Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans

9.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59978

⸱

5 juli 2019

 ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Melbourne VIC 3800, Australia.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.

Samenvatting

Het definiëren van de cellulaire mechanismen onderliggende ziekte is essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe Therapeutics. Een strategie die vaak wordt gebruikt om deze mechanismen te ontrafelen, is het introduceren van mutaties in kandidaatgenen en het kwalitatief beschrijven van veranderingen in de morfologie van weefsels en cellulaire organellen. Kwalitatieve beschrijvingen kunnen echter geen subtiele fenotypische verschillen vertonen, kunnen de fenotypische variaties tussen individuen in een populatie verkeerd voorstellen en worden vaak subjectief beoordeeld. Hier worden kwantitatieve benaderingen beschreven om de morfologie van weefsels en organellen in de nematode Caenorhabditis elegans te bestuderen met behulp van laser scanning confocale microscopie in combinatie met commercieel verkrijgbare bio-beeld Verwerkingssoftware. Een kwantitatieve analyse van fenotypes die de synaps integriteit beïnvloeden (grootte en geïntegreerde fluorescentie niveaus), spierontwikkeling (spier Celgrootte en myosine filament lengte), en mitochondriale morfologie (circulariteit en grootte) werd uitgevoerd om te begrijpen de effecten van genetische mutaties op deze cellulaire structuren. Deze kwantitatieve benaderingen zijn niet beperkt tot de hier beschreven toepassingen, omdat ze gemakkelijk kunnen worden gebruikt om de morfologie van andere weefsels en organellen in de nematode, evenals in andere model organismen, te kwantificeerbare beoordeling.

Inleiding

De nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) wordt steeds meer gebruikt als een modelsysteem om de biologische en moleculaire processen die betrokken zijn bij menselijke ziekten te ontdekken. Een volwassen nematode heeft een lichaamslengte van iets meer dan 1 mm en kan een grote broed van maximaal 300 eieren produceren1. Na het uitkomen, C. elegans vereisen slechts 3-4 dagen om volwassenheid te bereiken, en leven voor ongeveer 2 tot 3 weken2. Vanwege het gemak van het kweken, is C. elegans momenteel een van de meest gewilde in vivo diermodellen voor het uitvoeren van kosteneffectieve, snelle geneesmiddelen screening om therapieën voor menselijke ziekten te identificeren. Bovendien, de genetische instandhouding, goed gedefinieerde gedrags paradigma's, transparante lichaam voor fluorescentie of lichte microscopie, en het gemak van genetische manipulatie maken de studie van cellulaire en moleculaire gevolgen van genetische mutaties gemakkelijk te Behaal bare 3. de C. elegans genoom deelt ongeveer 60-80% orthologie met menselijke genen, en ongeveer 40% van die genen staat bekend als ziekte-gerelateerd. Sommige van de menselijke ziekten die zijn gemodelleerd en bestudeerd in C. elegans omvatten neurodegeneratieve aandoeningen (de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, Amyotrofische laterale sclerose, Charcot-Marie-Tooth ziekte), spier-geassocieerde ziekten ( Spierdystrofie van Duchenne), en metabole ziekten (hyperglycemie)2,4. Bij de meeste menselijke aandoeningen, ziekte-geïnduceerde cellulaire en organel lokalisatie en morfologische veranderingen optreden, die gemakkelijk kunnen worden geëvalueerd in de nematode model.

Fluorescerende markers zijn op grote schaal gebruikt om weefsels en organellen te labelen voor dynamische visualisatie onder de Microscoop. In C. eleganshebben conventionele methoden die morfologische onregelmatigheden als gevolg van genetische mutaties beoordelen, zich echter grotendeels gebaseerd op visuele beschrijvingen. Hoewel kwalitatieve evaluaties een breder bereik van fenotypische beschrijvingen kunnen omvatten (synaptische morfologie, GFP-clumping, specifieke axonale vorm, dikte van de spiervezels, enz.) en een vogel beeld van de morfologische veranderingen bieden, zijn ze minder goed geschikt voor kleine variaties in verschillende groepen vergelijken. Bovendien zijn kwalitatieve evaluaties gebaseerd op een visuele, subjectieve evaluatie, die kan leiden tot overmatige of onderschattingen van morfologische afwijkingen. Ten slotte kunnen kwalitatieve waarnemingen ook sterk variëren tussen individuen, waardoor problemen ontstaan met gegevensreplicatie.

