Verwerking van embryo-, eierschaal-en schimmel cultuur voor het scannen van elektronenmicroscopie

Samenvatting

Hier presenteren we gedetailleerde verwerkingsprotocollen voor Imaging delicate weefselmonsters met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Drie verschillende verwerkingsmethoden, namelijk hexamethyl disilazana (HMDS) chemisch drogen, eenvoudige lucht drogen en het drogen van kritische punten worden beschreven voor het bereiden van stijve eierschalen, embryo's in vroege ontwikkelingsstadia en schimmel culturen respectievelijk.

Samenvatting

Hoewel Scanning elektronenmicroscopie (SEM) op grote schaal wordt gebruikt voor de ultra-structurele analyse van verschillende biologische en niet-biologische monsters, omvatten de methoden die betrokken zijn bij de verwerking van verschillende biologische monsters unieke praktijken. Alle conventionele praktijken beschreven in de literatuur voor het verwerken van monsters nog steeds nuttige toepassingen, maar subtiele veranderingen in de monstervoorbereiding kunnen de beeldkwaliteit veranderen, evenals, introduceren artefacten. Daarom is het gebruik van een unieke monster voorbereidings techniek specifiek voor het type weefsel geanalyseerd nodig om een beeld van goede kwaliteit te verkrijgen met een ultrastructurele resolutie. De focus van deze studie is het bieden van de optimale monster voorbereidings protocollen voorbeeld vormende embryo's, stijve eierschalen en schimmel culturen met SEM. De volgende optimalisaties werden aanbevolen om goede resultaten te opleveren voor de drie verschillende onderzochte delicate biologische monsters. Het gebruik van mildere Fixatieven zoals 4% Paraformaldehyde of 3% Glutaaraldehyde gevolgd door uitdroging met ethanol serie is verplicht. Schimmel mycelium op agar-blokken verkregen door diaculturen levert een betere ultrastructurele integriteit op in vergelijking met culturen die rechtstreeks uit agar-platen worden genomen. Chemisch drogen van embryo's met HMDS zorgt voor droging zonder oppervlaktespanning artefacten te introduceren in vergelijking met kritische punt droging. HMDS voorkomt barsten veroorzaakt door krimp omdat monsters minder broos zijn tijdens het drogen. Voor de schimmel cultuur zorgt het drogen van kritische punten echter voor een acceptabele beeldkwaliteit in vergelijking met chemisch drogen. Eierschalen kunnen worden afgebeeld zonder speciale voorbereidingsstappen, behalve voor grondig wassen en drogen van de lucht voorafgaand aan de montage. Voorbereidings methodieken werden gestandaardiseerd op basis van aanvaardbare beeldkwaliteit verkregen bij elke proef.

Inleiding

Scanning elektronen microscoop (SEM) ultrastructurele analyse en intracellulaire Imaging supplement Lichtmicroscopie voor driedimensionale profilering van prokaryoten, planten en dieren. De hoge ruimtelijke resolutie van een SEM maakt het een van de meest veelzijdige en krachtige technieken die beschikbaar zijn voor het onderzoeken van microstructurele kenmerken van specimens op de nanometer tot micrometer schaal. Gedroogde specimens worden herleid tot samenstellings-en topografische structuren met intense Details, die de basis vormen voor het ontwikkelen van geldige conclusies over functionele relaties^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. bij het INTERPRETEREN van SEM-afbeeldingen van biologische specimens, is het een grote uitdaging om onderscheid te maken tussen inheemse structuren en de artefacten die tijdens de verwerking worden gemaakt. SEM wordt over het algemeen gebruikt bij zeer hoge stofzuigers om interferentie te voorkomen van gasmoleculen die de primaire, secundaire of backverstrooide elektronenstralen van het monster^10,11aantasten. Ook zijn biologische materialen vatbaar voor stralings schade door hun slechte of niet-geleidende eigenschappen. Het is van essentieel belang dat de in het SEM geladen specimens volledig droog zijn en vrij zijn van organische verontreinigingen om eventuele Uitgassen in een hoge vacuüm omgeving van^10,11te elimineren. Aangezien biologische specimens meestal uit water bestaan, zijn er aanvullende preparatieve technieken nodig om ervoor te zorgen dat de inheemse structuren behouden blijven.

