Methodenartikel

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

DOI:

10.3791/60009

⸱

31 december 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode voor de karakterisering van protonen-gedreven membraan transporteurs in membraan vesikel preparaten geproduceerd door heterologeuze expressie in E. coli en Lysis van cellen met behulp van een Franse pers.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om nieuwe membraan transporteurs functioneel te karakteriseren. Polyamines zijn alomtegenwoordig in alle organismen, maar polyamine-wisselaars in planten zijn niet geïdentificeerd. Hier schetsen we een methode om polyamine-antiporters te karakteriseren met behulp van membraan blaasjes gegenereerd uit de lysis van Escherichia coli cellen die heterologously een plant antiporter uitdrukken. Eerste, we heterologously uitgedrukt AtBAT1 in een E. coli stam tekort aan polyamine en arginine Exchange transporters. Blaasjes werden geproduceerd met behulp van een Franse pers, gezuiverd door ultracentrifugatie en gebruikt in een membraanfiltratie test van gelabelde substraten om de substraat specificiteit van de transporter aan te tonen. Deze assays aangetoond dat AtBAT1 is een proton-gemedieerde transporter van arginine, γ-aminoboterzuur (GABA), putrestsin en spermidine. De Mutante stam die werd ontwikkeld voor de bepaling van AtBAT1 kan nuttig zijn voor de functionele analyse van andere families van plantaardige en dierlijke polyamine wissel wisselaars. We veronderstellen ook dat deze aanpak kan worden gebruikt om te karakteriseren vele andere soorten anti porters, zolang deze eiwitten kunnen worden uitgedrukt in de bacteriële celmembraan. E. coli is een goed systeem voor de karakterisering van nieuwe transporteurs, omdat er meerdere methoden zijn die kunnen worden gebruikt om inheemse vervoerders te mutageen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitten die betrokken zijn bij de handel in metabolieten vormen een essentieel niveau van fysiologische regulering, maar de overgrote meerderheid van de planten membraan vervoerders is nog niet functioneel gekenmerkt. Er zijn verschillende strategieën geïmplementeerd om nieuwe transporteiwitten te karakteriseren. Heterologeuze expressie in model organismen zoals E. coli en eukaryote cellen zoals gist, Xenopus oocyten, zoogdiercellen, insecten cellen en plantencellen zijn allemaal gebruikt om hun transportactiviteit te bepalen1. Eukaryote cellen zijn begunstigd voor de uitdrukking van eukaryotische eiwitten, omdat de basis cellulaire samenstelling, signaal transducing trajecten, transcriptie-en vertaal machines compatibel zijn met de inheemse omstandigheden.

Gist is een belangrijk modelorganisme voor de karakterisering van nieuwe transporteiwitten in planten. Het eerste plantaardige transporteiwit dat met succes werd uitgedrukt in gist (Saccharomyces pombe) was de van transporter HUP1 van Chlorella2. Sindsdien zijn veel planten transporteiwitten functioneel gekarakteriseerd met behulp van een gist uitdrukkings systeem. Deze omvatten, plantaardige suiker transporters (SUC1 en SUC23, VfSUT1 en VfSTP14) en de AUXIN SURGERY TRANSPORTERS (AUX1 en pin5). Nadelen van het gebruik van gist om plantaardige eiwitten te uiten kunnen een verminderde activiteit van Plastide-gelokaliseerde eiwitten omvatten, omdat gist deze organel mist, mistargeting6, en de vorming van misgevouwen aggregaten en activering van stress reacties in gist als gevolg van overexpressie van membraan eiwitten7,8,9.

Heterologeuze expressie van transporteiwitten in Xenopus -oocyten is op grote schaal gebruikt voor de elektrofysiologische karakterisering van transporters10. De eerste plantaardige transporteiwitten die worden gekenmerkt door heterologeuze expressie in Xenopus -eicellen waren het Arabidopsis kalium kanaal KAT110 en de Arabidopsis van transporter STP111. Sindsdien worden Xenopus -oocyten gebruikt om veel plantaardige transporteiwitten te karakteriseren, zoals plasma membraan transporters12, vacuole sucrose Transporter SUT413 en vacuole malaat Transporter ALMT914. Een belangrijke beperking van Xenopus -eicellen voor transport testen is dat de concentratie van intracellulaire metabolieten niet kan worden gemanipuleerd1. Bovendien is professionele kennis vereist om Xenopus -eicellen voor te bereiden en de variabiliteit van de oöcyten batches is moeilijk te beheersen.