In de afgelopen jaren zijn een aantal gebruiksvriendelijke, gemakkelijk beschikbare computeralgoritmen ontwikkeld die afbeeldingen kwantitatief kunnen analyseren. Echter, het gebruik van dergelijke beeldanalyse software voor sommige morfologische studies, vooral met betrekking tot de spieren van het lichaam van de muur en de mitochondriën, in C. elegans onderzoek is achtergebleven achter. Ter verbetering van de onderliggende structurele analyse in C. elegans, sommige van de gemakkelijk beschikbare, open-source beeldanalyse software werden getrialed om kwantitatief te vergelijken de effecten van genetische mutaties op de spier mitochondriën, Body Wall spier en synaptische Morfologie. Deze experimentele procedures schetsen in detail hoe deze programma's (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan worden gebruikt voor het evalueren van veranderingen in de synaptische grootte en synaptische eiwit lokalisatie, lichaam muur spier gebied en vezellengte, en mitochondriale grootte en circulariteit als gevolg van genetische mutaties in de nematode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. groei en onderhoud van C. elegans stammen

  1. Zaad nematode groei medium (NGM, Zie tabel van de materialen) agar-platen met 300 μL van de langzaam groeiende E. coli stam OP50 in een laminaire flowkast.
  2. Laat de NGM agar-platen in de laminaire flowkast drogen.
    Opmerking: bij afwezigheid van een laminaire flowkast kunnen platen op de Bank worden achtergelaten, maar ze zijn gevoeliger voor verontreiniging.
  3. Breng ten minste 20 dieren over naar elk van de twee OP50-geseede NGM-agar-platen om te werken. Er zijn twee belangrijke manieren om dieren over te brengen.
    1. Plukken: Til de dieren voorzichtig op met een warmtegesteriliseerde pick. Deze methode is effectief voor het selecteren van individuele of meervoudige dieren van een agar-plaat. Het hebben van een kleine Schraap van bacteriën bij de tip bij het plukken helpt de overdracht.
      Let op: een pick is gemaakt van een klein stukje platina draad van ongeveer 4 cm lang dat is ingebed in een glazen pipet, waarbij de draad uiteinde afgevlakt is om ' speer achtig ' te zijn. Verwarm de pick tussen het plukken om kruisbesmetting te voorkomen.
    2. Chunking: met behulp van een gesteriliseerde spatel, snijd een klein vierkant van agar met de dieren van een plaat en ondersteboven overgebracht naar een nieuwe plaat.
      OPMERKINGEN: deze methode is over het algemeen nuttig voor het overbrengen van grote aantallen wormen en om verontreiniging van platen te verwijderen door middel van meerdere rondes van niet-verontreinigde agar te verdelen. Vermijd kruisbesmetting door het Flaming van de spatel voor een paar seconden en onderdompelen van de spatel in 100% ethanol tussen transfers. Overbrengen van uitgehongerd platen wordt niet aanbevolen als verhongering en overbevolking kan invloed hebben op de gezondheid en morfologie van cellulaire en subcellulaire structuren.
  4. Houd de wormen bij standaard groei temperatuur (20 °C). Om een continue toevoer van goed gevoede wormen te garanderen, breng je de wormen om de 2 tot 3 dagen over naar nieuwe OP50-geseede platen.

2. leeftijd-synchroniseren C. elegans

  1. Onderhoud de wormen op 3-4 NGM-platen totdat de populatie druk is, maar niet uitgehongerd.
  2. Was de wormen voorzichtig van de NGM plaat met M9 oplossing. De eieren blijven op de plaat omdat ze vasthouden aan de E. coli OP50. Herhaal dit met vier extra wasstappen om alle gearceerde dieren te verwijderen.
  3. Laat de wormen uitkomen voor 40 min.
  4. Voeg 1-2 mL M9-oplossing aan de plaat toe en zwenk voorzichtig om recent uitgekomen wormen los te maken.
  5. Verzamel de M9-oplossing met recent geboren wormen en breng de oplossing met wormen over naar een nieuwe NGM-plaat.
  6. Laat de M9-oplossing verdampen door de NGM-plaat aan de lucht bloot te stellen. Doe dit naast een open vlam om besmetting van de NGM-plaat te voorkomen.
  7. Groei de wormen voor 27 uur bij 20 °C om ontwikkeling in de derde fase van de larvale (L3) mogelijk te maken. Voor gesynchroniseerde 3-daagse oude volwassen dieren worden de wormen geplukt in larvale Stage 4 en worden ze nog eens 3 dagen lang gekweekt om een 3-daags oud volwassen podium te bereiken.