De verkregen resolutie is gebaseerd op het optimaliseren van bereidingsmethoden specifiek voor specimen types en instrumentale parameters gebruikt. Dus, is het noodzakelijk om te voorkomen dat het gebruik van gegeneraliseerde verwerkingsstappen voor alle weefsel typen. Sommige biologische specimens vereisen minder strenge verwerking om hun structuur te behouden, terwijl er meer tijd en zorg nodig kan zijn voor delicate soorten monsters om de invoering van droog artefacten, zoals krimp en ineenstorting, te voorkomen. Monstervoorbereiding is een cruciale stap in SEM-beeldvorming; de bevindingen van Morfometrische studies zijn opmerkelijk beïnvloed door preparaat bereidings procedures^12,13. Veelgebruikte voorbereidingsstappen voor veel biologische monsters zijn fixatie, uitdroging en coating met een metaal zoals goud, platina of Palladium om hun oppervlakken te converteren naar geleidende voor SEM-analyse. De aard en combinatie van de gebruikte stappen zal variëren afhankelijk van het type van het weefsel, en de specifieke doelstellingen van de studie. De opbouw van de lading, gevoeligheid voor vacuüm-en elektronenstraal schade vormen problemen bij het verwerken van zachte delicate biologische monsters, wat extra verwerkingsstappen vereist om de inheemse structuur van het object te behouden. Met behulp van conventionele methoden zoals osmium tetroxide Fixing, en uitdroging veroorzaken krimp en de ineenstorting van delicate weefsels^14,15,16,17. Het doel van de studie is het opzetten van elegante methodologieën die zijn afgeleid door het combineren van ideeën uit eerdere studies met aanpassingen om zachte delicate weefsels voor te bereiden en te maken (bijv. reptielen embryo's, eierschalen van geschilderde schildpadden en schimmel culturen).

Selectie van een geschikte bevestigingsmethode is de eerste belangrijkste stap voor microscopische analyse van biologische specimens. Het is essentieel om de weefsels onmiddellijk na het isoleren van een organisme te fixeren om veranderingen in hun morfologie als gevolg van ontleding te voorkomen. Een effectieve fixatie moet cellulaire processen beëindigen door de cellen snel te doordringen en het effect onomkeerbaar te houden om de structuur van het monster te stabiliseren om zowel de volgende verwerkingsstappen te weerstaan als het onderzoek onder de SEM^{17 , 18}. Hoewel verschillende chemische en fysische fixatie methoden bekend zijn, wordt chemische fixatie vaker gebruikt voor biologische specimens om cellulaire veranderingen als gevolg van autolyse, putrefactie en droog effecten te voorkomen. Er zijn talrijke fixatieve chemische formuleringen besproken in de literatuur^{17,19,20,21,22,23}, fixeermiddelen die werken door denaturering en stolling van biologische macromoleculen, en die die repareren door covalent cross-linking macromoleculen. Alcoholen worden gebruikt als denaturerende fixeermiddelen die ultra structuur zeer slecht behouden en worden meestal gebruikt voor lichte microscopie en niet aanbevolen voor elektronen microscopische analyse. Kruislings verbindende Fixatieven zoals formaldehyde, glutaraldehyde en osmium tetroxide creëren intermoleculaire en intramoleculaire crosslinking tussen macromoleculen binnen de weefsels, wat een uitstekend behoud van ultra-structuren oplevert^{11 ,24,25,26}. Biologische monsters zijn gevoelig voor temperatuur. De temperatuur aan het begin van de fixatie wordt aanbevolen om 4 °C te zijn om de laterale mobiliteit van membraan proteïnen te verminderen, om de diffusie van intercellulaire moleculen te vertragen en om de snelheid van fixatie te vertragen¹¹. De tijd die nodig is voor de vaststelling van weefsels hangt grotendeels af van de grootte van het monster en de snelheid waarmee de fixatie diffitert en reageert met de componenten van het preparaat. Een overnachting fixatie in 4% Paraformaldehyde of 3% Glutaaraldehyde in PBS bij 4 °C is de voorkeursmethode voor SEM-analyse van specimens die in deze studie worden gebruikt voor hun sequentiële penetratieve eigenschappen, waardoor kleinere delicate monsters kunnen worden verwerkt^{17 , 18 , 19 , 20 , 27}. een post-fixatie stap met osmium tetroxide wordt niet alleen geëlimineerd vanwege zijn toxische aard, maar heeft ook tot gevolg dat er geen bijkomend voordeel wordt toegepast om de beeldkwaliteit te verbeteren voor de monsters die in deze studie worden geanalyseerd.

