Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromagrafische Diagnostische Test voor Resource-Limited Settings met verdere moleculaire toepassingen

Samenvatting

We presenteren een compleet protocol voor postmortem diagnose van dierlijke hondsdolheid onder veldomstandigheden met behulp van een snelle immunochromatografische diagnostische test (RIDT), van hersenbiopsie bemonstering tot uiteindelijke interpretatie. We beschrijven ook verdere toepassingen met behulp van het apparaat voor moleculaire analyse en virale genotypering.

Samenvatting

Functionele rabiësbewakingssystemen zijn van cruciaal belang om betrouwbare gegevens te verstrekken en de politieke betrokkenheid te vergroten die nodig is voor ziektebestrijding. Tot op heden moeten dieren die als rabiës-positief worden beschouwd, met behulp van klassieke of moleculaire laboratoriummethoden aan een postmortembevestiging worden onderworpen. De meeste endemische gebieden bevinden zich echter in lage- en middeninkomenslanden waar de diagnose van hondsdolheid van dierenroop beperkt is tot centrale veterinaire laboratoria. Een slechte beschikbaarheid van bewakingsinfrastructuur leidt tot ernstige onderrapportage van ziekten uit afgelegen gebieden. Verschillende diagnostische protocollen die een lage technische expertise zijn onlangs ontwikkeld, die de mogelijkheid bieden om rabiës diagnose vast te stellen in gedecentraliseerde laboratoria. We presenteren hier een compleet protocol voor de diagnose van dierlijke hondsdolheid met behulp van een snelle immunochromatografische diagnostische test (RIDT), van hersenbiopsie bemonstering tot de uiteindelijke interpretatie. We voltooien het protocol door een verder gebruik van het apparaat voor moleculaire analyse en virale genotypering te beschrijven. RIDT detecteert gemakkelijk rabiësvirus en andere lyssavirussen in hersenmonsters. Het principe van dergelijke tests is eenvoudig: hersenmateriaal wordt toegepast op een teststrip waar gouden geconjugeerde antilichamen specifiek binden aan rabiësantigenen. De antigeen-antilichaamcomplexen binden zich verder aan vaste antilichamen op de testlijn, wat resulteert in een duidelijk zichtbare paarse lijn. Het virus wordt geïnactiveerd in de teststrip, maar viraal RNA kan vervolgens worden geëxtraheerd. Hierdoor kan de teststrip, in plaats van het besmettelijke hersenmonster, veilig en gemakkelijk naar een uitgerust laboratorium worden gestuurd voor bevestiging en moleculaire typering. Op basis van een wijziging van het protocol van de fabrikant, vonden we een verhoogde testgevoeligheid, tot 98% in vergelijking met de gouden standaard referentiemethode, de directe immunofluorescentie antilichaam test. De voordelen van de test zijn talrijk: snel, gebruiksvriendelijk, goedkoop en geen vereiste voor laboratoriuminfrastructuur, zoals microscopie of koudeketencompliance. RIDT's vormen een nuttig alternatief voor gebieden waar referentiediagnosemethoden niet beschikbaar zijn.

Inleiding

Hondenrabië is de belangrijkste oorzaak van menselijke hondsdolheid, wereldwijd verantwoordelijk voor ongeveer 59.000 menselijke sterfgevallen per jaar, bijna allemaal in lage- en middeninkomenslanden (LMC's) in Azië en Afrika¹. De belangrijkste etiologische agent is een neurotrope hondshond-geassocieerde klassieke rabiës virus (RABV, familie Rhabdoviridae, geslacht Lyssavirus, soort Hondsdolheid lyssavirus). Andere rabiësgerelateerde lyssavirussen, die voornamelijk circuleren bij vleermuissoorten, veroorzaken echter ook ziekte^2,3. In de getroffen regio's worden ziektebewaking en -bestrijding vaak belemmerd door een laag politiek engagement dat waarschijnlijk het gevolg is van een gebrek aan betrouwbare gegevens^4,5,6. Een van de redenen voor de onderrapportage van de ziekte is het ontbreken van laboratoriumdiagnose, deels als gevolg van beperkte toegang tot uitgeruste laboratoria en opgeleid personeel, alsmede de moeilijkheden bij de verzending van de specimens. Laboratoriumdiagnose is noodzakelijk om gevallen van hondsdolheid te bevestigen en bovendien de genetische karakterisering van de betrokken stammen mogelijk te maken, waardoor inzicht wordt verheldert over de overdracht van virussen op^regionaalniveau 4^,5,7.

De huidige gouden normen voor postmortem rabiës diagnose, goedgekeurd door zowel de World Health Organization (WHO) en de World Organization for Animal Health (OIE), zijn de directe fluorescerende antilichaam test (DFAT), de directe snelle immunohistochemie test (DRIT) en moleculaire methoden (bijvoorbeeld, omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR))^4,8. De juiste toepassing in LMC's blijft echter beperkt als gevolg van ontoereikende laboratoriumfaciliteiten met inconsistente stroomvoorziening, ongekoeld monstertransport en het ontbreken van een kwaliteitsmanagementsysteem. Omdat de diagnose van hondsdolheid van dieren wordt meestal alleen uitgevoerd in centrale veterinaire laboratoria in LMC's, weerspiegelen de bestaande bewakingsgegevens voornamelijk de rabiëssituatie in stedelijke gebieden.

Recent ontwikkelde diagnostische alternatieven voor weinig technologie bieden mogelijkheden om rabiësdiagnose in afgelegen gebieden vast te stellen en gedecentraliseerde laboratoria voor rabiës^4,8,9. De snelle immunochromatografische diagnostische test (RIDT) is een laterale stroomtest op basis van immunochromatografie met behulp van gouden geconjugeerde detectorantilichamen en is een veelbelovend rabiësdiagnostisch instrument^10,11,12,13. Het principe is eenvoudig: na verdunning wordt hersenmateriaal gemengd in de meegeleverde buffer en worden enkele druppels aangebracht op de teststrip waar goud geconjugeerde monoklonale antilichamen specifiek binden aan rabiësantigenen, voornamelijk de nucleoproteïnen (figuur 1). De antigeen-antilichaamcomplexen ondergaan vervolgens zijdelingse stroommigratie, die zich aan de testlijn (T-lijn) binden aan vaste antilichamen tegen rabiësantigenen, wat resulteert in een duidelijk zichtbare paarse lijn. De resterende gouden geconjugeerde antilichamen die niet gebonden zijn aan rabiësantigenen blijven migreren en zich tot het membraan vastzetten door middel van extra targetingantilichamen, wat resulteert in een duidelijk zichtbare paarse regel (C-lijn).

