Methodenartikel

Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst

DOI:

10.3791/59960

⸱

2 september 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel presenteren we het protocol dat wordt beschreven als High-Resolution smelt analyse (HRM) gebaseerde doel geïnduceerde lokale laesies in Genomes (TILLING). Deze methode maakt gebruik van fluorescentie veranderingen tijdens het smelten van de DNA-duplex en is geschikt voor screening met hoge doorvoer van zowel inbrengen/deletie (Indel) als single base substition (SBS).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doelwit geïnduceerde lokale laesies in Genomes (TILLING) is een strategie van reverse genetics voor de screening met hoge doorvoer van geïnduceerde mutaties. Het kantelsysteem heeft echter minder toepasbaarheid voor het inbrengen/verwijderen (Indel) detectie en traditionele TILLING heeft meer complexe stappen nodig, zoals CEL I Nuclease spijsvertering en gel elektroforese. Om de doorvoer-en selectie-efficiëntie te verbeteren, en om de screening van zowel indels als enkelvoudige basis substitions (SBSs) mogelijk te maken, wordt een nieuw TILLING-systeem op basis van hoge resolutie (HRM) ontwikkeld. Hier presenteren wij een gedetailleerd HRM-TILLING protocol en tonen de toepassing in de mutatie screening. Deze methode kan de mutaties van PCR-amplicons analyseren door de denaturatie van dubbel gestrande DNA bij hoge temperaturen te meten. De HRM-analyse wordt direct na de PCR uitgevoerd zonder verdere verwerking. Bovendien is een eenvoudige, veilige en snelle (SSF) DNA-extractiemethode geïntegreerd met HRM-TILLING om zowel indels als SBSs te identificeren. De eenvoud, robuustheid en hoge doorvoer maken het mogelijk nuttig voor mutatiescanning in rijst en andere gewassen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutanten zijn belangrijke genetische hulpbronnen voor het functionele genomics-onderzoek en de kweek van nieuwe rassen. Een voorwaartse genetica benadering (d.w.z. van Mutante selectie tot genklonen of variété ontwikkeling) was vroeger de belangrijkste en enige methode voor het gebruik van geïnduceerde mutaties ongeveer 20 jaar geleden. De ontwikkeling van een roman reverse genetics methode, TILLING (gericht op geïnduceerde lokale laesies in Genomes) door McCallum et al.1 opende een nieuw paradigma en het is sindsdien toegepast in een groot aantal dier-en plantensoorten2. TILLING is vooral nuttig voor fokeigenschappen die technisch moeilijk of kostbaar zijn om te bepalen (bijv. ziekte resistentie, mineraalgehalte).

TILLING werd oorspronkelijk ontwikkeld voor screening puntmutaties geïnduceerd door chemische mutagene agentia (bv. EMS1,3). Het omvat de volgende stappen: de oprichting van een TILLING populatie (s); DNA-bereiding en bundeling van individuele planten; PCR-versterking van doelwit DNA-fragment; heteroduplexen vorming door denaturatie en gloeien van PCR-amplicons en decolleté door CEL I Nuclease; en identificatie van mutant individuen en hun specifieke moleculaire laesies3,4. Deze methode is echter nog steeds relatief complex, tijdrovend en lage doorvoer. Om het efficiënter en met een hogere doorvoer te maken, zijn veel gemodificeerde kantel methoden ontwikkeld, zoals het verwijderen van de TILLING (de-Tilling) (tabel 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

De HRM-curve analyse, die is gebaseerd op fluorescentie veranderingen tijdens het smelten van de DNA-duplex, is een eenvoudige, kosteneffectieve en hoge doorvoer methode voor mutatie screening en genotypering13. HRM is al op grote schaal gebruikt in planten onderzoek, waaronder op HRM gebaseerde TILLING (HRM-TILLING) voor het screenen van SBS-mutaties geïnduceerd door EMS-mutagenese14. Hier presenteerden we gedetailleerde HRM-TILLING protocollen voor het screenen van mutaties (zowel Indel als SBS) geïnduceerd door gamma (γ) stralen in rijst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparaten

  1. Ontwikkeling van door de γ-stralen mutageen populaties
    1. Behandel ongeveer 20.000 gedroogde rijstzaden (met vochtgehalte van ca. 14%) van een japonica-rijst lijn (bijv. DS552) met 137CS-gammastralen bij 100 Gy (1 Gy/min) in een γ-bestralings faciliteit (bijv. Gamma-cel).
      Opmerking: zaden die voor de behandeling worden gebruikt, moeten een hoge levensvatbaarheid hebben (bijv. met een kiemkracht > 85%). De bestralings dosis voor Indica Rice kan worden verhoogd tot 150 Gy.
    2. Zaai de bestraalde zaden na ontkieming op een zaailing bed en transplantatie zaailingen individueel naar een rijstveld en groei in de M1 populatie.
      Opmerking: directe zaaien van M1 planten dun kan ook worden toegepast om arbeidskosten te besparen. Het voorkomen van overschrijding van M1 -planten met andere rijst rassen met behulp van fysische of biologische isolatie middelen.
    3. Bulk-oogst M2 zaden van de m1 planten, met 1-2 zaden van elke m1 paniek, om een M2 populatie te vormen.
      Opmerking: oogst in de praktijk en voor eenvoud alle zaden van M1 planten en na volledig mengen wordt een portie bemonsterd om een M2 populatie te vormen.
    4. Geniet van ongeveer 5.000 M2 zaden in water voor 24 (Indica Rice)-36 (japonica Rice) h bij kamertemperatuur. Laat de zaden dan ontkiemen bij 37 °C gedurende 2 dagen op vochtig filtreerpapier in Petri schalen.
      Opmerking: erkunnen meer M2 zaden worden ontkierd voor analyse om de kans op het identificeren van mutanten te vergroten.
    5. Plaats de gekiende zaden voor het zaaien van panelen met kleine gaatjes en kweek ze hydroponisch voor 3-4 weken in een cultuur oplossing aangepast van Yoshida et al.15 in een kas met een foto van 12 uur [overdag (30 ± 2) °c en nacht (24 ± 2) °c].
  2. Bemonstering van blad weefsels: Snijd één schijf (Φ ~ 2 mm) uit het volledig verlengde blad van elke zaaien op dezelfde plaats met behulp van een perforator.
  3. Bereiding van DNA-extractie oplossingen
    1. Buffer A: Voeg 2 mL 5 M NaOH en 10 mL van 20% tween 20 toe om het eindvolume van 50 mL te maken. Vers bereid buffer A vóór DNA-extractie.
    2. Buffer B: Voeg 20 mL 1 M Tris-HCl (pH 8,0) en 80 μL 0,5 M EDTA toe om een eindvolume van 100 mL te maken.
  4. PCR-primers
    1. Primers voor HRM-analyse: ontwerp primers voor versterking van de doel volgorde met behulp van software (bijv. primer Premier5) en synthetiseren door een commercieel bedrijf.
      Let op: omdat HRM minder toepasbaar is op de analyse van lange fragmenten, en dus de amplicons minder dan 400 BP moeten zijn. fragmenten met te hoge (> 75%) of te laag (< 25%) GC-inhoud is ook niet goed voor HRM-analyse.
    2. Primers voor kwaliteitscontrole: gebruik de 24 SSR-markers verdeeld over de 12 rijst chromosomen van Peng et al.16.

2. DNA-extractie

  1. Plaats 4 blad schijven in elke put van een 96-well PCR-plaat, voeg buffer A-oplossing toe (50 mL/well). Vries de plaat in a-80 °C vriezer gedurende 10 minuten.
  2. DeVries de plaat bij kamertemperatuur en inbroed vervolgens gedurende 10 minuten bij 95 °C.
  3. Voeg aan elke put 50 μL buffer B toe en meng goed door vortexing.
  4. Centrifugeer de plaat gedurende 1 minuut bij 1.500 x g. Het supernatant is klaar voor PCR.