3. voorbereiding van dia's voorbeeld vorming

  1. Bereid 3-4% g/v agarose voorraad in een magnetron veilige fles (3-4 g in 100 mL ultrapuur water).
    Opmerking: agar kan worden gebruikt in plaats van agarose bij dezelfde concentratie.
  2. Smelt de agarose voorzichtig in een microgolfoven, zorg dat u niet overkookt, totdat alle agarose oplost (heldere oplossing). Houd de oplossing bij 70 °C om stollen te voorkomen.
    Opmerking: agarose voorraad kan meerdere malen worden gebruikt. Opwarmen voor gebruik als de agarose is gestomgd.
  3. Gebruik een Pasteur-pipet en plaats een druppel gesmolten agarose op een Microscoop-dia.
    Opmerking: Vermijd luchtbellen in de druppel agar omdat deze de integriteit van de pad verstoren.
  4. Druk de agarose-druppel onmiddellijk met een andere Microscoop-dia omlaag, waarbij de agarose zachtjes wordt afgeplat tot een pad tussen de twee dia's.
    Opmerking: eventuele overgebleven bubbels moeten in dit stadium worden verwijderd. Zo niet, dan moeten er nieuwe dia's worden gemaakt, want dieren kunnen gemakkelijk vast komen te zitten in de bubbels. Vermijd overloop van agar aan de zijkant wanneer u op de glijbaan drukt.
  5. Laat de agarose 1 minuut drogen.
  6. Scheid de twee glaasjes voorzichtig om beschadiging van de agarose te voorkomen, terwijl het gestijde pad op een van de dia's wordt verlaten.
    Opmerking: Dia's met agarose pads moeten altijd vers worden bereid vlak voor het experiment, omdat ze kunnen uitdrogen. Zorg ervoor dat het agarose-pad een consistente dikte heeft. Er mogen geen luchtbellen of scheuren in de pad zijn, omdat dit de beeldvorming kan verstoren.
  7. Voeg een kleine druppel (5-10 μL) van 0,05% tetramisole hydrochloride (anestheticum) toe aan het midden van het agarose pad.
  8. Gebruik warmtegesteriliseerde pick en breng snel ongeveer 10 – 15 dieren over van de voorraad plaat naar de verdovings druppel voordat de oplossing uitdroogt. Vermijd het overdragen van teveel OP50 bacteriën omdat dit de oplossing troebel maakt, wat kan interfereren met beeldvorming.
    Opmerking: als de verdovings oplossing uitdroogt tijdens het plukken, pipetteer dan gewoon een tweede druppel van 0,05% tetramisole hydrochloride op de dieren. De dieren hebben de neiging om op hun laterale zijde in de anesthetische oplossing te leggen.
  9. Breng een dekslip aan door deze net boven de agarose pad te plaatsen en zachtjes neer te zetten. Dit voorkomt de vorming van bubbels. Druk niet op de Afdeklijst omdat dit de dieren kan verpletteren.
  10. Label de dia's met de naam van de stam.

4. beoordeling van de synaptische morfologie

Opmerking: de effecten van MEC-17 overexpressie op de synaps integriteit in de posterieure laterale microtubulus (PLM) Touch receptor neuronen werden bestudeerd door het kwantificeren van de synaptische grootte en lokalisatie met behulp van lijn Scanning confocale microscopie. De PLM-neuronen (inclusief de synaptische regio's) werden gevisualiseerd met behulp van de uIs115 (pmec-17:: tagrfp) transgen (stam: TU40655) en de synaptische regio werd specifiek gelabeld met jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) (stam: NM664 6) . Deze studie werd uitgevoerd in gesynchroniseerde L3 niet-transgene en transgene dieren van de extrachromosomale MEC-17 overexpressie stam BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37; uIs115]7. Een volledige lijst van stammen die in deze studie worden gebruikt, is opgenomen in tabel 1.