De one-step, low cost methode is snel, zeer eenvoudig en vereist geen dure apparatuur of speciale opslagomstandigheden. Met wijziging van het fabrieksprotocol om de verdunningsstap te elimineren, zijn bijna alle apparatuur en reagentia die nodig zijn om de test uit te voeren opgenomen in de kit¹⁴. Het resultaat wordt gelezen na 5-10 minuten zonder microscoop. Dit is een groot voordeel ten opzichte van de DFAT-test, die een fluorescentiemicroscoop en immunofluorescentieconjugaat vereist, samen met gekoeld transport en monsteropslag. Zelfs de DRIT-test, die met een lichtmicroscoop kan worden uitgevoerd, vereist een doorlopende koudeketen om de anti-rabiësantilichamen op te slaan, die ook nog niet commercieel verkrijgbaar zijn. In vergelijking met de DRIT vereist het RIDT geen giftige chemicaliën, een bijzonder voordeel in landen waar de afvalverwijdering slecht gereguleerd is. De snelle test is minder tijdrovend met veel gemakkelijker interpretatie in vergelijking met de gouden standaard tests DFAT en DRIT. Dit maakt het mogelijk om ter plaatse te testen door personeel met beperkte technische expertise.

Op basis van deze testeigenschappen wordt een snelle diagnose van verdachte dieren in afgelegen gebieden haalbaar, waardoor de implementatie van profylaxe na blootstelling (PEP) voor blootgestelde mensen zo snel mogelijk wordt vergemakkelijkt. Bovendien is het vervoer op afstand van rabiësmonsters niet nodig, wat resulteert in een betere monsterkwaliteit op het moment van het testen. De resultaten die met de RIDT-tests zijn verkregen, moeten momenteel echter worden bevestigd met behulp van een referentiediagnosetest zoals DFAT of DRIT.

RIDT-technieken voor de detectie van RABV en andere lyssavirussen zijn geëvalueerd. Een van de eerste studies werd uitgevoerd door Koreaanse onderzoekers in 2007¹⁰. Vergeleken met de DFAT-methode vertoonde de RIDT in 51 dierproeven en 4 RABV-isolaten een gevoeligheid en specificiteit van respectievelijk 91,7% en 100%. Deze resultaten werden later bevestigd met 110 dierlijke hersenmonsters uit Korea, met gevoeligheid en specificiteit, in vergelijking met DFAT, van 95% en 98,9%, respectievelijk¹⁵. Meer recent beoordeelden andere studies de prestaties van deze RIDT met behulp van virus isolaten en/of geïnfecteerde hersenmonsters van verschillende dieren met verschillende geografische oorsprong. Een panel van 21 monsters, waaronder Afrikaanse RABV en andere Afrikaanse lyssavirussen (Duvenhage virus (DUVV), Lagos bat virus (LBV) en Mokola virus (MOKV)), werden met succes gedetecteerd, met een gevoeligheid van 100% in vergelijking met de DFAT¹⁶. Vergelijkbare hoge gevoeligheid (96,5%) en specificiteit (100%) waarden werden verkregen uit een panel van 115 hersenmonsters uit Ethiopië¹⁷. Een andere studie evalueerde Europese RABV-isolaten, twee andere Europese lyssavirussen (Europees vleermuislyssavirus type 1 (EBLV-1) en type 2 (EBLV-2)), en het Australische vleermuislyssavirus (ABLV)¹⁸. Op basis van analyse van 172 dierlijk hersenmonsters had de RIDT-kit 88,3% gevoeligheid en 100% specificiteit ten opzichte van DFAT, en de drie rabiësgerelateerde lyssavirussen werden met succes gedetecteerd. In deze studie, sommige van de valse negatieve resultaten kwam uit hersenmonsters opgeslagen in glycerol buffer, wat suggereert dat onjuiste glycerol verwijdering beïnvloed capillaire stroom of antilichaam binding. Een recente analyse van 43 klinische monsters van Australische vleermuizen bevestigde eerdere testresultaten, met volledige overeenstemming met DFAT¹⁹. Twee studies werden uitgevoerd in India met behulp van de RIDT op een beperkt aantal klinische monsters (11 en 34 monsters). In vergelijking met DFAT lag de gevoeligheid tussen 85,7% en 91,7% en was de specificiteit 100%^20,21. Een andere evaluatie van deze kit met behulp van 80 dierlijke hersenen monsters uit Afrika, Europa en het Midden-Oosten verkregen volledige overeenstemming met DFAT voor specificiteit (100%) maar een hogere gevoeligheid (96,9%) ten opzichte van de vorige studies²². In een recente interlaboratoriumvergelijking van deze RIDT uitgevoerd in 22 verschillende laboratoria met behulp van een paneel van 10 monsters, bedroeg de totale concordantie 99,5%²³.

Slechts één recente multicentrische studie toonde onbevredigende totale RIDT-prestaties²⁴. Monsters van drie verschillende datasets werden getest en leverden variabele gevoeligheids- en specificiteitswaarden in vergelijking met DFAT. Zo gaven gevoeligheid en specificiteit verkregen met het eerste paneel (n=51) en het tweede paneel (n=31) van monsters van proefgeïreerde dieren, allemaal getest in laboratorium A, een gevoeligheid van respectievelijk 16% en 43%, terwijl de specificiteit voor beide 100% was. Omgekeerd vormden de resultaten van het derde paneel (n=30) van door laboratorium B geanalyseerde veldklinische monsters een volledige overeenstemming met de resultaten van DFAT, die verder bijna volledig werd bevestigd door laboratorium A (85% gevoeligheid en 100% specificiteit). Batch-to-batch variatie werd voorgesteld als een mogelijke verklaring voor de fluctuerende relatief lage gevoeligheid met RIDT²⁴.

Tegelijkertijd voerde een andere studie een soortgelijk validatieproces uit van het hierboven beschreven RIDT, met een wijziging van het door de fabrikant aanbevolen protocol¹⁴. De preverdunningsstap (1:10) in PBS werd weggelaten tijdens de bereiding van het hersenmateriaal. Op basis van dit eenvoudiger gewijzigde protocol verkregen de auteurs gevoeligheid en specificiteit van respectievelijk 95,3% en 93,3%, vergeleken met DFAT door onder laboratoriumomstandigheden een dataset te testen van 73 dierlijke hersenmonsters, die natuurlijk of experimenteel besmet zijn met verschillende RABV-stammen. De studie presenteerde de eerste evaluatie van deze RIDT in een veldomgeving (Tsjaad, Afrika). In 48 klinische hersenmonsters waren gevoeligheid en specificiteit respectievelijk 94,4% en 100%. De discrepanties tussen DFAT en RIDT waren te wijten aan vals-positieve resultaten met DFAT, bepaald na bevestiging met RT-PCR. Toen deze resultaten werden verwijderd, was er volledige overeenstemming, en het toonde aan dat de RIDT betrouwbaarder was dat DFAT onder deze veldomstandigheden¹⁴. Er werd geen batch-to-batch variatie waargenomen met behulp van het gewijzigde protocol. Toen het gewijzigde protocol werd toegepast op een klein aantal van de DFAT/ RIDT divergerende monsters (n=8) in de studie van Eggerbauer et al.²⁴, werden ze allemaal concordant bevonden (100% gevoeligheid).