3. PCR-versterking

  1. PCR-optimalisatie
    1. Voeg de volgende reagentia toe aan elke PCR-put: 1 μL DNA (het supernatant in stap 2,4), 5 μL van 2x Master Mix (met 2x PCR-buffer, 4 mmol/L MgCl2, 0,4 mmol/l 2 '-deoxyribonucleoside trifosfaten (Dntp's) en 50 U/ml Taq-DNA-polymerase, 0,2 μL elk van 10 μmol/L primers, en maak een laatste volume tot 10 μL met behulp van Nuclease vrij water.
    2. Gebruik het thermische blok met verloop mogelijkheid om de optimale gloeien temperatuur voor elk doel fragment te bepalen met behulp van het volgende PCR-programma: 5 min bij 94 °C, gevolgd door 40 cycli van 30 s bij 94 °C, 30 s bij 52-62 °C (gradiënt temperatuur) en 30 s bij 72 °C , met een eind verlenging bij 72 °C gedurende 8 minuten en een Hold bij 16 °C.
    3. Onderzoek amplicons op 1% agarose gels voor het bepalen van de optimale gloeien temperatuur.
      Opmerking: een optimale gloeien temperatuur moet specifieke versterking van het doel fragment mogelijk maken, zonder niet-specifieke amplificatie en primer dimerization.
  2. PCR voor HRM analyse
    Opmerking: HRM-compatibele platen en DNA van M2 zaailingen geëxtraheerd zoals beschreven in stap 2,4 worden gebruikt voor PCR.
    1. Voer PCRs uit in een eindvolume van 10 μL, met 1 μL DNA (supernatant), 5 μL 2-Master mengsel, 0,2 μL elk van 10 μmol/L-primers en 1 μL 10x fluorescentie kleurstof. In elke plaat zijn een wild type (WT) gepareerd monster en één negatieve (zonder DNA) controle.
    2. Voeg een druppel minerale olie toe aan elk goed om verdamping te voorkomen.
    3. Sluit de plaat af met een zelfklevende folie en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g .
    4. Voer de PCR uit met de geoptimaliseerde gloeien temperatuur.
      Opmerking: in enkele gevallen kan fluorescentie kleurstof de PCR-versterking beïnvloeden, vandaar dat de kleurstof wordt toegevoegd na voltooiing van de PCR. In dergelijke gevallen wordt de kleurstof in DNA-strengen verwerkt door post-PCR-denaturering en gloeien.

4. HRM scanning en mutatie bevestiging

  1. Verwijder de zelfklevende folie van de plaat en steek de plaat in een HRM-machine.
  2. Selecteer Nieuw uitvoeren in het menu bestand of druk op de knop uitvoeren boven aan het scherm.
  3. Geef de begin-en eindtemperatuur voor de smelt van 55 °C tot 95 °C op.
    Opmerking: na de eerste run kan het bereik van de smelttemperatuur voor een bepaald fragment worden bepaald; Vandaar dat de smelttemperatuur kan worden aangepast voor latere analyse van hetzelfde fragment om tijd te besparen.
  4. Selecteer samples voor een hoge resolutie smeltende analyse, sluit monsters uit die vergelijkbaar zijn met de negatieve controle.
  5. Normaliseer de smelt curves om dezelfde begin-en eind fluorescentie te hebben. Controleer visueel of de onderste min en lagere Max temperatuur cursors zich in een gebied van de curven bevinden.
  6. Houd de ∆ F (verschil van fluorescentie) niveau bij de standaardinstelling van 0,05.
  7. Selecteer de common versus-variant in de selectielijst normen en kies de normale gevoeligheid.
  8. Gebruik de WT als het besturingselement; monsters met een ∆ F -waarde van ≥ 0,05 van WT worden geacht de Mutante plant te bevatten.
  9. Identificatie en bevestiging van Mutante planten.
    1. Identificeer de vier planten, waarvan elke Mutant pool werd gemaakt.
    2. Extraheer DNA uit elk van deze planten met behulp van een CTAB-methode volgens allen et al.17 met enkele modificaties.
      Opmerking: DNase-Free RNase en NAAC worden niet gebruikt bij het uitpakken van DNA met behulp van de cTab-methode beschreven door allen et al.17, omdat de DNA-kwaliteit goed genoeg is voor verdere PCR-versterking. Stel het DNA in op een eindconcentratie van ~ 25 ng/μL na kwantificering met behulp van een spectrofotometer.
    3. Vergroot het doel fragment met behulp van PCR-primers en programmeer hetzelfde als voor HRM-analyse.
    4. Identificeer specifieke moleculaire laesies door Sanger-sequencing van de amplicons.
      Opmerking: zodra de PCR-versterking is voltooid, stuurt u de amplicons naar een bedrijf voor Sanger-sequencing. De moleculaire laesie kan worden geïdentificeerd door de sequenties tussen de M2 -plant en de WT te vergelijken.