  1. Confocale beeldvorming van touch receptor neuron synapsen
    1. Om het beeld van de synaptische regio's, gebruik maken van een lijn Scanning confocale Microscoop gekoppeld aan een 488 nm en 552 nm optisch gepompt halfgeleider diode laser en uitgerust met beeld Capture software.
    2. Zoek de wormen met de laagste vergroting.
    3. Wanneer de dieren met succes zijn gelegen, overschakelen naar een 40X vergroting en dompel medium (in deze studie: een 40X/1.10 HC PL APO CS2 multi-immersive doelstelling met water onderdompeling werd gebruikt).
    4. Visualiseer de synaptische regio door de fluor Foren te opwinden met een 488 nm Laser (2% vermogen) voor de GFP de en 552 nm (1% vermogen) voor de tagrfp de.
    5. Bepaal het optimale x-en y-frame om de hele synaptische-regio vast te leggen. Zorg ervoor dat u rekening houden met de optimale pixelgrootte bij het selecteren van het frame. In deze studie werd een consistente pixelgrootte van 56 nm verkregen.
    6. Leg beelden vast met behulp van een hybride foto-detector en stel de winsten in om overmatige blootstelling van de fluor Foren te voorkomen (100% voor 488 nm excitatie en 15% voor 552 nm excitatie).
    7. Verzamel z-stack-afbeeldingen om de hele SYNAPS te bedekken, met behulp van de optimale z-stapgrootte, afhankelijk van de specifieke doelstelling die wordt gebruikt. In deze studie werd een optimale z-Step grootte van 0,211 nm gebruikt.
      Let op: Zorg ervoor dat alle beelden onder strenge voorwaarden worden genomen om een geïntegreerde fluorescentie kwantificering en vergelijking mogelijk te maken. Dit kan worden gedaan door microscopie-parameters identiek te houden voor alle vastgelegde afbeeldingen (d.w.z. laser-en detector-instellingen, pixelgrootte, scansnelheid en optimale z-stapgrootte). Optimale instellingen zijn afhankelijk van het doel en kunnen worden berekend met behulp van toegankelijke bioinformatica Programma's, zoals de Nyquist Calculator (https://svi.nl/NyquistCalculator). Label afbeeldingen systematisch, dit zal nuttig zijn bij het gebruik van bioinformatica software die zal organiseren en verwerken van bestanden op basis van bestandsnaam.
  2. Kwantificering van de synaptische regio
    1. Als u de synaptische-regio wilt analyseren, exporteert u afbeeldingen als TIFF-bestanden. Op Java gebaseerde beeldverwerkingssoftware zoals ImageJ kan worden gebruikt (in deze studie werd de macro voor MRI-afbeeldings conversie in ImageJ gebruikt).
    2. De grootte en de geïntegreerde fluorescentie intensiteitsniveaus van synapsen werden gemeten vanaf de som-intensiteit van de verkregen z-stacks met CellProfiler-3.1.5. Laad de afbeeldingen in de CellProfiler 3.1.5-software. Indien nodig kunnen afbeeldingen worden gefilterd op basis van afbeeldings bestandsnamen.
    3. Stel de modulenaam en type in. U desgewenst de metagegevens uit het label van de afbeelding extraheren om deze dienovereenkomstig te ordenen.
    4. Bepaal de synaptische regio met de hand definitie van deze regio met behulp van de diffuse tagRFP uitgedrukt uit de uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene. Dit kan worden gedaan door het toevoegen van de betreffende module aan de CellProfiler-3.1.5 pijplijn.
    5. Als u de grootte en fluorescentie van de met de hand gedefinieerde SYNAPS wilt meten, voegt u de intensiteits module Measure - object grootte en vorm en meet object toe aan de pijplijn.
    6. Bereken de relatieve geïntegreerde fluorescentie intensiteit door de reken module berekenen toe te voegen. Verdeel de geïntegreerde intensiteits eenheden van jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) door de geïntegreerde eenheden die zijn verkregen voor UIs115 (pmec-17:: tagrfp).
    7. Metingen en berekeningen exporteren.