Heterologeuze expressie in het modelorganisme E. coli is een ideaal systeem in termen van de karakterisering van nieuwe plantaardige transporteiwitten. Met een volledig gesequentieerde genoom15zijn de moleculaire en fysiologische kenmerken van E. coli bekend. Moleculaire gereedschappen en technieken zijn goed vastgesteld16. Daarnaast zijn er verschillende expressie vectoren, niet-pathogene stammen en mutanten beschikbaar17,18,19. Bovendien, E. coli heeft een hoge groeisnelheid en kan gemakkelijk worden geteeld onder laboratoriumomstandigheden. Veel eiwitten kunnen gemakkelijk worden uitgedrukt en gezuiverd in hoge hoeveelheden in E. coli9. Wanneer eiwitten niet direct in cellulaire systemen kunnen worden getest, is reconstitutie van eiwitten in liposomen ook een succesvolle, zij het uitdagende innovatie voor de karakterisering van gezuiverde membraan eiwitten. Functionele karakterisering van de plant mitochondriale transporteiwitten met inbegrip van opgeloste transporters zoals fosfaat transporteurs in soja, maïs, rijst en Arabidopsis, dicarboxylaat-tricarboxylaatdrager in Arabidopsis zijn bereikt met behulp van dit modelsysteem20,21. Echter, recombinante eiwitten van de tomaten proteïne SICAT9 bleken niet functioneel te zijn in reconstitutie experimenten, en andere leden van de CAT Transporter familie bleken niet functioneel te zijn in Xenopus oöcyt assays22. Er zijn dus extra moleculaire gereedschappen nodig voor de karakterisering van membraan transporteurs.

Vijf polyamine transportsystemen zijn te vinden in E. coli23. Ze omvatten twee ABC-transporters die de opname van spermidinerijk en putrestsin, een putrestsin/Ornithine-wisselaar, een cadaverine/lysine-wisselaar, een spermidinerijk-exporteur en een importeur van putrestsin bemiddelen. De putrestsin wisselaar Pote werd oorspronkelijk gekarakteriseerd met behulp van een blaasje Assay, waarbij binnenstevoren blaasjes werden bereid door lyserende cellen met een Franse pers en het meten van de opname van van putrestsin in de blaasjes in ruil voor Ornithine24. Vesicle assays werden ook gebruikt om een calcium transporter te karakteriseren, die het transport van calcium in reactie op een proton gradiënt25bemiddelde. Deze experimenten hebben ons ertoe aangezet een strategie te ontwikkelen voor de karakterisering van andere polyamine wissel wisselaars. We eerst creëerde een stam van E. coli tekort in Pote en CADB wissel wisselaars. Hier demonstreren we de functionele karakterisering van een plantaardige polyamine antiporter door heterlogous expressie in de gemodificeerde E. coli stam, generatie van membraan blaasjes met behulp van een Franse pers, en van assays.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. generatie van de E. coli Double knock out mutant met P1 transduction

