Genetische mapping van Thermotolerance verschillen tussen soorten Saccharomyces gist via genoom-brede wederzijdse Hemizygosity analyse

Samenvatting

Wederzijdse hemizygosity via sequencing (RH-SEQ) is een krachtige nieuwe methode om de genetische basis van een eigenschap verschil tussen soorten in kaart te worden. Pools van hemizygotes worden gegenereerd door transposon mutagenese en hun fitheid wordt bijgehouden door concurrerende groei met behulp van High-through sequencing. Analyse van de resulterende gegevens wijst genen aan die aan de eigenschap ten grondslag liggen.

Samenvatting

Een centraal doel van de moderne genetica is om te begrijpen hoe en waarom organismen in het wild verschillen in fenotype. Tot op heden is het veld grotendeels uitgebreid op de sterkte van koppelings-en koppelingsmethoden, die de relatie tussen DNA-sequentie varianten en fenotype over recombinant nageslacht van paringen tussen individuen van een soort traceren. Deze benaderingen, hoewel krachtig, zijn niet goed geschikt voor eigenschap verschillen tussen reproductief geïsoleerde soorten. Hier beschrijven we een nieuwe methode voor genoom-brede dissectie van natuurlijke eigenschap variatie die gemakkelijk kan worden toegepast op onverenigbare soorten. Onze strategie, RH-seq, is een Genome-brede implementatie van de wederzijdse hemizygote-test. We hebben het aangewend om de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de opvallende hoge temperatuur groei van de gist Saccharomyces cerevisiae ten opzichte van zijn zuster soorten S. paradoxus. RH-SEQ maakt gebruik van transposon-mutagenese om een pool van wederzijdse hemizygoten te creëren, die vervolgens worden gevolgd door een hoge-temperatuur competitie via een hoge doorvoer volgorde. Onze RH-SEQ workflow zoals hier uiteengezet biedt een rigoureuze, onbevooroordeelde manier om oude, complexe eigenschappen in de ontluikende gist clade te ontleden, met het voorbehoud dat resource-intensieve Deep sequencing nodig is om genomische dekking voor genetische mapping te garanderen. Als sequencing kosten dalen, deze aanpak houdt grote belofte voor toekomstig gebruik over eukaryoten.

Inleiding

Sinds het begin van het veld, het is een belangrijker doel in de genetica om te begrijpen van de mechanistische basis van variatie tussen wilde individuen. Als we loci in kaart plaatsen die aan een kenmerk van belang zijn gekoppeld, kunnen de opkomende genen onmiddellijk worden gebruikt als doelstellingen voor diagnostiek en drugs, en kunnen ze licht werpen op de principes van evolutie. De industriestandaard in de richting van dit doel is om te testen op een relatie tussen genotype en fenotype over een populatie via koppeling of vereniging¹. Krachtig als deze benaderingen zijn, ze hebben een belangrijke beperking-ze vertrouwen op grote panelen ....

Protocol

1. bereiding van het piggyBac-bevattende plasmide voor transformatie

1. Streak uit naar enkele kolonies de E. coli stam harkotteren plasmide pJR487 op een lb + carbenicillin agar plaat. Incuberen gedurende 1 nacht bij 37 °C of totdat er enkele kolonies verschijnen.
   Opmerking: een beschrijving van hoe plasmide pJR487 werd gekloond, vindt u in ons vorige werk³.
2. Inoculeren 1 L LB + carbenicillin op 100 μg/mL met een enkele kolonie E. coli met pJR487 in een glazen kolf van 2 liter. Groei 's nachts bij 37 °C met schudden bij 200 rpm tot verzadigd (OD₆₀₀ ≥ 1,0).
3. Reinig plasmide DNA uit de cul....

