergrondcorrectie (R1-R4) worden in het geel gemarkeerd. (C) Ruwe pixelintensiteitmetingen in alle regio's in paneel B. Let op de intensiteit in R3 (dooier) is consistent hoger dan het werkelijke ISH-signaal in de ROI (n=11). (D) Runx1 expressieniveaus in de ROI met r1-, R2- en R4-achtergrondgebieden. Gebieden voor ROI, R1, R2 en R3~ 28500 pixels; R4~ 8500 pixels. Houd er rekening mee dat r3-achtergrond niet werd gebruikt voor deze vergelijking, omdat de achtergrondcorrectie (ROI-R3) consequent negatieve waarden opleverde. (E) Runx1 expressieniveaus in wilde type en dll4-/- mutanten die R1 of R4 gebruiken voor achtergrondcorrectie (n=10 voor elk monster). Statistische analyse in de panelen D en E werd uitgevoerd met behulp van een niet-parametrische Kruskal-Wallis-test, ervan uitgaande dat de pixelintensiteitswaarden normaal gesproken niet worden verdeeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het gebruik van deze methode moet rekening worden gehouden met enkele factoren om genexpressie te kwantificeren. De beeldvormingsomstandigheden moeten gedurende het hele experiment (bijvoorbeeld verlichting, belichtingstijden en embryopositionering) worden gehandhaafd om de variabiliteit tussen metingen te verminderen. Een kritiek punt is om overvlekken van de monsters te voorkomen, omdat verschillen in kleuring tussen monsters kunnen worden gemaskeerd. Zo kon de afname van vegfa-expressie bij afwezigheid van Eto2 in Xenopus laevis embryo's30 alleen worden gedetecteerd door de kleuring gedurende een periode van 24 uur zorgvuldig te controleren. Zo is het een goede gewoonte om empirisch te bepalen adequate kleuring niveaus voor elk gen dat het beste vertegenwoordigen zijn expressie, zonder het bereiken van verzadiging. Overstaining verhoogt ook kunstmatig de intensiteit van de achtergrondpixel in de geconverteerde 8-bits grijswaardenafbeeldingen en scheeftrekken de kwantificeringsresultaten. In extreme gevallen kan het achtergrondniveau in embryonale weefsels hoger zijn dan het ISH-signaal in de geselecteerde ROI en moeten deze monsters van de analyse worden uitgesloten. Een soortgelijk verschijnsel werd waargenomen toen we de geschiktheid van de onbevlekte dooier testten op achtergrondcorrectie (figuur 4). Na inversie en conversie naar 8-bits worden de donkere pixels in het dooiergebied helderder dan het ISH-signaal in het embryo en maken de achtergrond gecorrigeerde waarden negatief. Vermijd dus het gebruik van de dooier voor achtergrondcorrectie. Het meten van het achtergrondsignaal in gepigmenteerde gebieden in het embryo (bijvoorbeeld de ogen of het rugdeel van de stam vanaf 26/28 pkf) zal de kwantificeringsresultaten eveneens scheeftrekken en ook worden vermeden. Er zijn protocollen beschikbaar voor het bleken van zebravisembryo's, voor of na ISH18 en het bleken van embryo's ouder dan 24 pk f voordat beeldvorming wordt aanbevolen.

Omdat deze methode is gebaseerd op het meten van de pixelintensiteit in een bepaald gebied tegen een achtergrondpixelintensiteit in een gelijkwaardig niet-gekleurd gebied, is het niet geschikt voor het kwantificeren van alomtegenwoordige of bijna alomtegenwoordig uitgedrukte genen zoals het is. In plaats daarvan is het zeer geschikt voor het meten van expressie van genen met een ruimtelijk beperkte verdeling waar een gebied voor het meten van de pixelintensiteit op de achtergrond gemakkelijk kan worden geïdentificeerd. Onze aanvullende analyse suggereert nu dat het gebruik van een kleiner gebied (3-4x kleiner) voor achtergrondcorrectie vergelijkbare resultaten oplevert als het gebruik van een gelijkwaardig gebied als dat van de ROI. Dit breidt de toepasbaarheid van de methode uit op genen uitgedrukt in bredere ruimtelijke domeinen (en dus grotere ROI's nodig voor intensiteitsmetingen), zolang men duidelijk ongekleurde gebieden van het embryo kan gebruiken voor achtergrondcorrectie.

Ten slotte stellen we voor dat de genotypering parallel of na de beeldkwantificatie wordt uitgevoerd om de bias van de onderzoeker te minimaliseren. Het vragen van een tweede experimentator om de kwantificering op geanonimiseerde monsters te herhalen en te vergelijken met de eerste reeks metingen zal ook helpen bij het verminderen van experimentatorbias. Als de te kwantificeren beelden afkomstig zijn van een vergelijking tussen behandelingen waarvoor geen genotype vereist is (bijvoorbeeld wild type vs chemische remmer of wild type vs. MO knockdown), moet de experimentator die de metingen uitvoert, worden verblind door de identiteit van de Monster.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen het personeel van Biomedical Services in Oxford en Birmingham bedanken voor een uitstekende zebravishouderij. T.D. werd gefinancierd door een Wellcome Trust Chromosoom en Ontwikkelingsbiologie PhD Scholarship (#WT102345/Z/13/Z). R.M. en M.K. werden gefinancierd door de British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) en zijn dankbaar voor hun genereuze steun. R.M. erkent de steun van het BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids)StarLabA1402-370096-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples
3 mL Pasteur pipettesAlpha LaboratoriesLW4114
Cavity slidesBrandBR475535-50EA
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0)Qimaging
Eppendorf Microloader tipsEppendorf10289651the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol
ExcelMicrosoft
F3000 Fiber Optic Cold Light SourcePhotonic
Fiji
GlycerolSigmaG5516-1L
Graphpad Prism 8.01GraphPad Software, Inc.we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)
HotSHOT alkaline lysis buffer25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12
HotSHOT neutralization bufferTris HCl 40 mM, pH 5
PBS (10X) pH 7.4Thermofisher70011044
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N)Nikon
ThermocyclerThermofisher

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).">Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  2. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).">Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
  3. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096(2018).">Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096(2018).
  4. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).">Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
  5. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813(2016).">Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813(2016).
  6. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533(2015).">Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533(2015).
  7. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).">Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
  8. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).">Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
  9. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).">Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
  10. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).">Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
  11. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).">Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
  12. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).">Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
  13. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).">Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
  15. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).">Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
  16. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).">Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  17. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193(2019).">Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193(2019).
  18. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).">Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
  19. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).">Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  20. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).">Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  21. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).">Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  22. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).">Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
  23. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000(2017).">Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000(2017).
  24. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780(2017).">El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780(2017).
  25. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).">Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  26. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).">Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  27. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).">El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  28. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).">Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
  29. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).">Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  30. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).">Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationZebrafish EmbryosGenotyping QuantificationImage Analysis FijiBackground CorrectionAlkaline Lysis BufferGlycerol SolutionPCR Tube TransferMean Pixel IntensityRegion Of Interest

Related Articles