  1. Verkrijg de e. coli single-Knockout Mutante stammen δpote en δcadb van het genetische voorraad centrum e. coli (http://cgsc.Biology.Yale.edu).
    Opmerking: De stam Δpote is kanamycine bestendig26 en de spanning δcadb is tetracycline resistent27.
  2. Bouw de Pote/CADB Double Knockout (DKO) stam met behulp van de P1 transductie protocol28.
    1. Lysate voorbereiding
      1. Verdun een nachtelijke cultuur van Δpote in verse LB (1:100) aangevuld met 10-25 mm MgCl2,5mm CACL2en 0,1-0,2% glucose.
      2. Groei bij 37 °C gedurende 1-2 uur.
      3. Voeg 40 μL P1 faag lysaat toe aan de kweek en blijf groeien bij 37 °c. Monitor voor 1-3 h totdat de cultuur is gelativeerd
        Let op: wanneer de cultuur is lysed, cellulaire puin zal zichtbaar zijn in de buis en de cultuur zal een significant verlies van troebelheid.
      4. Voeg enkele druppels chloroform (50-100 μL) toe aan het lysaat en de Vortex. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 2 minuten om cellulair puin te verwijderen en breng de supernatant over naar een frisse buis.
    2. Transductie
      1. Kweek Δcadb -stam 's nachts in lb medium.
      2. Oogst de cellen door centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 2 minuten en respendeer in 1/5-1/3 het geoogste kweek volume in verse lb aangevuld met 100 mm MgSO4 en 5 mm CACL2.
      3. Voeg de celsuspensie δcadb toe aan de buis met faag uit stap 1.2.1.4 en meng snel.
      4. Voeg 200 μL van 1 M na citraat (pH 5.5) toe en voeg 1 mL LB. Inincuberen bij 37 °C gedurende 1 uur om de expressie van de antibiotica bestendige Marker toe te staan.
      5. Spin cellen bij 4000 x g gedurende 5 min.
      6. Respenderen in 100 μL LB supplemeted met 100 mM na-citraat (pH 5,5) en Vortex goed om cellen te dispergeren.
      7. Selecteer de recombinant stammen op lb agar platen met 50 μg/ml kanamycine en 10 μg/ml tetracycline en bevestig vervolgens met de polymerase kettingreactie (PCR) met geschikte primers26,27.
      8. Controleer de PCR-fragmenten op volgorde.

2. expressie van het doel-gen (AtBAT1) in E. coli Mutant

  1. Vergroot de volledige sequentie van het doel gen door PCR en insert in de gateway entry vector pENTR/D-TOPO29.
    Opmerking: In dit geval werd ATBAT 1.1 versterkt met behulp van voorwaartse primer 5 ' CGGCGATCAATCCTTTGTT en omgekeerde primer 5 ' GCTAAGAATGTTGGAGATGG, een initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 2 minuten en vervolgens 30 cycli denaturatie bij 98 °C gedurende 0,1 min, gloeien bij 59 °C voor 0,3 min, verlenging bij 72 °C gedurende 0,40 min en eind verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten. Het PCR-product werd gezuiverd met behulp van een PCR Cleanup Kit, gekwantificeerd met behulp van een spectrometer. De plaatsing van het PCR-product in de gateway vector gebeurde volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
    1. Transformeer de invoer vector in competente top10 E. coli cellen door hitte shock en selecteer voor succesvolle POKKEN op lb media met 50 μg/ml kanamycine volgende standaard moleculaire klonen protocollen30.
    2. Extract plasmide DNA met behulp van een plasmide extractie Kit, volgens de aanwijzingen van de fabrikant, en volgorde om te bevestigen dat de juiste inbrengen.
  2. Breng het doel-gen over naar de E. coli bestemmings vector, pbad-DEST49 door gateway LR klonen om een expressie Vector29te maken.
    1. Transformeer de expressie vector in competente top10 E. coli cellen door hitte Shock voor 30 s en selecteer succesvolle POKKEN op lb media met 100 μg/ml ampicillaire30.
    2. Extract plasmide DNA30 en volgorde om de juiste inbrengen te bevestigen.
  3. Transformeer de expressie vector in E. coli δpote740 (del):: kan, ΔcadB2231:: Tn10 en selecteer op lb-platen met ampicilline, kanamycine en tetracyclijn30.
  4. Om de optimale concentratie van arabinose voor inductie te bepalen, moet u het doel gen uitdrukken onder controle van de Arabad-promotor in lb media met gradiënt concentraties arabinose zoals beschreven29.
  5. Verzamel de celpellets en beoordeel de eiwit expressie door SDS-PAGE en visualisatie van eiwit bands zoals beschreven in de producthandleiding29.
    Opmerking: De E. coli δpote740 (del):: kan, ΔcadB2231:: Tn10 werd gebruikt als controlemonster zonder BAT1 expressie. E. coli dubbele knock-out Mutant cellen met de lege pbad-DEST49 vector werd niet gebruikt als een controle als gevolg van de aanwezigheid van het ccdb-gen in de vector.