Biologische monsters bevatten vloeistoffen die interfereren met de SEM-werking; Vandaar dat de monsters moeten worden gedroogd voordat ze in de SEM-monsterkamer worden ingevoegd. Zodra uitdroging is verzekerd, moet het oplosmiddel uit het weefsel worden verwijderd zonder artefacten in de specimens te maken vanwege de oppervlaktespanning/droging. Drie verschillende droog methoden werden vaak gebruikt tijdens het verwerken van weefsels voor SEM-beeldvorming: luchtdroging, het drogen van kritische punten en vriesdrogen monsters^28,29,30,31. Weinig studies rapporteren alle drie droog methoden die identieke resultaten produceren met dierlijk weefselmonsters^28,29,30,31. Een algemene praktijk die voor kleinere specimens wordt gebruikt, zijn chemische uitdroging door oplopende concentratie Series alcohol en Hexamethyldisilazaan (HMD'S), maar grotere specimens worden gedroogd met behulp van een kritisch punt drogen (CPD) instrument³². Tijdens het droogproces worden aanzienlijke krachten gevormd in kleine holten die door een vloeistof/gasinterface door het preparaat worden doorgegeven; Dit kan zelfs leiden tot een volledige ineenstorting van de holle structuren³³. Elke vervorming die optreedt als gevolg van de behandeling kan dan worden verward als een native structureel kenmerk van het preparaat. Zo moet het gegeneraliseerde fenomeen voor de verwerking worden geëlimineerd en moet een uniek droogproces worden gestandaardiseerd voor elk type weefsel, vooral wanneer delicate weefselmonsters worden geanalyseerd.