5. kwantificerende Body wand spierstructuur

  1. Fluorescentie beeldvorming van lichaam wand spierstructuur
    1. Verkrijgen van een stam (bijvoorbeeld RW1596) het dragen van de transgen stEx30 (pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006))8, die etiketten myosin vezels met GFP.
      Opmerking: de introductie van het transgen in dieren kan worden bereikt door een stam van belang te kruisen met dieren die het transgen al uitdrukken, of het DNA van micro injecteren in de distale arm van de Gonade. Het ' rollende ' fenotype geïnduceerd door rol-6 mutatie in dit transgen vergemakkelijkt de visualisatie van de spieren. De spieren van het lichaam van de muur lopen langs de rugzijde en de ventrale zijden die normaalgesproken niet van zicht zijn in wild-type dieren, omdat ze meestal op een van hun laterale zijden liggen. De rol-6 (su1006) allel induceert het draaien van de dieren, waardoor sommige spieren cellen voorbeeld vorming worden blootgesteld.
    2. Afbeelding van de dieren met behulp van een fluorescentiemicroscoop in combinatie met een hoge resolutie opgeladen gekoppelde apparaat camera (CCD), 40X objectief of hoger, GFP filter en acquisitie software.
    3. Pas de belichtingstijd en verlichtings intensiteit aan om oververzadigde beelden te voorkomen.
    4. Vastleggen en opslaan van beelden van spieren (400x vergroting) van een deel van het dier met ten minste één volledig zichtbaar schuine spier cel. Vermijd regio's met een enkele spiercel die onvolledig is of secties die niet scherp zijn. Ook afbeeldingen uitsluiten van extreme anterieure en posterieure gebieden, en regio's grenzend aan de vulva.
      Opmerking: als het dier geen enkele zichtbare volledige spiercel heeft, schuift u de dekglaasje zachtjes om het dier te draaien om een volledige cel bloot te leggen.
  2. Meting van het spiercel gebied
    1. Open de afbeelding in Fiji software9 (versie 2.0.0 werd gebruikt in deze studie).
    2. Gebruik de veelhoek selectie om zorgvuldig rond een enkele schuine spiercel te traceren. Pas de lijn van de veelhoek aan het einde aan door de anker stip te verslepen om de tracering te verbeteren.
    3. Ga naar het tabblad analyseren boven aan de software en klik op meten om het gebied van de selectie te berekenen. Er wordt een afzonderlijke resultatentabel met het gebied en andere metingen weergegeven. Als de oppervlakte-meting ontbreekt in de resultatentabel, gaat u naar metingen instellen onder het tabblad analyseren en controleert u of het vak gebied is aangevinkt. Schakel ook andere metingen uit die niet nodig zijn.
    4. Voor spiercellen met een ontaarde/ontbrekende regio, Traceer de ontbrekende regio met de veelhoek selectiegereedschap en klik opnieuw meten . Als er meerdere hiaten in de cel zijn, traceert u elke tussenruimte afzonderlijk.
    5. Bereken de verhouding tussen het gap-gebied en de hele enkelvoudige spiercel. Een hoge ratio duidt op een hogere mate van spier degeneratie als gevolg van grote gaten in de cel. Als er geen ontbrekende gebieden, zoals vaak gezien in wild-type dieren, de verhouding zou worden berekend als nul.
      Opmerking: als een controle, Score ook voor spierstructuur gebreken visueel en vergelijk resultaten met de kwantitatieve meting. Dit is vooral handig als de stam voor de eerste keer in het lab wordt bestudeerd. Voor fenotypische scores, de dieren als defect beoordelen of niet-defect op basis van de integriteit van de filamenten. Bijvoorbeeld, dieren met verlies van verschillende filament striations, GFP clumping, of gaten in spiercellen als gevolg van structurele afbraak, zou worden gescoord als defect.
  3. Segmentatie en kwantificering van myosin Fiber lengte
    1. Indien nodig, eerst bestanden converteren naar. TIF met behulp van Fiji of een ander softwarepakket. Sla de TIFF-bestanden op de gewenste locatie op.
    2. Open ilastik10 (gratis software, versie 1.3.2 kan worden gedownload van https://www.ilastik.org/).
    3. Kies eenmaal in ilastik pixel classificatie onder Nieuw project maken . De software zal vragen om het project te redden. Wijzig de naam van het project en sla het op een gewenste locatie op.
      Opmerking: een nieuw project hoeft slechts eenmaal te worden gemaakt. Volgende segmentatie kan worden gedaan met behulp van hetzelfde project. Om dezelfde projectinstellingen te gebruiken, ga naar project tab bovenaan en klik op Open project om het projectbestand te openen.
    4. Er moeten 5 tabbladen in het linkerdeelvenster zijn (invoergegevens, selectie van functies, training, voorspelling export en batch verwerking). Klik op het tabblad invoer gegevens op nieuwe toevoegen en voeg vervolgens afzonderlijke afbeeldingen toe. Direct het pop-upvenster naar de map met de TIFF-bestanden en selecteer de afbeelding te openen.
    5. Klik in het volgende tabblad (functie selectie) op functies selecteren om alle pixel functies te selecteren, aangegeven door groene aangevinkte vakjes. De pixel selectie in deze stap wordt gebruikt om de verschillende klassen van pixels in de volgende stap te onderscheiden.
      Opmerking: de selectie van pixels functies is afhankelijk van de afbeeldingsresolutie. Vandaar dat de ontwikkel ontwikkelaars suggereren om alle of zoveel mogelijk functies te selecteren, als de verwerkingskracht en tijd vergunning.
    6. Het volgende deelvenster training staat de classificatie van verschillende objectklassen toe op basis van pixels. In dit geval zijn de twee klassen de individuele GFP-uitdrukken myosin filamenten en ongewenste achtergrond of vervaagde randen. Klik op Label toevoegen om het eerste label te hebben. Een aantal filamenten om de klassificatiertraining te beginnen.
      Opmerking: als u dubbelklikt op het label, u naamswijzigingen (bijvoorbeeld de naam van ' label 1 ' naar ' filament ') wijzigen. Als u dubbelklikt op het gekleurde vak, kunnen kleuren voor tekenen en waarschijnlijkheids displays worden gewijzigd. De standaardgrootte van het penseel is 1, hoewel de grootte kan worden verhoogd tot 61. Als de verkeerde pixel is getekend, gebruikt u gewoon het gereedschap Gummetje om de tekening te verwijderen. Toetsenbord besturingselementen (-) en (Shift +) kunnen worden gebruikt om respectievelijk in-en uitzoomen op afbeelding in te zoomen. Pijltjestoetsen worden gebruikt om door de afbeelding te navigeren.
    7. Voeg een tweede label toe en wijzig de naam in achtergrond. Scrawl over ongewenste achtergronden en spaties tussen de filamenten.
    8. Klik op Live Update en zorg ervoor dat de classificatie is uitgevoerd door de software correct. Voeg meer bels toe en Verfijn de training indien nodig.
      Opmerking: het is belangrijk om in deze stap een oogje te houden op samengevoegde vezels en wazige randen (zoals lichaams lijn). Verbeter de voorspelling hier zoveel mogelijk om de nauwkeurigheid van de metingen te verhogen. De nauwkeurigheid van de voorspelling is ook afhankelijk van de afbeeldingsresolutie, omdat pixels in afbeeldingen van lage kwaliteit moeilijker uit elkaar kunnen worden geplagen. Het is ook optioneel, maar aanbevolen om de filter methode uit te voeren in de functie functies voorstellen naast Live Update Control.
    9. Zodra training classificatie is voldoende uitgevoerd, gaat u naar voor Spelling exporteren deelvenster. Klik op Kies afbeeldings instellingen exporteren met waarschijnlijkheden als de bron.
    10. Gebruik de volgende instellingen. Cut-out subregio x en y aangevinkt, en c unticked. De begin-en stop waarden voor c moeten respectievelijk 0 en 1 zijn. Tik en converteer gegevenstype in transformaties naar niet-ondertekende 8-bits, vink aan renormalize [min, Max] en gebruik de standaardwaarden. Wijzig de indeling van de video van het uitvoerbestand naar PNG en wijzig de naam van het bestand en de map naar wens.
    11. Sluit het venster Exportinstellingen en exporteer de specifieke afbeelding die zojuist is gesegmenteerd.
    12. Open de opgeslagen PNG-afbeelding in Fiji-software. De afbeelding moet in zwart-wit worden weergegeven.
    13. Pas de drempelwaarde van de afbeelding aan met de standaardinstellingen.
    14. Pas de skeletonisatie plugin toe (Skeletonize 2D/3D, en analyseer vervolgens het skelet). Er wordt een afzonderlijke tabel met resultaten weergegeven, inclusief de lengte van de vertakking. De lengte van de vertakking staat voor de vezellengte. Andere gegevens in de resultaten kunnen ook nuttig zijn, zoals de Euclidische afstand.
      Opmerking: laat vezels met lengtes van 0 μm of meer dan 250 μm weg, omdat deze maten niet fysiologisch mogelijk zijn.