5. kwaliteitscontrole van geselecteerde mutanten met moleculaire markers

  1. Voer PCR uit voor de 24 SSR-markers in een eindvolume van 10 μL met 25 ng genomisch DNA (geëxtraheerd met behulp van het CTAB-Protocol), 5 μL 2x Master Mix, 0,2 μL van elk van de 10 μM SSR-primers.
  2. Voer PCR uit met het volgende programma: 5 min bij 94 °C, gevolgd door 30 cycli van 30 sec. bij 94 °C, 30 sec. bij 55 °C en 30 sec. bij 72 °C, met een eind verlenging bij 72 °C gedurende 7 minuten.
  3. Scheid de amplicons op 8% polyacrylamidegels en onthul polymorfisme van versterkte fragmenten door zilver kleuring18.
  4. Vergelijk de SSR haplotypes van geselecteerde varianten en de WT.
    Opmerking: geïnduceerde mutanten hebben vaak SSR-haplotypes die identiek zijn aan hun WT, als meer dan één SSR-markers verschillend zijn tussen een variant en de WT, is de variant hoog waarschijnlijk een genetische verontreiniging (bijv. een mengsel of een gekruist plant) in plaats van een geïnduceerde Mutant18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HRM scanning en-analyse

In totaal werden 1.140 samengevoegde DNA-monsters van 4.560 M2 zaailingen geproduceerd en onderworpen aan PCR-amplificatie. Twee fragmenten met de grootte van 195 BP en 259 BP werden versterkt voor respectievelijk OsLCT1 en SPDT(tabel 2). De meeste monsters hadden smelt curves die niet significant verschillen van de WT (ΔF < 0,05). HRM-curven significant verschillend van de WT (ΔF > 0,05) werden gegroepeerd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TILLING is een krachtig reverse-genetisch hulpmiddel gebleken voor het identificeren van geïnduceerde mutaties voor genfunctionele analyse en gewas veredeling. Voor sommige eigenschappen die niet gemakkelijk worden waargenomen of bepaald, kan het KANTELEN met PCR-gebaseerde mutatie detectie met hoge doorvoer een nuttige methode zijn om mutanten voor verschillende genen te verkrijgen. De HRM-TILLING methode is gebruikt in EMS-mutageen populaties van tomaat12, tarwe11 en Grap...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door het National Key Research and Development Program van China (nr. 2016YFD0102103) en de National Natural Science Foundation of China (No. 31701394).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2× Taq plus PCR Master MixTiangen, ChinaKT201PCR buffer, dNTP en polymerase voor PCR-amplificatie
96-well plateBio-rad, AmerikaMSP-9651Specifieke plaat voor PCR in HRM-analyse
Mastercycler nexusEppendorf, Duitsland6333000073PCR-amplificatie
LightScannerIdaho Technology, VSLCSN-ASY-0011Voor fluorescentiemonsters en verwerking
CALL-IT 2.0Idaho Technology, VSVoor analyse van de fluorescentie verandering
EvaGreenBiotium, VS31000-TFluorescentiekleurstof van HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, VSND2000Voor DNA-kwantificering

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40(2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077(2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43(2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14(2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143(2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43(2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MutatiescreeningDNA extractiePCR optimalisatieHRM analysegelelektroforeseSanger sequencingrijsteeltenindel detectie

Gerelateerde artikelen