Een ander groot voordeel van de RIDT is secundair gebruik voor het detecteren van viraal RNA dat op de strip is bevestigd met behulp van moleculaire technieken (zoals RT-PCR) en het daaropvolgende genotyping^14,24. Na een extractiestap demonstreerden Léchenne et al.¹⁴ viraal RNA dat op het anigenapparaatmembraan was bevestigd met RT-PCR met 86,3% gevoeligheid in een paneel van 51 monsters (waaronder 18 monsters die bij omgevingstemperatuur vanuit Tsjaad werden getest en verzonden). Vervolgens was genotyping mogelijk in 93% van de 14 geteste monsters. Sanger sequencing van PCR amplicons van ten minste 500 nucleotiden in lengte werden gebruikt. Naast RABV-isolaten detecteerde de test vier andere lyssavirussoorten, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 en Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), tijdens een volledig concordante internationale interlaboratoriumtest¹⁴. De gevoeligheid van virale RNA-detectie was nog hoger (100%) in de studie van Eggerbauer et al., op basis van laboratoriummonsters onderzoek²⁴. Deze laatste studie toonde ook aan dat de buffer die wordt gebruikt in de RIDT-kit het virus heeft geïnactiveerd. Hierdoor kunnen de apparaten gemakkelijk worden verzonden, bij omgevingstemperatuur zonder specifieke bioveiligheidsmaatregelen voor referentielaboratoria, voor moleculaire bevestiging en genotyping.

Op basis van de eerdere evaluaties bieden RIDT-tools tal van voordelen voor gebruik in veldinstellingen, vooral wanneer de referentiediagnosetechnieken niet beschikbaar zijn. Deze test kent echter ook enkele beperkingen, met name een lage gevoeligheid van antigeendetectie^14,24. De test is van toepassing op monsters die grote hoeveelheden virale antigenen bevatten, zoals hersenmonsters. Het is echter niet geschikt voor andere monsters zoals speeksel of andere lichaamsvloeistoffen. Een ander nadeel is de kosten van het apparaat (ongeveer 5-10 euro in Europa), dat is minder duur in vergelijking met de kosten van het uitvoeren van DFAT, RT-PCR of DRIT, maar die nog steeds hoog blijft voor LMC's. De toekomstige ontwikkeling en validatie van soortgelijke RIDT's van andere bedrijven zou echter kunnen leiden tot een prijsdaling. Een studie gemeld batch-to-batch variaties. Hoewel niet gemeld door anderen, moeten echter strenge kwaliteitscontroles worden uitgevoerd bij het testen van een nieuwe batch, zoals voor elk reagens dat wordt gebruikt in een kwaliteitsbeheeromgeving. Het gebruik van het gewijzigde protocol is niet gewijzigd bij het gebruik van verschillende batches¹⁴. Op één studie na bleek dat de gevoeligheid van RDIT hoog was in vergelijking met DFAT (ongeveer 90%-95%). Omdat hondsdolheid altijd fataal is, wordt het nog steeds sterk aanbevolen om negatieve resultaten met RDIT te bevestigen met behulp van een referentiediagnosetest zoals DFAT, DRIT of RT-PCR¹⁴.

In dit manuscript presenteren we een compleet protocol voor de diagnose van dierlijke rabiës op basis van een voorbeeld van een gecommercialiseerde RIDT, van de verzameling van hersenmonsters tot de toepassing van een gewijzigd protocol in vergelijking met de aanbevelingen van de fabrikant (die eerder¹⁴jaar werden gevalideerd) en de daaropvolgende moleculaire analyse. Dit protocol werd vele malen toegepast en gevalideerd onder veldomstandigheden in West- en Centraal-Afrika, waar de RIDT routinematig werd gebruikt voor de diagnose van hondsdolheid naast de DFAT-test. We demonstreren bovendien een tweede toepassing voor het apparaat, in laboratoriumomgevingen, voor extractie en detectie met behulp van RT-PCR van viraal RNA dat op het apparaat is bevestigd.

Protocol

1. Monsterverzameling via de foramen magnum (occipital route)²⁵

LET OP: Deze techniek kan worden geïmplementeerd onder laboratoriumomstandigheden of in veldinstellingen. Monsters moeten zo spoedig mogelijk na de dood van het vermoedelijke dier worden verwerkt of bij koele temperatuur worden bewaard (gekoeld of bevroren, indien mogelijk), om ontbinding te voorkomen die van invloed kan zijn op de resultaten. Net als bij andere referentietechnieken op basis van lyssavirusantigensdetectie zoals DFAT en DRIT, mogen ontbonden monsters niet worden getest omdat het het resultaat kan beïnvloeden (risico op vals negatief resultaat).

LET OP: Alle monsters moeten als potentieel besmettelijk worden beschouwd. Veiligheidsvoorschriften en -procedures moeten strikt worden nageleefd, zelfs in veldinstellingen⁴. Draag in het bijzonder passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder masker, bril, handschoenen en een labjas. Gebruik het juiste ontsmettingsmiddel voor materiaal- en monsterdecontaminaties (bijvoorbeeld natriumhypochloriet met aanbevolen fabrikantverdunningen, 70% alcohol - ethanol of isopropanol, 1% zeepoplossing). Alle personeel dat monsters behandelt, moet worden ingeënt tegen hondsdolheid.

1. Verwijder de dierenkop met een mes voor de eerste halswervel (atlaswervel) om toegang te krijgen tot het foramen magnum.
   OPMERKING: Om besmettelijke aerosol te minimaliseren, vermijd het gebruik van een handmatige zaag of soortgelijk gereedschap.
2. Verzamel hersenstam (medulla oblongata) monster met behulp van een plastic wegwerppipet (Figuur 2A),een drinkstro (Figuur 2B),een klem (Figuur 2C) of een druppelaar (geleverd met de RIDT) (Figuur 2D).
   OPMERKING: Bij het verzamelen van het monster moet speciale aandacht worden besteed, omdat het een uiterst belangrijke stap is voor de betrouwbaarheid van de resultaten. Naast de bijbehorende video die op een eenvoudige manier laat zien hoe het deel van de hersenstam van belang te verzamelen, wordt een trainingsstap ten zeerste aanbevolen om ervoor te zorgen dat u de juiste anatomische sectie verzamelt.
3. Optioneel en naast hersenstam (medulla oblongata), verzamel andere delen van de hersenstam of de hersenen (cerebellum, hippocampus, thalamus en cortex) door dezelfde occipital route door het duwen en draaien van de plastic pipet of stro naar de oogkas (Figuur 3).
4. Bij gebruik van een rietje of pipet, knijp het voorzichtig om het hersenmonster (0,5-2 g) in een buis te deponeren voor latere analyse en/of biobanking.
   OPMERKING: Monsteropslag in glycerol wordt niet aanbevolen, omdat deze de capillaire stroom of de antilichaambindingsstap van de RIDT¹⁸lijkt te beïnvloeden.

2. Uitvoering van het gewijzigde RIDT-protocol¹⁴

OPMERKING: Deze wijziging laat een verdunningsstap (1:10) in PBS weg, zoals gespecificeerd in het fabrikantprotocol (alle versies), en kan worden geïmplementeerd onder laboratorium- of veldinstellingen.