6. kwantificerende mitochondriale morfologie

Opmerking: voor de kwantificering van de mitochondriale morfologie gebruikte deze studie de BXN038 -stam met de uIs115 (pmec-17:: tagrfp)5 transgen om de PLM-neuronen en jsIs609 te visualiseren (pmec-4:: MLS:: GFP)11 om mitochondriën specifiek binnen de PLM-neuronen te visualiseren. Deze studie werd uitgevoerd in gesynchroniseerde 3-daagse oude volwassen wormen, maar is met succes uitgevoerd op andere leeftijden, evenals in andere weefsels7.

  1. Fluorescentie beeldvorming van mitochondriën binnen de PLM-neuronen
    1. Voor het meten van de grootte en vormveranderingen van de mitochondriën binnen de PLM-neuronen, visualiseer zowel de achtergrond neuron en mitochondriën met behulp van fluorescerende transgenes.
    2. Om de PLM-neuron te beeld, gebruik een confocale Microscoop gekoppeld aan een 488 nm en 552 nm optisch gepompt halfgeleider diode laser en uitgerust met beeld Capture software.
    3. Afbeelding van de worm volgens de stappen 4.1.1-4.1.4 hierboven, waardoor niet-verzagende blootstellings condities.
    4. Om het hele neuron te visualiseren, kan een tegelafbeelding nodig zijn. Om dit te bereiken, gebruikt u software met een tegel scan optie om een marker in een hoek van het neuron te lokaliseren en neer te zetten en vervolgens het tegenovergestelde uiteinde te vinden en de andere marker te laten vallen. De software berekent het optimale aantal tegels dat nodig is om het vereiste gebied vast te leggen.
      Opmerking: om de scantijd te verminderen, is het vaak gemakkelijker om neuronen te lokaliseren die één enkel vlak volgen, wat resulteert in minder tegels.
    5. Als u de tegel wilt koppelen met een Z-stack, stelt u de onderste en bovenste limieten in voordat u de tegel scan start en zorgt u ervoor dat de optimale segmentgrootte is ingesteld.
    6. Zorg ervoor dat de resolutie is geoptimaliseerd, als segmentatie zal worden verfijnder met hogere resoluties (hier, een resolutie van 3224 x 3224 pixels werd gebruikt).
      Opmerking: terwijl het uIs115 (pmec-17:: tagrfp) transgen wordt gebruikt om de PLM te markeren en de camera met succes te positioneren, hoeft het niet noodzakelijkerwijs te worden afgebeeld als gevolg van een lichte achtergrond fluorescentie waargenomen bij de jsIs609 (pmec-4:: MLS:: GFP) transgen binnen de PLM axon zelf. Zo kan de scan-en beeldvormings tijd worden verminderd door het 552 nm-filter uit het experiment te verwijderen.
  2. Object segmentatie met SQUASSH
    1. Converteer afbeeldingsbestanden naar . TIFF -afbeeldingen en Genereer maximale intensiteits projecties van Z-stacks met behulp van Fiji imaging software. Afbeeldingen bijsnijden tot de minimale grootte, terwijl het nog steeds het volledige neuron bevat om de computationele belasting te verminderen en achtergrondruis te verminderen.
      Opmerking: voor de representatieve resultaten, alleen mitochondriën binnen de lange axonale processen werden overwogen, zodat de cel lichaam en de mitochondriën binnen werden uitgesloten van elke afbeelding.
    2. Gebruik de mozaïek Suite SQUASSH macro voor ImageJ, voer Split Bregman segmentatie12 uit op de maximale projecties. Een gedetailleerde handleiding voor de installatie en toepassing van deze macro is beschikbaar op de mozaïek website (http://mosaic.mpi-cbg.de/) en beschreven door Rizk et al. 201413. Het proces van beeldsegmentatie wordt hieronder kort beschreven.
      Let op: deze segmentatie identificeert objecten (in dit geval individuele mitochondrion) over een drempel van fluorescentie intensiteit, waardoor nauwkeurige meting van elke afzonderlijke objecten grootte en vorm mogelijk is.
    3. Achtergrondruis uit een afbeelding verwijderen met de methode Rolling Ball, waarin een door de gebruiker gedefinieerd venster over de afbeelding beweegt, waarbij de lokale achtergrond intensiteit wordt bepaald door de meest voorkomende intensiteit in elk venster. Dit corrigeert ongelijke achtergrond intensiteiten.
    4. Gebruik objectdetectie om ruwweg gebieden van de afbeelding te vinden die objecten (mitochondriën) bevatten die van belang zijn, gebaseerd op de intensiteit van de fluorescentie en het aantal pixels. De parameters die deze stap regelen zijn regularisatie en minimale object intensiteit.