3. generatie van binnenstebuiten membraan blaasjes

  1. Cultuur de E. coli Mutant cellen uitdrukken van het doelwit eiwit door het kweken van een enkele kolonie 's nachts in 5 ml van polyamine-vrije media (2% glycerol, 6 g van K2HPO4, 3 g van KH2po4, 0,5 g nacl, NH4cl, 50 mg thiamine, 0,79 g gist complete synthetische media adenine Hemisulfate (10 mg/L), l-arginine (50 mg/L), L-Aspartic acid (80 mg/l), l-histidine hydrochloride monohydraat (20 mg/l), l-Leucine (100 mg/L), L-lysine hydrochloride (50 mg/l), l-methionine (20 mg/l), L-fenylalanine (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-tryptofaan (50 mg/L), L-tyrosine (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), uracil (20 mg/L)). Overdracht van deze cultuur naar 500 mL polyamine-vrije media aangevuld met 0,0002% arabinose en groeien totdat de celcultuur bereikt een OD600 van 0.6-0.8 (meestal ~ 5 h).
  2. Verzamel de celpellet door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Respendeer de pellet en was driemaal met 0,1 M kaliumfosfaatbuffer, pH 6,6, bevattende 10 mM EDTA (buffer 1). Het uiteindelijke volume van de cellen in buffer 1 na de derde spin moet 10 mL zijn.
  3. Genereer binnenstebuiten membraan blaasjes door de Franse pers behandeling (10.000 p.s.i. clean) van de intacte cellen met een 35 mL Franse drukcel.
  4. Voordat u het monster in de standaard Franse drukcel laadt, smeert u de zuiger en O-ringen om het gemakkelijker te maken om in de cel in te voegen.
    Opmerking:Deze instructies zijn specifiek voor het gebruik van de standaard drukcel31.
    1. Schroef de afsluitplug voorzichtig in het onderste uiteinde van de cel. Zorg ervoor dat de cel rechts naar boven is gebaseerd op het opschrift aan de zijkant van de cel. Plaats de zuiger in de cel en verplaats deze naar de cel totdat de maximale vullijn op de zuiger de bovenkant van de zuiger bereikt. Draai het apparaat om en plaats het op de meegeleverde stand tussen de drie palen.
    2. Giet de celsuspensie in het lichaam van de cel.
      Opmerking: We gebruiken slechts 10 mL, dus er zal voldoende ruimte zijn in de Franse drukcel kamer, die een capaciteit heeft van 35 mL.
    3. Monteer de standaarddrukcel op de Franse drukcel eenheid.
      1. Controleer eerst of de stroom is uitgeschakeld. Aan de linkerzijde van het paneel is de ratio keuze schakelaar. Het heeft drie standen: omlaag aan het einde van de run, laag voor het gebruik van een kleinere Drukcel, en hoog voor gebruik met de standaard Franse drukcel. Als de Franse pers eerder met de kleinere cel werd gebruikt, is de zuiger mogelijk niet volledig teruggetrokken. Stel deze schakelaar in op omlaag.
    4. Zet de machine aan met de schakelaar op de RHS aan de achterzijde van het apparaat en zet de schakelaar op de Start stand. Hierdoor wordt de zuiger volledig teruggetrokken. Verplaats de schakelaar terug naar pauzeen sluit de machine uit.
    5. Draai de duimschroeven los en beweeg de Veiligheidsklem die zich uitstrekt tot twee roestvrijstalen kolommen aan de zijkant. Het zal naar rechts slingeren. Met één hand de basis van de sluit plug op zijn plaats te houden, kies de Franse drukcel omhoog met beide handen, en draai het 180 °, dus de zuiger is nu in de rechtopstaande positie. Zet het op het platform en beweeg de Veiligheidsklem weer op zijn plaats zodat deze klem de Franse drukcel in positie houdt.