1. Gebruik het wattenstaafje/druppelaar om het equivalent van een halve pinda of erwt (0,1-0,5 g) hersenmateriaal te verzamelen en plaats het in de buffermonsterbuis.
   LET OP: Voor het gewijzigde protocol zijn alle reagentia/verbruiksartikelen opgenomen in de kit (er is geen PBS of extra buis nodig) (figuur 4). Documenteer het batchnummer van de kit en controleer de geldigheid van de vervaldatum.
2. Voorzichtig plet het hersenmateriaal direct in de buis met het wattenstaafje of de druppelaar voor ongeveer 30 s totdat een homogene suspensie is verkregen.
   OPMERKING: De bufferreactie activeert de infectiviteit van het virus in de omstandigheden van protocol²⁴van de fabrikant.
3. Met behulp van de druppelaar, deponeren vier druppels (ongeveer 100 μL) van de schorsing in de monsterinlaat op het testapparaat.
4. Wacht op volledige monstermigratie (1-5 min) voordat u het testapparaat leest. De migratie moet snel beginnen na het storten van de steekproef (1-5 min).
5. In geval van vertraging (als gevolg van hoge viscositeitsschorsing) of om het begin van de migratie te versnellen, krab dan voorzichtig de onderkant van de stortingsplaats van het apparaat met de druppel (1-5 keer) en voeg uiteindelijk 1-2 meer druppels toe. De migratie moet onmiddellijk daarna beginnen.
6. Lees het testresultaat in het detectievenster na 5-10 min, en niet meer dan 20 min, na het einde van de migratie.
7. Interpreteer het resultaat op basis van aanwezigheid of afwezigheid van de controlelijn (C-lijn) en testlijn (T-lijn) (paarse lijnen) in het detectievenster, volgens figuur 5. Houd rekening met het monster positief wanneer twee lijnen zichtbaar zijn (figuur 5A), negatief als alleen de C-lijn aanwezig is ( figuur5B) en ongeldig als alleen de T-lijn aanwezig is of als er geen lijnen zichtbaar zijn ( figuur5C).
   OPMERKING: Ongeldige resultaten moeten ten minste één keer worden herhaald. Andere technieken moeten worden uitgevoerd als de resultaten ongeldig blijven. Negatieve resultaten verkregen met RIDT moeten vervolgens worden bevestigd met behulp van een gouden standaard referentiemethode, zoals DFAT, DRIT en moleculaire methoden (polymerase kettingreactie of PCR). Hoewel de gevoeligheid van deze test hoog is (zie representatieve resultaten), is het niet 100%.
8. Bewaar gebruikte apparaten bij kamertemperatuur, of koel/vries waar mogelijk, voor latere moleculaire analyse (zie punt 4). Vries de resterende monstersuspensie in bij -20 °C/-80 °C in de bufferbuis om de test zo nodig of voor latere moleculaire analyse te herhalen.

3. RNA-extractie en detectie door RT-qPCR van het RIDT-apparaat

OPMERKING: Deze stap kan alleen worden uitgevoerd onder laboratoriumomstandigheden met aangepaste omgeving en geschikte apparatuur voor moleculaire diagnose. Dit kan snel na de RIDT-test of achteraf op gearchiveerde RIDT-apparaten, opgeslagen bij kamertemperatuur (15-30 °C), gekoeld of bevroren.

1. RNA-extractie
   OPMERKING: Om de extractiestap te controleren, wordt aanbevolen om een interne controle te gebruiken die een endogene mRNA (zoals ß-actine) of een exogene controle (zoals eGFP synthetisch RNA) direct in het monster kan zijn tijdens de eerste stappen van de extractie^26,27.
   1. Open het apparaat voorzichtig en verwijder het filterpapier.
   2. Snijd het deponeringsgebied van het monster en plaats het in een buis met 1 mL Tri-Reagens LS. Incubeer bij RT gedurende 1 uur met zachte regelmatige handmatige agitatie.
   3. Voer de extractie uit in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant, zoals eerder beschreven²⁷. Bij deze stap kan de exogene interne controle worden toegevoegd.
   4. Voeg tijdens het proces 2 μL glycogeen toe voor het vergemakkelijken van neerslag van RNA, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
   5. Pas het uiteindelijke volume aan voor RNA-resuspensie in nucleasevrij water, met een volume van 50 μL dat over het algemeen wordt gebruikt.
      OPMERKING: Aan het einde van de centrifugatiestap voor waterige en organische fasescheiding (na toevoeging van 200 μL chloroform in de Tri-Rensoogstof LS) bevindt het stuk membraan van het apparaat zich aan de onderkant van de buis en interfereert het niet met de verzameling van de bovenste waterige fase. Als alternatief kunnen andere eenvoudige en snelle protocollen worden gebruikt, bijvoorbeeld met behulp van fenol-gebaseerde reagentia en silicamembranen²⁸.
2. Detectie door RT-qPCR²⁶
   OPMERKING: Detectie van potentiële virale RNA aanwezig in geëxtraheerde monsters kan worden gedaan met behulp van verschillende moleculaire technieken, zoals reverse-transcriptie PCR, conventionele (eindpunt) of real-time PCR (qPCR). Er zijn verschillende methoden beschikbaar, zoals conventionele RT-PCR^27,,29 of RT-qPCR^26,30 gericht op het virale nucleoproteïne of polymerase-gen. Een voorbeeld zal hieronder worden gepresenteerd op basis van een dual combined pan-lyssavirus RT-qPCR gericht op een geconserveerd gebied onder de virale polymerase. Deze RT-qPCR techniek koppelt twee verschillende RT-qPCR: een op basis van de TaqMan sonde technologie (pan-RABV RT-qPCR) en de andere met behulp van de SyBR Green detectie (pan-lyssa RT-qPCR). Bovendien wordt de detectie van een exogene interne controle (eGFP RNA) direct verrijkt tijdens het extractieproces gedaan door een specifieke TaqMan probe-based RT-qPCR (eGFP RT-qPCR). Zorgvuldige validatie ter plaatse van de moleculaire technieken die zijn geselecteerd voor de detectie van viraal RNA is met name belangrijk om na te gaan of primers en sondes voor real-time RT-PCR zijn aangepast voor de detectie van de stammen die in het gebied van belang circuleren⁴.
   1. Verdun RNA monster tot 1:10 in nuclease vrij water. Test elk RNA-monster in tweevoud, met behulp van een 96-put reactieplaat of andere formaten. Gebruik positieve en negatieve controles voor elke test en test ten minste in tweevoud.
   2. Bereid de hoofdmixreactieoplossing voor de drie verschillende RT-qPCR-tests volgens tabel 1, en met de primers/sondes aangegeven in tabel 2.
   3. Voeg 5 μL verdunde RNA-monsters en 15 μL mastermix toe aan elk van de drie verschillende tests. De pan-RABV RT-qPCR test en de eGFP RT-qPCR test kunnen in dezelfde plaat fietsen.
   4. Voer de verschillende tests uit volgens de thermische fietsomstandigheden die in tabel 3 zijnaangegeven . Als er slechts één PCR thermische cycler beschikbaar is, begin dan met de pan-RABV RT-qPCR en houd de plaat voor de pan-lyssa RT-qPCR op 4 °C tot het einde van de pan-RABV RT-qPCR.
   5. Analyseer de resultaten verkregen met de drie tests volgens tabel 4.