      Opmerking: regularisatie wordt gebruikt om te voorkomen dat kleine intensiteit, ruis veroorzaakte pieken worden gesegmenteerd en de minimale drempel voor object intensiteit helpt bij het definiëren van de subcellulaire organellen van achtergrond weefsel fluorescentie. Dit zijn de belangrijkste twee parameters die worden gemanipuleerd om een optimale segmentatie van mitochondriën vinden, en het optimalisatieproces neigt te zijn trial and error van verschillende parameters voor een testbeeld, gevolgd door handmatige inspectie.
    5. Gebruik de software om de lokale achtergrond intensiteiten rond elk object te schatten om optimale segmentatie te helpen berekenen.
    6. Meet individuele objecten voor grootte, omtrek, lengte via pixel nummer, evenals signaalintensiteit en x/y locatie op de afbeelding. Voor het berekenen van metingen in grootte (nm), factor in de pixelgrootte van de oorspronkelijke afbeelding.
      Opmerking: voor elk experiment moeten eerst optimale parameters worden berekend. Om de nauwkeurigheid van segmentatie te garanderen, is het raadzaam om een SQUASSH-analyse uit te voeren op een testafbeelding en handmatig de nauwkeurigheid van segmentatie te inspecteren. De macro biedt uitvoerbestanden met de afzonderlijke objecten die zijn geïdentificeerd op de oorspronkelijke afbeelding, en het inspecteren van deze nauwkeurig en het aanpassen van parameters aan te passen zal zorgen voor een nauwkeurige segmentatie. De gedefinieerde parameters moeten vervolgens worden gebruikt voor het gehele experiment voor vergelijkbaarheid. De parameters die worden gebruikt voor de representatieve resultaten zijn opgenomen in tabel 2.
    7. Open Fiji-of ImageJ-analyse software, navigeer naar de mozaïek-macro container en open het SQUASSH-menu.
      1. Open het submenu achtergrond aftrekken en zorg ervoor dat achtergrond verwijderen ? is aangevinkt. De standaardinstelling voor venstergrootte is 10.
      2. Stel de gewenste regularisatie en minimale intensiteit van het object in, kanaal 1 waarden om objecten het beste te identificeren en te segmenteren (zie stap 6.2.4). Kanaal 2 -waarden zijn niet nodig voor objecten die zijn gemarkeerd met een enkel transgene.
      3. Klik op de schatting PSF van objectieve eigenschappen om de puntspreidingsfunctie te schatten op basis van de kenmerken van de Microscoop. Dit helpt de segmentatie van nauw gelegen objecten door de administratieve verwerking van de invloed van elke pixel op de naburige pixel.
        Opmerking: subpixel segmentatie is niet gebruikt in dit experiment vanwege de toegenomen belasting van de computer verwerkingskracht. Celmaskers werden ook niet gebruikt omdat de axon gemakkelijk gedefinieerd is. Deze instellingen zijn nuttig voor complexere weefsels en voor het definiëren van objecten in een cel op basis van cel.
      4. Voor Visualisatieopties zorgt u ervoor dat object contouren worden gecontroleerd en object-en afbeeldingskenmerken worden opgeslagen . Voor gebruik later in grafische en statistische software, zorg ervoor dat het juiste aantal voorwaarden zijn input.
    8. Zoek de map met . TIFF -afbeeldingen en voer de macro uit. Dit proces kan worden uitgevoerd op een afzonderlijke installatiekopie of op een batch afbeeldingen per genotype in een map. Uitvoerbestanden bevinden zich in de map samen met de originele afbeeldingen.
  3. Analyse en afmetingen van de vorm
    1. Gebruik de uitvoer van SQUASSH om een gespecificeerd object data . CSV -bestand te bieden, dat elk afzonderlijk object per rij bevat, inclusief de metingen zoals hierboven beschreven.
      Opmerking: Hoewel dit macro procesobject metingen automatiseert, is het altijd belangrijk om de uitvoer afbeeldingen handmatig te controleren na SQUASSH segmentatie om ervoor te zorgen dat de macro de mitochondriën correct heeft geïdentificeerd.
    2. Om de vorm van elke mitochondriën te analyseren, gebruikt u een tweedimensionale maat voor sphericity, Circulariteit, om de afwijking van het object van een perfecte cirkel te schatten.
      Opmerking: Circulariteit is een functie van gebied en omtrek (Circulariteit = (4 x π) x (gebied/omtrek2) waarbij 1 = een perfecte cirkel en 0 = een rechte lijn. Dit kan worden bereikt met behulp van een formule in grafische en statistische software.
    3. Om te bepalen van de variantie in grootte en vorm over de pool van de mitochondriën, bereken histogrammen en een ingerichte Gaussiaanse distributie met behulp van grafische en statistische software, met bakken van 0,2 μm voor mitochondriale grootte en 0,05 voor mitochondriale circulariteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