    6. Opmerking de stroom ventiel montage op de sluit plug moet toegankelijk zijn voor de Operater en gepositioneerd zodat de klep vrij kan worden gedraaid. Open de stroom klep eenheid met een paar linksom bochten. Plaats de armen van de zuiger zodanig dat deze op een positie van twee uur en acht uur zijn gericht. Draai de duimen schroeven aan zodat de standaard drukcel op zijn plaats wordt gehouden.
    7. Steek de uitlaatbuis in de sluit Plug en sluit een kort stukje flexibele slang aan zodat het gebroken celvuil in een Falcon Tube kan worden opgevangen. We gebruiken meestal een ijsgevuld bekerglas van 300 mL om de Falcon Tube rechtop te houden, en om de celresten gekoeld te houden.
    8. Zorg ervoor dat de pauze-run- schakelaar is ingesteld om te pauzerenen dat de klep eenheid in de open positiestaat. Zet de machine weer aan, browser de ratio selector schakelaar op hoog, en draai de Druk verhogings klep op het voorpaneel naar rechts over een halve bocht.
    9. De zuiger zal beginnen te stijgen van de basis om de lucht in de kamer te verplaatsen. Breng de lucht uit de Tygon-slang die aan de uitlaatbuis van het monster is bevestigd naar de buis in het bekerglas.
    10. Wanneer de eerste druppels vloeistof naar buiten komen, sluit u de stroom klep assemblage door deze rechtsom te draaien. Dit creëert een metalen tot metalen afdichting, met de drukcel, dus niet te strak aandraaien.
    11. De voorkant van de Franse pers heeft een grafiek op het voorpaneel om de juiste druk op de biologische cellen in de drukcel te genereren. Verhoog in dit geval de druk door de Druk verhogings klep rechtsom te draaien, totdat de meter 640 psi bereikt. Dit zal een interne druk van 10.000 psi creëren.
    12. Zodra de cel de doel druk heeft bereikt, opent u de stroom klep eenheid enigszins door deze linksom te draaien. Pas de opening van de klep aan om een debiet van slechts ongeveer 10 druppels per minuut toe te staan.
    13. Wanneer de stoplijn op de zuiger lichaam de bovenkant van de stroomcel bereikt. Schakel de Pauzeschakelaar uit om te pauzeren. Dit is van cruciaal belang omdat de zuiger die verder in de cel wordt geplaatst het apparaat beschadigt. Open de stroom klep assemblage en verzamel de resterende druppels.
    14. Schakel ratio-keuze schakelaar naar benedenen stel vervolgens de schakelaar pauze uitvoeren in op uitvoeren. Wanneer de bodemplaat volledig is ingetrokken, stelt u de Run -schakelaar in op onderbrekenen schakelt u de machine uit.
    15. Verwijder de Franse drukcel uit de Franse pers en Demonteer voor reiniging. Bewaar alle onderdelen droog met een lichte bekleding van glycerol. Verwijder en vervang eventuele pakkingen of afdichtingen met tekenen van slijtage.
  5. Verwijder ongebroken cellen en celresten van de Franse pers eluens door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Gooi de pellet weg en breng supernatant over naar ultracentrifuge tubes.
  6. Pelletmembraan blaasjes uit het resulterende supernatant door ultracentrifugationat 150.000 g voor 1 uur bij 4 °C.
  7. Was de membraan blaasjes eenmaal, zonder resuspensie, in 1 mM tris-maleaat, pH 5,2 met 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoethanol en 10% glycerol en respenderen in dezelfde buffer (buffer 2)23 met behulp van een dounce weefsel slijper. Normaalgesproken zou de membraan fractie uit 500 mL cultuur worden opgeschort in 5 mL buffer en een concentratie van 5-10 mg membraan proteïne/mL met behulp van de Biochininezuur assay32.
  8. Bewaar 100 μL aliquots van membraan preparaten bij-80 °C in micro centrifugebuizen van 1,5 mL.