4. Genotyping na RNA-extractie uit het RIDT-apparaat

1. Reverse transcriptie RT^27,29
   1. Bereid een mastermix voor met 6 μL RNA, 2 μL pd(N)6 random primers (200 μg/μL) en 2 μL nuclease-vrij water voor een eindvolume van 10 μL.
   2. Incubeer bij 65 °C gedurende 10 minuten in een hitteblok en bewaar vervolgens op ijs.
   3. Bereid een mastermix voor met 6 μL 5x First-Strand Buffer, 2 μL van 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 μL (200 U) van Superscript II reverse transcriptase, 2 μL (80 U) van RNasin, 2 μL dNTP-mix (10 μM) en compleet met nucleasevrij water om een eindvolume van 20 μL voor elk monster te verkrijgen.
   4. Voeg de mastermix (20 μL) toe aan het monster (10 μL) (eindvolume van 30 μL) en incubeer bij 42 °C gedurende 90 minuten in een warmteblok.
   5. Ga naar de volgende stap met PCR-versterking of bewaar de cDNA op -20 °C.
2. Conventionele PCR^27,29,31
   LET OP: Verschillende technieken van conventionele PCR zijn beschikbaar voor genotyperen. Twee worden gepresenteerd, beide hemi-geneste PCR, gericht op een deel van de nucleoproteïne of een deel van het virale eiwit van het lyssavirus. Het protocol is hetzelfde voor elk van deze tests, met uitzondering van de primers en fietsomstandigheden. Positieve (positieve RNA) en negatieve (negatieve cDNA en/of nuclease-vrij water) controles moeten worden opgenomen in elke serie en elke ronde van PCR.
   1. Bereid voor elk monster in een 0,2 mL microbuis een master mix reactie oplossing voor de eerste PCR stap. Deze mix bevat 5 μL 10x NH4 Reaction Buffer, 2,5 μL MgCl_2-oplossing (50 mM), 1 μL dNTP-mix (10 μM), 1 μL van elke primer (10 μM), 0,2 μL (1 U) biotaq-polymeer-DNAase en 37,3 μL nucleasevrij water (eindvolume van 48 μL). De primers zijn aangegeven in tabel 5.
   2. Voeg 2 μL cDNA in elke buis toe en cyclus op een aparte conventionele PCR thermische cycler voor elke test, volgens tabel 6.
   3. Bereid een tweede master mix reactie oplossing identiek aan de vorige met behulp van de juiste primers (Tabel 5) voor de hemi-geneste PCR reactie.
   4. Voeg 2 μL van het eerste ronde PCR-product toe en fiets op een conventionele PCR-thermische cycler met behulp van de fietsparameters die in tabel 6 zijnaangegeven .
   5. Visualiseer de verschillende PCR-producten (eerste en tweede ronde PCR) na het laden op een 1% agarose gel (100 mL Tris-acetaat EDTA buffer 1x - TAE 1x) met ethidium bromide (uiteindelijke concentratie rond 0,01%) en voer de gel gedurende 30 minuten op 120 V. Een positief PCR-resultaat wordt waargenomen in de vorm van een heldere band van de verwachte grootte(tabel 5).
3. Sanger sequencing
   1. Voer een Sanger sequencing uit van de amplicons verkregen met het pan-lyssavirus hemi-geneste PCR en voltooi de genotyperanalyse.

Resultaten

Zoals bij elke diagnostische methode, is het verzamelen van monsters van het grootste belang voor de betrouwbaarheid van de resultaten, vooral wanneer deze worden uitgevoerd in veldinstellingen. Het inzamelingsproces moet zo eenvoudig mogelijk zijn om het verzamelen van monsters van hoge kwaliteit te garanderen. De verzameling van een hersenbiopsie (hersenstam met medulla oblongata) via de foramen magnum route voor postmortem diagnose van dierlijke hondsdolheid voldoet aan deze eis, zoals aangegeven in figuur 2A-D²⁵.

Na het verzamelen wordt het hersenmonster onderworpen aan het gewijzigde protocol van de RIDT, samengevat in figuur 6. Zoals aangegeven in de afdeling Protocol, is de belangrijkste aanpassing van het door de fabrikant verstrekte protocol het weglaten van de verdunningsstap in PBS, dat de procedure en de noodzakelijke verbruiksgoederen/reagentia vereenvoudigt, dus allemaal opgenomen in de kit (figuur 4).

Dit gewijzigde protocol werd geïmplementeerd en geëvalueerd in vijf verschillende laboratoria, waaronder één samenwerkingsverbandscentrum van de WHO over hondsdolheid (Lab 1, Frankrijk), één FAO-referentiecentrum voor hondsdolheid (Lab 5, Italië) en drie referentielaboratoria in enzoötische Afrikaanse landen, Tsjaad (Lab 2), Ivoorkust (Lab 3) en Mali (Lab 4). In Tsjaad werd een evaluatie van de RIDT uitgevoerd in zowel laboratorium- als veldomgevingen.

In vergelijking met de referentietechniek DFAT waren de gevoeligheid en specificiteit van de RDIT hoog voor alle laboratoria, met respectievelijk 96% tot 100% en 93,7% tot 100% (tabel 7). De laagste gevoeligheid en specificiteit van de RDIT werd verkregen voor Lab 1 (Frankrijk) tijdens de laboratoriumvalidatiestap. Op basis van het cumulatieve aantal geteste monsters (n=162)(aanvullende tabel 1)bedroeg de algehele gevoeligheid en specificiteit ten opzichte van DFAT respectievelijk 98,2% en 95,8% (tabel 7). Deze voorlopige maar veelbelovende resultaten werden echter verkregen op een beperkte steekproefgegevensset en moeten verder worden bevestigd op een groot aantal positieve en negatieve monsters, met name voor monsters die in enzoötische gebieden zijn getest, om mogelijke onderschatting of vooringenomenheid als gevolg van de huidige heterogene datasets te voorkomen.

De RIDT-test is geschikt om lyssavirus in hersenbiopten van besmette dieren op te sporen, waarbij het niveau van lyssavirusantigenen belangrijk is. De detectiegrens blijft echter hoog bij het testen van getitreerde virussuspensie (tabel 8; Figuur 7).

