Hier gepresenteerd is een stap-voor-stap procedure om acute longschade in muizen induceren door directe intratracheal lipopolysaccharide instillatie en uit te voeren FACS analyse van bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage vloeistof, en longweefsel. Minimale invasieve, eenvoudige handling, goede reproduceerbaarheid, en titratie van de ziekte ernst zijn voordelen van deze aanpak.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inducerende acute Long blessure bij muizen door directe Intratracheal lipopolysaccharide instillatie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Luchtweg toediening van lipopolysaccharide (LPS) is een veel voorkomende manier om longontsteking en acute longschade (ALI) studie in kleine diermodellen. Verschillende benaderingen zijn beschreven, zoals de inhalatie van vernevelde LP'S en nasale of intratracheal instillatie. Het gepresenteerde protocol beschrijft een gedetailleerde stap-voor-stap procedure om ALI te induceren in muizen door directe intratracheal LPS instillatie en uit te voeren FACS analyse van bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof, en longweefsel. Na intraperitoneale sedatie, is de luchtpijp blootgesteld en LPS wordt toegediend via een 22 G veneuze katheter. Een robuuste en reproduceerbare inflammatoire reactie met leukocyten invasie, upregulering van proinflammatoire cytokines, en verstoring van de alveolo-capillaire barrière wordt geïnduceerd binnen enkele uren tot dagen, afhankelijk van de gebruikte LPS dosering. De inzameling van bloedsteekproeven, BAL vloeistof, en Long het oogsten, evenals de verwerking voor FACS analyse, worden beschreven in detail in het protocol. Hoewel het gebruik van de steriele LPS niet geschikt is om farmacologische interventies bij besmettelijke ziekten te bestuderen, biedt de beschreven aanpak minimale invasieve, eenvoudige handling en goede reproduceerbaarheid om mechanistische immunologische vragen te beantwoorden. Bovendien, dosis titratie, alsmede het gebruik van alternatieve LP'S preparaten of muis stammen kunnen modulatie van de klinische effecten, die kunnen vertonen verschillende graden van ALI ernst of vroege versus late begin van de ziektesymptomen.
Inleiding
Experimentele diermodellen zijn onmisbaar in fundamenteel immuun onderzoek. Toediening van hele bacteriën of microbiële componenten is vaak gebruikt in kleine diermodellen om lokale of systemische ontsteking te induceren1. Lipopolysaccharide (LPS, of bacteriële endotoxine) is een component van de celwand en het Oppervlakteantigeen van gram-negatieve bacteriën (b.v., Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., of Legionella spp.). De thermostable en grote molecule (molecuulgewicht 1-4 x 106 kDa) bestaat uit een lipide moiety (lipide a), kerngebied (oligosaccharide), en een o-polysaccharide (of o-antigeen). Lipide A, met zijn hydrofobe vetzu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit dierlijke protocol werd goedgekeurd door de lokale Commissie voor dierlijke zorg (LANUV, Recklinghausen, Duitsland; Protocol nr. 84-02.04.2015) en werd uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van de richtlijnen van de gezondheid voor het gebruik van levende dieren (de publicatie van NIH Nr. 85-23, herziene versie van 1996).
1. ALI inductie
- Gebruik volwassen C57BL/6 muizen op leeftijden van ongeveer 10-12 weken. Huis de dieren in individueel geventileerde kooien met gratis toegang tot water en standaard knaagdier Chow. Het is echter mogelijk om deze aanpak op jongere dieren en met andere muizenstammen uit te voeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De beschreven aanpak voor het induceren van ALI in muizen werd gevalideerd door de beoordeling van cytokine-expressie, Neutrofiele granulocyt infiltratie, en alveolo-capillaire barrière verstoring 24 h en 72 h na LPS instillatie. PBS-geïnjecteerde dieren diende als controle. Intratracheal LPS toediening geïnduceerde een robuuste Long proinflammatoire respons. De uitdrukking van TNF-α in longweefsel was beduidend upgereguleerd, het bereiken van een aanhoudende en meer dan 50-voudige toename ten opzichte van de controledie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Minimale invasieve, eenvoudige behandeling, en een goede reproduceerbaarheid zijn de belangrijkste kenmerken van de gepresenteerde aanpak om ALI te induceren in een klein knaagdier model. Het gebruik van LPS in plaats van hele bacteriën in diermodellen heeft voordelen. Het is een stabiele en zuivere verbinding en kan in gelyofiliseerde vorm tot gebruik worden opgeslagen. Het is een krachtige stimulans voor aangeboren immuunsysteem reacties via de TLR4 pathway, en de biologische activiteit kan gemakkelijk worden gekwantif.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Jan kleiner en Susanne Schulz bedanken voor het verlenen van technische ondersteuning. De auteurs erkennen de uitstekende ondersteuning van de flow Cytometry core Facility aan de medische faculteit van de Universiteit van Bonn. De auteurs kregen geen financiering van een externe organisatie. Een deel van de gegevens in de resultaten sectie en afgebeeld in Figuur 3 is reeds getoond in een vorige publicatie8.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 ml spuiten | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml spuiten | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 muizen, vrouwelijk, 10 - 12 weken oud | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collageenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), steriele | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), zonder calciumchloride en magnesiumchloride, steriele | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS buizen, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland | 551579 | |
| Fetaal kalfs serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Pincet | Fine Science Tools, Heidelberg, Duitsland | 11049-10 | |
| Isofluraan | Baxter, Unterschleißheim, Duitsland | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Duitsland | ||
| Lipopolysacchariden (LPS) van Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Gezuiverde rat Anti-muis CD16/CD32 (muis BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Rode bloedcel lyse buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, met L-glutamine en natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Schaar | Fine Science Tools, Heidelberg, Duitsland | 14060-09 | |
| Natriumazid (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring schaar | Fine Science Tools, Heidelberg, Duitsland | 15018-10 | |
| Weefselpincet | Fine Science Tools, Heidelberg, Duitsland | 11021-12 | |
| Buizen | Eppendorf, Hamburg, Duitsland | 30125150 | |
| Veneuze katheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Duitsland | 4268091B | |
| Xylazin hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Duitsland |
Referenties
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