C. elegans is een ideaal modelorganisme voor het bestuderen van morfologie van verschillende weefsels en organellen vanwege zijn eenvoud, bekende celafstamming, transparantie en beschikbare gereedschappen. Hier bieden we kwantitatieve benaderingen voor het bestuderen van organellen (bijv. mitochondriën) en weefsels, waaronder synapsen en spieren met behulp van Live fluorescentie Imaging en gratis bio-beeld Verwerkingssoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Morfologische variaties zijn vaak beoordeeld via manuele telling van merkbare verschillen of met behulp van arbitraire drempels om defecten te bepalen in vergelijking met een wild type fenotype. Meer recentelijk zijn echter kwantitatieve methoden gebruikt voor vergelijkende studies van morfologie om op onpartijdige wijze veranderingen op cellulair en subcellulair niveau nauwkeurig te meten en te beschrijven. De mogelijkheid om subtiele maar biologisch relevante verschillen tussen fenotypes te identificeren is een krachti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken leden van het Neumann Lab voor waardevolle discussies en inbreng. Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure programma's (P40 OD010440). De auteurs danken worm Base voor zijn rijkdom aan informatie over C. elegans, en erkennen Monash micro imaging, Monash University, voor de levering van instrumentatie, opleiding en technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door de CMTAA Research Grants (2015 en 2018), en NHMRC project Grants 1101974 en 1099690 toegekend aan B.N.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agar-agarMerck1.01614.1000
AgaroseInvitrogen16500-500
Confocal microscopeLeicaTCS SP8Inverted platform
Fluorescence microscopeCarl Zeiss AGZeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1Thermo scientifiqueMENCS22221GP
Glass coverslips #1.5Zeiss474030-9000-000Made by SCHOTT
Glass slidesThermo scientifiqueMENS41104A/40
Light LEDSchottKL 300 LED
Stereo MicroscopeOlympusSZ51
Tryptone (Peptone from casein)Merck107213Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast ExtractMerck103753Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)Merck107214Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
AgarSigmaA1296Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
CholesterolSigmaC8667-25GIngredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chlorideMerck102382Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfateMerck105886Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphateMerck105101Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphateMerck104873Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphateMerck106586Ingredients for M9 buffer
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphateMerck104873Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfateMerck105886Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipetteCorningCLS7095D5X-200EA
Petri dishesCorningCLS430589-500EA
Platinum wireSigma267201-2G
SpatulaMet-app2616
Tetramisole hydrochlorideSigmaL9756-5G

Referenties

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  3. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
  4. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
  5. Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
  6. Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
  7. Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
  11. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  12. Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
  13. Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
  14. Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
  15. Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
  16. Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
  17. Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
  18. Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
  19. Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
  20. Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584(2019).
  21. Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
  22. Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
  23. Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
  24. Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
  25. Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Confocale microscopiekwantitatieve analysemorfologische beoordelingsynaptische integriteitspierontwikkelingmitochondriale morfologiesoftware voor beeldbewerkingCellProfilerFiji-software
Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.