Tabel 9 (uit Léchenne 2016¹⁴⁾toont een voorbeeld van resultaten verkregen na RNA-detectie door het dual combined pan-lyssavirus RT-qPCR gericht op de virale polymerase van lyssavirus. Een panel van 51 positieve RIDT-tests uitgevoerd in laboratoriumomstandigheden (Lab 1, n=32) of in Tsjaad (Lab 2, n=19) en vervolgens bij omgevingstemperatuur naar Lab 1 verzonden, werd getest. Positieve detectie werd verkregen voor 18 (94,7%), 26 (81,2%) en 44 (86,3%) monsters van lab 1, lab 2 en de twee gecombineerd, respectievelijk. Daarnaast werd genotypering uitgevoerd voor 14 van deze monsters (10 van Lab 1 en 4 van Lab 2) met behulp van de hemi-geneed PCR gericht op de gedeeltelijke nucleoproteïne gen en was succesvol voor 13 van hen (93%) (van Léchenne et al. 2016¹⁴).

Figuur 1: Schematische weergave van de structuur van een RIDT voor rabiësdiagnose. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Voorbeelden van snelle eenvoudige technieken voor het verzamelen van hersenmonsters (hersenstam met medulla oblongata) bij dieren (hond hier getoond) via de occipital foramen in veldinstellingen (Mali). (A) Inzameling met een wegwerp plastic pipet (B) Inzameling met een plastic drinkstro (C) Inzameling met een klem (D) Inzameling met de verwijderingsdruppel die in de UITRUSTING RIDT wordt verstrekt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Longitudinale anatomische sectie van de hond hoofd, met de verschillende delen van de hersenen (hersenstam, cerebellum, hippocampus, thalamus en cortex) verzameld bij het duwen, in een rotatiebeweging, een wegwerp plastic pipet door de occipital foramen route. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Beschrijving van de inhoud van ridt-kit, inclusief het apparaat, een wegwerp plastic druppelaar, een wegwerpuitstrijkje en het verdunningsmiddel. De buis waar het monster zal worden verzameld en opgeslagen is niet aanwezig. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Representatieve resultaten voor de interpretatie van de Anigen RIDT. (A) Positieve resultaten (zichtbare aanwezigheid van twee lijnen, C-lijn en T-lijn) (B) Negatieve resultaten (zichtbare aanwezigheid van alleen C-lijn) (C) Ongeldige resultaten (afwezigheid van zichtbare C-lijn). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Schematische weergave van het RIDT-protocol, aangepast aan de instructies van de fabrikant. (A) Gewijzigde versie van het protocol, met schrapping van de verdunningsstap aanbevolen door de fabrikant (B) Eerste protocol aanbevolen door de fabrikant, met een pre 1:10 verdunning stap in PBS van de hersenen monsters. De stappen die in de gewijzigde versie van het protocol zijn verwijderd (gepresenteerd in figuur 6A)worden aangegeven met een rode lijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Voorbeeld van bepaling van de detectiegrens van RIDT¹⁴. Een seriële 10:1 verdunning van een getitreerd rabiësvirus van de stam 9704ARG werd gebruikt. De hoeveelheid virus die op elk apparaat wordt afgezet, wordt aangegeven in FFU (fluorescerende focusvormende eenheden). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Pan-RABV RT-qPCR test
Reagens	μL/Reactie
2X Reaction Mix (een buffer van 0,4 mM per dNTP en 6 mM MgSO4)	10
Nuclease gratis water	1.5
Taq3long (Vooruit) [10 μM]	1
Taq17revlong (Omgekeerd) [10 μM]	1
RABV4 [10 μM]	0.3
RABV5 [10 μM]	0.3
MgSO4 [50 mM] (aanwezig in de kit)	0.25
ROX Reference Dye (25 μM) (aanwezig in de kit)	0.05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Totaal per reactie	15
eGFP RT-qPCR-test
Reagens	μL/Reactie
2X Reaction Mix (een buffer van 0,4 mM per dNTP en 6 mM MgSO4)	10
Nuclease gratis water	2.8
EGFP1F (Vooruit) [10 μM]	0.5
EGFP2R (Omgekeerd) [10 μM]	0.5
eGFP-sonde [10 μM]	0.3
MgSO4 [50 mM] (aanwezig in de kit)	0.25
ROX Reference Dye (25 μM) (aanwezig in de kit)	0.05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Totaal per reactie	15
Pan-lyssa RT-qPCR test
Reagens	μL/Reactie
2x SYBR Groene Reactie Mix	10
Nuclease gratis water	2.1
Taq5long (Vooruit) [10 μM]	1
Taq16revlong (Omgekeerd) [10 μM]	1
MgSO4 [50 mM] (aanwezig in de kit)	0.25
ROX Referentiekleurstof (25 μM)	0.05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Totaal per reactie	15

Tabel 1: Beschrijving van de master mix reactie oplossing voor de drie verschillende RT-qPCR testen (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR en eGFP RT-qPCR).

RT-qPCR-test	Naam	Type	Lengte	Reeks (5'-3')	Zin	Positie
pan-RABV RT-qPCR test	Taq3long	Primer	22	ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC A	S	7273-7294a
	Taq17revlong	Primer	25	GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC CAR G	Als	7390-7414a
	RABV4 RABV4	Sonde (FAM/TAMRA)	29	AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC	Als	7314-7342a
	RABV5	Sonde (FAM/TAMRA)	32	AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA	S	7353-7384a
Pan-lyssa RT-qPCR test	Taq5long	Primer	23	TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CA	S	7272-7294a
	Taq16revlong	Primer	25	GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C	Als	7366-7390a
eGFP RT-qPCR-test	EGFP1F	Primer	20	GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC	S	637-656b
	EGFP2R	Primer	19	GAA CTC CAG CAG GAC CAT G	Als	768-750b
	EGFP	Sonde (FAM/TAMRA)	22	AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A	S	703-724b

Tabel 2: Beschrijving van de primers/sondes voor de drie verschillende RT-qPCR-tests (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR en eGFP RT-qPCR). ^a. Volgens het Pasteur virus (PV) RABV genoomsequentie (GenBank toetredingsnummer M13215). ^b Volgens de kloonvector pEGFP-1-reeks (GenBank-toetredingsnummer U55761).

Pan-RABV RT-qPCR en eGFP RT-qPCR testen
Stap	Cyclus	Temp	Tijd	Gegevensverzameling
Omgekeerde transcriptie	1	45 °C	15 min
RT-inactivatie/initiële denaturatie	1	95 °C	3 min
Versterking	40	95 °C	15 s
		61 °C	1 min	Eindpunt
Pan-lyssa RT-qPCR test
Stap	Cyclus	Temp	Tijd	Gegevensverzameling
Omgekeerde transcriptie	1	45 °C	15 min
RT-inactivatie/initiële denaturatie	1	95 °C	3 min
Versterking	40	95 °C	15 s
		55 °C	1 min	Eindpunt
Dissociatiecurve	1	95 °C	15 s	Verhoging 0,1 °C/s, 55–95 °C
		55 °C	1 min
		95 °C	15 s
		55 °C	15 s

Tabel 3: Beschrijving van de thermische fietsomstandigheden voor de drie verschillende RT-qPCR-tests (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR en eGFP RT-qPCR).