Resultaten

We gedekt s. cerevisiae en s. paradoxus om een steriele hybride te vormen, die we aan transposon mutagenese onderworpen hebben. Elke gemutageniseerde kloon was een hemizygote, een diploïde hybride waarin één allel van één gen verstoord is (Figuur 1a, Figuur 2). We namen de hemizygoten tegen elkaar op door groei bij 39 °C en, in een afzonderlijk experiment als controle, op 28 °C (Figuur 1b), en we g.......

Discussie

De voordelen van de RH-SEQ ten opzichte van eerdere statistische-genetische methoden zijn meerdere malen. In tegenstelling tot de koppeling-en associatie analyse, biedt de RH-SEQ een single-gen mapping-resolutie; als zodanig, het zal waarschijnlijk van belangrijk nut zijn, zelfs in studies van eigenschap variatie over individuen van een bepaalde soort, evenals interspecifieke verschillen. Ook, eerdere pogingen tot genoom-brede wederzijdse hemizygosity analyse gebruikt verzamelingen van gendeletie mutanten, waarvan sommig.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-2 plasmid Gigaprep kits	Zymo Research	D4204	Het aantal benodigde kits hangt af van hoe efficiënt uw voorbereidingen in elk kit zijn. Deze kit wordt geleverd met 5 afzonderlijke plasmid voorbereidingskolommen. Laat 1 L van verzadigde E. coli-kweek door elke voorbereidingskolom lopen, omdat het gebruik van meer dan 1 L per kolom kan leiden tot verstopping van het voorbereidingsfilter, wat resulteert in een lage opbrengst en DNA van slechte kwaliteit.
10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl en 10 mM EDTA)	Alle	N/A	Filter steriliseer door een 0,22 μm filter voor gebruik.
1M LiOAc	Alle	N/A	Filter steriliseer door een 0,22 μm filter voor gebruik.
300 mg/mL Geneticin (G418)	Gibco	11811023
52% polyethyleenglycol (PEG) 3350	Sigma	1546547	Los op in water en filter steriliseer door een 0,22 μm filter voor gebruik. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer
Autogeklaafde LB vloeibare bouillon	BD Difco	244620	Maak LB vloeibare bouillon met uw poeder van elk merk, en milliQ water. Autoclaveer het voor gebruik.
Carbenicilline stock in water (100 mg/mL)	Alle	N/A	Filter steriliseer door een 0,22 μm filter voor gebruik.
Complete synthetische agar platen (24,1cm x 24,1cm) met 5-fluoroorotinezuur (5-FOA) [0,2% drop-out aminozuurmix zonder uracil of giststikstofbasis (YNB), 0,005% uracil, 2% D-glucose, 0,67% YNB zonder aminozuren, 0,075% 5-FOA)	5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco	5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919
DMSO	Alle	N/A
E. coli-stam met pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-bevattende plasmide)	N/A	N/A	Vraag het aan Brem lab.
Hybride giststam JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)	N/A	N/A	Vraag het aan Brem lab.
Illumina Hiseq 2500			gebruikt voor SE-150 reads
Grote schudkweekkasten met variabele temperatuurinstellingen	Alle	N/A
LB + carbenicilline agar platen (100 μg/mL)	Agar: BD Difco	Agar: 214010	Maak LB agar platen zoals normaal en voeg carbenicilline toe tot 100 μg/mL voor het drogen.
Nanodrop spectrofotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit Fluorimeter	Thermo Scientific	Q33240
Salmensaadon DNA	Invitrogen	15632011
Waterbad op 39°C	Alle	N/A
Gist schimmel gDNA prep kit	Zymo Research	D6005
Gist pepton dextrose (YPD) vloeibare media	BD Difco	Peptone: 211677, Gist Extract: 212750	Voeg filter gesteriliseerde D-glucose toe tot 2% na het autoclaveren.
YPD + G418 agar platen (300 μg/mL)	Agar: BD Difco	Agar: 214010	Maak YPD agar platen zoals normaal en voeg G418 toe tot 300 μg/mL voor het drogen.
YPD agar platen	Agar: BD Difco	Agar: 214010