In verschillende proeven uitgevoerd met behulp van verschillende combinaties van alle bovengenoemde processen, we gestandaardiseerd de methoden die kunnen worden gebruikt voor SEM analyse van drie delicate weefsels: reptielen embryo's, eierschalen van geschilderde schildpadden, en schimmel culturen. Ontwikkelingsbiologen en morfologen beschrijven normale en abnormale morfogenese tijdens de ontwikkeling van embryo's bij representatieve gewervelde dieren. Onderzoeken naar gensignalerings trajecten hangen af van de morfologische beschrijving van nieuwe structuren. Om een abrupte verandering in de gewervelde embryo structuur te voorkomen tijdens SEM-analyse, raden we aan chemisch drogen na uitdroging. Chemisch drogen met HMDS is de relatief nieuwste droogmethode en de voordelen zijn relatieve snelheid, gebruiksgemak, verloren kosten en de beperkte expertise en uitrusting die nodig is⁹. CPD is een veelgebruikte droogtechniek met behulp van afdraaien co₂ over de specimens bij een specifieke temperatuur en druk. We identificeerden dat HMDS geschikt is voor het drogen van zachte delicate weefsels en maakt het mogelijk grotere monsters te verwerken in vergelijking met kritische punt droging, wat een uitgebreide vervorming van embryonale weefsels veroorzaakte. Er zijn verschillende methoden gebruikt om monsters voor SEM-beeldvorming voor te bereiden om de morfologische kenmerken van schimmels³⁴te bestuderen. Schimmel preparaten worden vaak vastgesteld in osmium tetroxide, gevolgd door ethanol uitdroging en kritische punt droging, wat bevredigende resultaten kan opleveren, hoewel de toxische effecten van osmium tetroxide^6,7,35 en het verliezen van schimmel materialen terwijl het veranderen van oplossingen tijdens de verwerking zijn uitgesproken nadelen. De monster bereidingstechniek met behulp van lucht drogen zonder fixatie is ook beoefend³⁶ maar resulteert in gekrompen en ingeklapte structuren, en observatie van dergelijke specimens kan gemakkelijk worden geïnterpreteerd terwijl het karakteriseren van de soort. Schimmel hypha verliest zijn integriteit in contact met vloeistoffen en een gelijkmatige droging kan niet worden bereikt om de structuur te herstellen. Als gevolg van dit effect, vriesdrogen wordt vaak gebruikt voor het drogen van zachte weefsels zoals schimmel mycelium. Vriesdrogen werkt goed voor schone materialen, maar de aanwezigheid van zouten of secretie zal het oppervlak detail dat alleen in de SEM-kijk fase zal worden geïdentificeerd, verhullen. We koppelden de Slide Culture Method met Glutaaraldehyde bevestiging en kritische punt droging om structurele details van intacte schimmel schimmeldraden en sporen te geven. Hoewel het drogen van CPD veroorzaakt krimp in embryo's, resulteerde het in goed bewaard gebleven myceliële structuren in combinatie met Glutaaraldehyde fixatie. De eierschaal is van primair belang voor het embryo van ovipareuze dieren door niet alleen als beschermende bekleding te fungeren, maar ook mechanische stabiliteit, permeabiliteit aan gas en water, en een calcium reserve voor het zich ontwikkelende embryo te bieden. Zoet waterschildpad eierschalen worden geclassificeerd als "rigide" op basis van hun structuur, en vanwege hun beschikbaarheid hebben aanzienlijke aandacht gekregen van biologen^{1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38}.

We detail eenvoudige methoden voor eenvoudig onderzoek van de eierschaal en shell membranen van geschilderde schildpad die kan worden toegepast op elke stijve eierschaal soorten. Voorbereidings methoden werden geëvalueerd op basis van de resulterende beeldkwaliteit en verminderde potentiële artefacten.

Protocol

Opmerking: geschilderde schildpad (Chrysemys picta) eieren gebruikt in deze studie werden verzameld tijdens het broedseizoen van mei tot en met 2015-16 juni van Rice Creek Field Station, Oswego New York met toestemming verkregen van de New York staat ministerie van milieu Instandhouding (DEC).