Assay	Analyse	Resultaten	Interpretatie
eGFP RT-qPCR	Cq in het interval van acceptatie	Gevalideerde extractie	Analyse van andere testen kan worden gedaan
	Cq uit het interval van acceptatie	Extractie niet gevalideerd	Test het monster opnieuw (herhaal de run of/en de extractie), vraag indien nodig een ander monster aan
pan-RABV RT-qPCR	Cq <38	Positieve	Positieve detectie van viraal RNA
	Cq ≥38	Negatieve	Analyse van de pan-lyssa RT-qPCR test
pan-lyssa RT-qPCR	Smeltcurve beschouwd als positief	Positieve	Positieve detectie van viraal RNA
	Smeltcurve beschouwd als negatief	Negatieve	Afwezigheid van detectie van viraal RNA

Tabel 4: Algemene interpretatie van de dual combined pan-lyssavirus RT-qPCR test.

Hemi-geneste conventionele PCR test	PCR-ronde	Naam	Lengte	Reeks (5'-3')	Zin	Een positiein een	Amplicongrootte (bp)
Hemi-geneste PCR gericht op het polymerase gen	1e ronde	PVO5m	20	ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA	S	7170-7189	320
		PVO9 PVO9	19	TGA CCA TTC CAR CAR GTN G	Als	7471-7489
	2e ronde	PVO5m	20	ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A	S	7170-7189	250
		PVO8	22	GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A	Als	7398-7419
Hemi-geneste PCR gericht op de nucleoproteïne gen	1e ronde	N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74	1532
		N8m	19	CAG TCT CYT CNG CCA TCT C	Als	1568-1586
	2e ronde	N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74	845
		N829	19	GCC CTG GTT CGA ACA TTC T	Als	881-899

Tabel 5: Beschrijving van de primers die worden gebruikt voor de conventionele hemi-geneste PCR.

	Hemi-geneste PCR gericht op het polymerase gen
	Stap	Cyclus	Temperatuur	Tijd
Eerste en tweede ronde	Initiële denaturatie	1	94 °C	3 min
	Denaturatie	35	94 °C	30 s
	Hybridatie		56 °C	45 s
	Rek		72 °C	40 s
	Laatste verlenging	1	72 °C	3 min
	Hemi-geneste PCR gericht op de nucleoproteïne gen
	Stap	Cyclus	Temperatuur	Tijd
Eerste ronde	Initiële denaturatie	1	94 °C	3 min
	Denaturatie	35	94 °C	30 s
	Hybridatie		56 °C	30 s
	Rek		72 °C	45 s
	Laatste verlenging	1	72 °C	3 min
Tweede ronde	Initiële denaturatie	1	94 °C	3 min
	Denaturatie	35	94 °C	30 s
	Hybridatie		58 °C	30 s
	Rek		72 °C	30 s
	Laatste verlenging	1	72 °C	3 min

Tabel 6: Beschrijving van de thermische fietsomstandigheden voor de conventionele hemi-geneste PCR.

Lab	Land	Evaluatieperiode	NB van monsters	DFAT resultaten		RIDT-resultaten		Gevoeligheid	Specificiteit
				Pos	Neg	Pos	Neg
Lab 1	Frankrijk	2015	82	50	32	50	32	96%	93.7%
Lab 2	Tsjaad	2012-2015	44	33	11	33	11	100%	100%
Lab 3	Ivoorkust	2017	10	8	2	8	2	100%	100%
Lab 4	Mali	2017	18	15	3	15	3	100%	100%
Lab 6	Italië	2016	8	8	0	8	0	100%	-
Alle		2015-2017	162	114	48	114	48	98.2%	95.8%

Tabel 7: Bepaling van de intrinsieke parameters (gevoeligheid, specificiteit) van de RIDT-test ten opzichte van de referentie-DFAT-methode, op basis van de analyse van in totaal 162 monsters en met deelname van 5 verschillende laboratoria.

Virusstameen	Originele host	Locatie	Initiële concentratie (FFU/mL)b	Detectielimiet (FFU/mL)c
9147FRA	Rode vos	Frankrijk	3,1 x 107	106.
Cvs	Lab isolaat	-	1,6 x 107	106.
8743THA	Menselijke	Thailand	8,1 x 107	> 8,1 x 106
9508CZK (SAD)	Lab isolaat	-	5,4 x 108	107.
Pv	Lab isolaat	-	4,3 x 107	106.
9001FRA	Hond	Frans-Guyana	2,4 x 106	> 2,4 x 105
9704ARG	Bat	Argentinië	9,5 x 107	105.
04030PHI	Menselijke	Filippijnen	2,5 x 107	105.

Tabel 8: Detectiegrens van de RIDT met behulp van 8 verschillende titrated rabiësvirussuspensiesusringen (van Léchenne et al. 2016¹⁴). ^a. CVS: Uitdaging virus stam, SAD: Street Alabama Dufferin, PV: Pasteur virus. ^b Aantal fluorescerende focusvormende eenheden (FFU) per mL. ^c Aantal fluorescerende focus-forming units (FFU) gedeponeerd op de strip.

		RIDT uitgevoerd in
		Lab 1			Lab 2			Gecombineerd
		Positieve	Negatieve	Totale	Positieve	Negatieve	Totale	Positieve	Negatieve	Totale
Virale RNA-detectie	Positieve	18	1	19	26	0	32	44	7	51
	Negatieve	0	0	0	0	0	3	0	3	3
	Totale	18	1	19	26	0	35	44	10	54

Tabel 9: Detectie van viraal RNA met RT-qPCR op Anigen-teststrip gebruikt in laboratoriumomstandigheden (Lab 1), in veldomstandigheden en verzonden bij omgevingstemperatuur (Lab 2) of gecombineerd (vanaf Léchenne et al. 2016¹⁴).

Aanvullende tabel 1: Beschrijving van de 162 monsters die met de RIDT-test zijn getest om de intrinsieke parameters ervan te bepalen, gepresenteerd in tabel 7. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussie

De RIDT is een eenvoudige, snelle en goedkope methode voor postmortem rabiës diagnose en een veelbelovend veld alternatief voor laboratoriumtesten. De toepassing van een dergelijke test, met name voor gedecentraliseerde gebieden van lage- en middeninkomenslanden, zou het begrip van de prevalentie en overdracht van rabiësvirus op lokale en potentieel nationale schaal verbeteren. In combinatie met de snelle hersenmonsterverzamelingsmethode (zonder volledige obductie), is een groot voordeel dat de test volledig kan worden uitgevoerd in de veldomgeving, weg van laboratoriumfaciliteiten. Hersenmonsters die via het foramen magnum worden verzameld, kunnen worden gebruikt voor het testen, waardoor het niet nodig is om de schedel van het dier volledig te openen. De test is eenvoudig uit te voeren en te interpreteren en is bijzonder geschikt voor veldbewakingsactiviteiten¹⁴. Andere voordelen van de RIDT ten opzichte van de DFAT of DRIT zijn geen behoefte aan positieve en negatieve controles en kit opslag bij kamertemperatuur. Bovendien vereist het gewijzigde protocol, waarbij de verdunningsstap (1:10) in PBS wordt weggelaten, geen extra reagentia om de test uit te voeren en vereenvoudigt het de procedure onder veldomstandigheden verder.