4. Western Blot en oriëntatie van de transporter assay

  1. Wassen en respenderen blaasjes uit stap 3,7 in 30 mM tris pH 7,8 + 0,1 mM CoCl2.
  2. Tot 100 μL monsters, voeg 1 μL van 2 mg/mL carboxypeptidase A toe in 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.
  3. Inculate gedurende 20 min bij 20 °C. Stop de spijsvertering door 5 μL 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoethanol pH 7,5 toe te voegen.
  4. Om het enzym volledig te deactiveren, inbroed de oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Vesicles zonder de catboxypeptidase een behandeling werden gebruikt als een controle.
  5. Analyseer monsters door elektroforese in de aanwezigheid van lithium dodecyl sulfaat. Voeg 5-10 μL 150 mg/ml Lithium dodecylsulfaat, 450 mg/ml glycerol, 0,1 mg/ml broomfenolblauw, 0,4 M Tris pH 7,5 tot 100 μL monster toe.
  6. Voer immunoblotting uit door een nitrocellulose filter te leggen dat bevochtigd is met 25 mM natrium-waterstof fosfaat pH 7,5 op de polyacrylamidegel. Plaats deze tussen twee bevochtigde cellulose filters en tot slot tussen twee bevochtigde plastic schuur pads. Plaats deze assemblage tussen de elektroden van een kamer met 25 mM natrium-waterstof fosfaat pH 7,5 bij 2-4 °C.
  7. Laat Elektro overdracht van eiwitten om te gaan voor 3 h bij 20 V en 2-3 A.
  8. Blokkeer het nitrocellulose membraan 's nachts bij 2 °C in een blokkerende buffer van 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 en 0,5 mg/mL-tween 2033.
  9. Inbroed de nitrocellulose filter voor 2 h met een 1:5000 verdunning van anti-his (C-Terminal)-HRP-antilichaam in de blokkerende buffer (20 mL) en spoel tweemaal met 50 mL buffer voor een totaal van 60 min.
  10. Om de immunoblot te visualiseren, los 6 mg 4-Chloro-1-naftol op in 20 mL gedenatureerde alcohol en voeg 80 mL 15 mM tris pH 7,5 en 50 μL van 30% H2O2toe. Het filterpapier in de substraat oplossing gedurende 20 minuten Baden. Het reagens zal reageren met het antilichaam om een blauwe neerslag op het nitrocellulose membraan te vormen. Wanneer voldoende kleur is ontwikkeld, spoel het membraan met water, en laat drogen.