1. chemische droogmethode voor het verwerken van embryo's voor SEM

1. Verzamel schildpadeieren van veld plaatsen tijdens het broedseizoen. Maak de incubatie kamers vooraf klaar, gemaakt van plastic dozen met deksels (L x b x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm gevuld met strooisel medium, bereid met een vochtig mengsel van vermiculiet en turf mos (1:1 verhouding). Maak 4-6 gaten van ongeveer 0,25 cm langs de zijkanten van de dozen en op het deksel om beluchting mogelijk te maken.
2. Verwijder voorzichtig de aarde van het nest om de eieren te onthullen. Veeg het oppervlak van schildpadeieren met verdunde jodium tinctuur (1:25000) om microbiële besmetting te beheersen tijdens de incubatie. Plaats de klauwen gescheiden van elkaar, koppelings grootte van geschilderde schildpad kan variëren van 5-9 eieren en plaats een maximum van 8-9 eieren per doos.
   Let op: zorgvuldig omgaan met de eieren tijdens het verzamelen, vegen, labelen en plaatsen in de dozen. De positie en de uitlijning van de eieren moeten dezelfde zijn als ze werden gelegd, elke beweging zal de embryonale ontwikkeling remmen.
3. Leg de eieren met de helft in het strooisel, dek af en plaats de doos in de incubator op 30 °C. Incuberen de eieren gedurende 10-17 dagen om de embryonale stadia 12, 13 en 18 te verkrijgen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Voeg om de andere dag gedestilleerd water toe om het strooisel medium deels nat te maken om uitdroging te voorkomen en het vochtgehalte voor de normale ontwikkeling van de embryo's te handhaven.
   Opmerking: incubatie-en faserings embryo's zijn volgens een volledige ontwikkelings tabel die eerder is gepubliceerd³⁹.
4. Bevestig de embryo's door de eerste snede aan de ene kant van de rugeier en het dooier membraan samen te maken, verticaal naar de lange as met een puntige schaar. Steek de schaar voorzichtig in de dooier om te voorkomen dat de embryonale schijf wordt snijden. Snijd nu de laterale zijde van de Egg langs de lange as en snijd vervolgens de andere kant van de Egg langs de korte as.
5. Pel het uitgesneden stuk met de embryo zijde omhoog met behulp van een tang. Snijd de andere laterale zijde van de eierschaal en plaats het uitgesneden stuk in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS bij een pH van 7,4).
   Let op: het schildpad ei is gevuld met zeer viskeuze eigeel en de rugzijde van het embryo houdt zich aan het eierschaal membraan. Het eierschaal membraan in de buurt van het embryo verandert met de incubatie van doorschijnend wit tot een ondoorzichtig, krijtachtig wit. Dit maakt het mogelijk om het embryo te lokaliseren in het midden van de lange as en te worden gezien als een donkere verkalkte vlek van de buitenkant^40,41.
6. Gebruik een stereomicroscoop om de embryo's samen met het dooiermembraan te isoleren door ze uit de eierschaal te schillen met behulp van een tang. Verwijder extra-embryonale membranen met behulp van een tang en een micro-schaar. Breng het embryo met behulp van een embryo lepel naar verse PBS in een Petri schaaltje om een bloed of dooier te wassen.
7. Gebruik duidelijke 12-well platen om de embryo's 's nachts op te lossen in 4% Paraformaldehyde in PBS bij 4 °C of in 2-3% Glutaaraldehyde in PBS. Plaats één tot drie embryo's in elke put, afhankelijk van de grootte van de embryo's. Zorg voor een volledige infiltratie (monsters zullen wit verschijnen) voor oudere embryo's door verlenging van de fixatietijd gedurende 2-3 dagen. Spoel embryo's 3x met verse PBS gedurende 5 min. elke spoeling.
   Opmerking: Vermijd beschadiging van het oppervlak van het embryo door gebruik te maken van polystyreen wisselplaten met polyester gaas bodems voor 12-well platen om specimens van het ene oplosmiddel naar het andere over te brengen.
8. Dehydraat monsters met een reeks ethanol concentratie in gedistilleerd water: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% en 100% en behandel monsters voor 1 uur in elke dehydratie oplossing. Herhaal de stap met 100% ethanol tweemaal om volledige uitdroging te garanderen. Als het niet onmiddellijk wordt gebruikt, bewaar monsters in 70% ethanol bij-20 °C gedurende een langere periode.
9. Droge embryo's met een reeks hexamethyldisilazana (HMDS) tot 100% ethanol concentratie: 1:2, 2:1 en 100%. Laat de monsters gedurende 20 minuten in elke oplossing liggen en houd de Petri schaal gedeeltelijk bedekt tijdens het proces.
   Opmerking: Voer alle stappen met betrekking tot hmdd's in de rook afzuigkap uit met de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen, aangezien HMDS zeer giftig is.
10. Laat de embryo's in de uiteindelijke 100% HMDS-oplossing volledig of gedeeltelijk in een rook afzuigkap vallen, 's nachts in de verdamping van HMDS, waardoor monsters klaar zijn voor montage en sputteren coating. Dek de schaal af om stof te elimineren die over de monsters komt.
    Opmerking: het weefsel zal wit verschijnen na het volledig drogen en gedeeltelijk gedroogde monsters zullen er geel uitzien in kleur, laat deze weefsels in de rook afzuigkap voor een langere tijd.
11. Kies de grootte van aluminium en Carbon plakband per grootte van het geanalyseerde monster. Monteer de gedroogde monsters zorgvuldig op een standaard aluminium PIN stub (12,7 mm x 8 mm) met behulp van dubbele stok Carbon geleidende tape (12 mm).
12. Introduceer gemonteerde monsters in de kamer van de sputteren coater om het specimen met een zeer dunne film goud te Coat om het laad effect te elimineren. Gouden plaat de specimens voor 60-120 s bij een 35 mA sputter.
13. Bevestig de boktor aan de bijbehorende poriën platen door de schroeven stevig aan te bevestigen. Breng de monsterhouder in of uit de bemonsterings kamer van SEM met behulp van het monster uitwisselings gereedschap. Beeld de monsters in hoge vacuümstand met een versnelde bundel spanning van 10 kV en emissie stroom 10 μA.
    Let op: Draag altijd handschoenen tijdens het hanteren van samples, samplehouders, montage materiaal en overdrachts gereedschappen om vetvervuiling van handen naar het SEM-systeem te voorkomen.
14. Test alternatieve technieken die hieronder worden opgesomd om de resolutie te vergelijken van specimens die van de bovenstaande procedure zijn verkregen.
    1. Een post-fixatie met 1% osmium tetroxide voor 1 uur bij kamertemperatuur na stap 1,7 opnemen.
    2. Gedeeltelijk of volledig verwijderen van de HMDS bij stap 1,10 voor snelle snelle verdamping van hmd's.
    3. Verwerk embryo's na stap 1,8 met behulp van kritische punt droging (CPD) door stappen 3.3-3.4 te volgen.