Een belangrijk punt is de kwaliteit van de hersenmonsters. Monsters moeten zo spoedig mogelijk na de dood van het vermoedelijke dier worden verzameld en getest of vóór het testen op koele temperatuur worden gehouden om afbraak te voorkomen. Ontbonden monsters mogen niet worden getest omdat het het resultaat kan beïnvloeden (risico op vals negatief resultaat). Hoewel er nog geen gegevens beschikbaar zijn met betrekking tot het verlies van gevoeligheid van RIDT na verloop van tijd voor hersenmonsters, veronderstellen we dat het vergelijkbaar is in vergelijking met de DFAT-test^32. De tijd tussen de dood van het dier en het uitvoeren van de test kan echter worden verkort, omdat de test snel en direct in het veld kan worden uitgevoerd. Zo is er in het algemeen een lager risico op ontbonden monsters.

Een andere kritieke stap binnen het protocol is de migratie van de steekproefsuspensie. De migratie moet direct na het storten van de steekproef beginnen (1-5 min). Een hoge viscositeit van de suspensie kan de migratie dus negatief beïnvloeden. Voorzichtig krassen op de onderkant van het apparaat storting site met de druppelaar en het toevoegen van 1-2 meer druppels lost vaak dit probleem op, en de migratie begint onmiddellijk na.

De meeste RIDT-tests die in Afrikaanse laboratoria (Tsjaad, Ivoorkust en Mali) werden uitgevoerd, werden uitgevoerd bij omgevingstemperatuur die hoger kan zijn dan 30 °C, terwijl het door de fabrikant aanbevolen temperatuurbereik voor opslag en gebruik 15 °C - 30 °C bedraagt. Hoewel we geen invloed van hoge temperatuur op de RIDT-testprestaties hebben vastgesteld, is het noodzakelijk om het zorgvuldiger te evalueren. Ook de impact van hoge temperatuur tijdens de opslag en transport van het apparaat na gebruik voor virale RNA-detectie en genotyping vereist extra evaluatie. De gevoeligheid van de virale RNA-detectie door RT-qPCR van de RIDT-strip kan worden beïnvloed door de kwaliteit van het hersenmonster dat aanvankelijk in de test werd gebruikt, maar ook door de toestand van de opslag van de RIDT-tests na gebruik. Zo was de gevoeligheid van de RNA-detectie hoger bij het gebruik van RIDT-tests onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden (94,7%) vergeleken onder veldomstandigheden (bijvoorbeeld Tsjaad) (81,2%)¹⁴. Deze voorwaarden kunnen ook van invloed zijn op de integriteit (met name de lengte) van RNA die op de strip is bevestigd, mogelijk, wat de matige gevoeligheid voor genotypering op basis van langere PCR-amplicons (bijvoorbeeld >500 nucleotiden)¹⁴verklaart. De gevoeligheid van RT-qPCR uitgevoerd op de teststrip was lager dan die verkregen met fta Whatman kaarten (80,6%)¹⁴. Net als bij andere moleculaire technieken kan de virale belasting ook invloed hebben op het succes van genotyperen op basis van RDIT-strips, met potentiële negatieve resultaten voor monsters met een lage virale belasting¹⁴.

De test wordt momenteel niet aanbevolen door de WHO en OIE voor routinematige diagnose en ziektebewaking, en een resultaat kan niet op zichzelf worden gebruikt om PEP-besluitvorming te begeleiden. Verdere testvalidatie is nog steeds nodig. Een nauwkeurige diagnose van hondsdolheid is echter een cruciaal element van goed functionerende bewakingssystemen voor rabiës en is instrumenteel om de politieke betrokkenheid te vergroten, wat bij uitstek belangrijk is voor een succesvolle duurzame rabiësbestrijding³³. RIDT-tests bieden in dit verband nieuwe diagnostische mogelijkheden voor rabiës en zijn een nuttig instrument om het toezicht op hondsdolheid van dieren in het veld in enzoötische gebieden met lage of middeninkomens uit te breiden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (gelyofiliseerd, geadsorbeerd)	Bio-Rad, Frankrijk	3572112	Fluoresceïne-5-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd polyklonaal antilichaam tegen de nucleocapsid van het hondsdolheidsvirus. Gebruik voor de DFAT referentietechniek.
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Frankrijk	4351104	Amplificatie van het virale RNA door RT-qPCR na extractie uit het RIDT-apparaat.
Eenmalige plastic pipetten, drinkrietje, klem, druppelpipet	-	-	Apparatuur gebruikt voor het verzamelen van de hersenstam (medulla oblongata) via het foramen magnum (occipitale route).
Evans Blue Oplossing 1%	Bio-Rad, Frankrijk	3574911	Tegenkleuring gebruikt voor de DFAT om het lezen onder UV-microscoop te vergemakkelijken.
Primer eGFPF1	Eurofins Genomics, Duitsland	-	Forward primer voor de amplificatie van de interne controle eGFP door RT-qPCR na RNA-extractie uit het RIDT-apparaat, sequentie: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2	Eurofins Genomics, Duitsland	-	Reverse primer voor de amplificatie van de interne controle eGFP door RT-qPCR na extractie uit het RIDT-apparaat, sequentie: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics, Duitsland	-	Reverse primer voor de amplificatie van het virale RNA door RT-qPCR na RNA-extractie uit het RIDT-apparaat, sequentie: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics, Duitsland	-	Forward primer voor de amplificatie van het virale RNA door RT-qPCR na RNA-extractie uit het RIDT-apparaat, sequentie: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Probe eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Duitsland	-	Forward primer voor de amplificatie van de interne controle door RT-qPCR na extractie uit het RIDT-apparaat, sequentie: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Probe RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Duitsland	-	Probe voor de amplificatie van het virale RNA door RT-qPCR na RNA-extractie uit het RIDT-apparaat, sequentie: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Probe RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Duitsland	-	Probe voor de amplificatie van het virale RNA door RT-qPCR na RNA-extractie uit het RIDT-apparaat, sequentie: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Rapid Rabies Ag Test Kit	BioNote Inc., Republiek Korea	RG18-01DD	Snelle immunochromatografische diagnostische test (RIDT, ook wel zijstroomapparaat of LFD genoemd) voor de post-mortem diagnose van hondsdolheid.
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega, VS	N2515	Enzym gebruikt met de kit voor de amplificatie van het virale RNA door RT-qPCR na extractie uit het RIDT-apparaat.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen, Frankrijk	11732-020	Kit voor de amplificatie van het virale RNA door RT-qPCR na extractie uit het RIDT-apparaat.
TRIzol Reagent	Invitrogen, Frankrijk	15596026	Fenolverbinding/chloorform-gebaseerde totale RNA-extractie met behulp van de cellulosemembraan van de RIDT.