5. transport assay

  1. Incuberen 100 μL aliquots van membraan blaasjes bij 12 °C gedurende 5 minuten.
  2. Start het transport door van polyaminen toe te voegen aan de membraan blaasjes met een eindconcentratie van 50 μM (tenzij anders vermeld). Maak 3H-substraat oplossingen (spermidine of putrescine) in een test buffer bestaande uit 10 mm tris-HCl, 10 mm kalium fosfaat, pH 8,0 en 0,14 M KCl23 (buffer 3) met wijzigingen afhankelijk van de test.
  3. Voer transport testen uit gedurende 1 minuut bij 12 °C in 1,5 mL microfugebuis buizen.
  4. Breng na 1 minuut de reactie mengsels over naar het filtratie spruitstuk en filtreer door een 0,45 μm nitrocellulose membraanfilter.
    1. Voeg 3 ml ijskoude assay buffer met een 10-voudige hogere concentratie van niet-gelabelde polyaminen toe, gevolgd door 3 ml test buffer zonder de polyaminen om niet-specifieke binding te verminderen.
    2. Breng de gewassen filters over naar 20 ml wegwerp-Scintillatie flesjes met 10 ml scintillatievloeistof en bepaal de radioactiviteit met behulp van een vloeibare Scintillatie teller. De Scintillatie teller meet de radioactiviteit in het monster en rapporteert deze als desintegraties per min (DPM).
  5. Bereken de netto polyamine opname als het verschil tussen de opname op 1 min door blaasjes geïnineerd bij 12 °c en opname op 0 min door blaasjes geïnineerd op ijs.
    Opmerking: De massa van de substraat die in de blaasjes wordt geïmporteerd, wordt als volgt berekend. Als het monstervolume in de microfugebuis buis 0,2 μL is en de uitgangs concentratie van het substraat 100 μM is, dan is de totale massa van het substraat in de microfugebuis buis 20 x 10-12 M. Vanwege de zeer hoge specifieke activiteit van commercieel gelabelde substraten (vaak 2,22 x 109 DPM/mm) de massa van de toegevoegde isotoop kan worden genegeerd in de berekening. Dus als de totale hoeveelheid isotoop die werd toegevoegd aan de microfugebuis buis was 100 x 106 DPM en de blaasjes had een netto-opname van 1.000 DPM, dan was de totale massa van substraat overgenomen door de blaasjes was 1% van het totale aantal mollen van substraat of 2 x 10-13 M.
    1. Bepaal Km voor de ondergrond door de opname te meten van 10, 25, 50, 250 en 500 μM van substraat in blaasjes die het doeleiwit uitdrukken. Bereken Michaelis-Menten kinetiek met een niet-lineaire regressiemethode met behulp van het Michaelis Menton-model van het statistisch softwarepakket34.
  6. Voeg voor de wedstrijd experimenten 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM of 2 mM niet-gelabeld concurrerend substraat in de test buffer toe aan de 1,5 mL micro centrifugebuis met 100 μL blaasjes bij 12 °C.
    1. Voeg tegelijkertijd van polyamine (50 μM) toe aan de microcentrifuge buis.
    2. Meet radioactiviteit gevangen in blaasjes zoals hierboven vermeld door stap 5 tot en met 5.4.2 te herhalen.
    3. Bepaal de schijnbare km (km, app) voor de concurrerende substraten door de opname te meten van 10, 25, 50, 250 en 500 μm van polyaminen in aanwezigheid van 100 μM of hoger niet-gelabeld substraat en met behulp van een niet-lineaire regressiemethode om de curve te tekenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De belangrijkste stappen in dit protocol worden op pictoriaal samengevat in Figuur 1. Kort, E. coli cellen gebrekkig in alle polyamine wisselaars en uitdrukken van AtBAT1 worden gekweekt, gecentrifugeerd, gewassen met een buffer en onderworpen aan cel lysis met behulp van een Franse pers. Lysis heeft de neiging om blaasjes te produceren die meestal binnenstebuiten zijn en de buffer buiten de cellen overvullen. Celpuin wordt verwijderd door c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de huidige studie schetsen we een methode voor de karakterisering van een antiporter door eerst het eiwit in E. coli uit te drukken en vervolgens membraan blaasjes te genereren, zodat het heterologously uitgedrukte eiwit kan worden getest in een cel-vrij systeem. Naast de apparatuur die in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie wordt aangetroffen, vereist deze strategie het gebruik van een Franse pers, een ultracentrifuge, en toegang tot een faciliteit voor het uitvoeren van radio-isotopen testen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondersteuning voor dit project kwam van de BGSU Graduate College, en de BGSU Office van gesponsorde Programma's en onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3H-putrescinePerkinElmerNET185001MC
3H-spermidinePerkinElmerNET522001MC
4-chloro-1-naphtholSigma-AldrichC8890
14C arginineMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibodyThermoFisherR931-25Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BCA protein assay kitThermoFisher23227Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blueBio-Rad161-0404
Carboxypeptidase BSigma-AldrichC9584-1mg
CentrifugeSorvallSS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinderLabGenome7777-7Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275scintillation cocktail
EDTASigma-Aldrich
Filtration manifoldHoeferFH225V
French Pressure CellGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
GlutamateSigma-AldrichG6904
Glycerol
GraphPad Prism softwarehttp://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxideKROGER
Potassium ChlorideJ.T. Baker3040-01
Liquid scintillation counterBeckmanLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
Nitrocellulose membrane filtersMerck Milliporehawp025000.45 µM
PCR clean up kitGenscriptQuickClean II
Potassium Phosphate dibasicThermoFisherP290-500
putrescinefluka32810
Potassium Phosphate monobasicJ.T.Baker4008
SpermidineSigma-aldrichS2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10This manuscriptAvailable upon request.Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-baseResearch ProductsT60040-1000
UltracentrifugeSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubesThermoFisher45237Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway expression vector for E. coli

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191(2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).
  29. Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory Manual. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  31. GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).
  32. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  33. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  34. PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).
  35. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  36. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  37. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  38. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  39. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  40. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  41. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  42. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  43. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

French pressultracentrifugatiemembraanfiltratie assaysubstraatspecificiteitWestern blottransportassay

Gerelateerde artikelen