2. bereiding van de eierschaal voor SEM met behulp van een luchtdroog methode

1. Verzamel en broed de geschilderde schildpad (Chrysemys picta) eieren om de embryo's op te lossen zoals aangegeven in de stappen 1.1-1.7.
2. Bewaar eierschalen in gedistilleerd water na embryo fixatie in stap 2,1. Reinig de eierschalen grondig door gedurende ten minste 1 uur in gedistilleerd water te weken om de verontreiniging van dooier en albumine te elimineren.
3. Lucht-droge eierschalen na het wassen op delicate Antistatische doekjes in de rook afzuigkap 's nachts. Bewaar gedroogde eierschalen in schone specimen flessen gelabeld op nummer en podium.
4. Monteer, sputteren vacht en afbeelding de specimens door de stappen te volgen die zijn gespecificeerd in stappen 1.11-1.13.

3. drogings methode met kritische punt voor de bereiding van schimmel culturen voor SEM

1. Diaculturen instellen
   1. Prepareren van aardappeldextrose agar (PDA) media voor schimmel culturen: Voeg 39 g PDA-vermogen toe in 1 L gedestilleerd water in een erlenmeyer kolf. Meng goed door de kolf te zwengelen en de media gedurende 30 minuten op 121 °C te autoclaven. laat de media oplossing afkoelen en voeg vervolgens het antibioticum chlooramfenicol (25 μg/mL) toe met een steriele micro pipet.
      Opmerking: na sterilisatie moet de agar-oplossing heet zijn en zal deze niet snel stollen. Koel het voldoende af zodat het de antibiotica niet zal inactiveren.
   2. Meng het door wervelende en giet platen (ongeveer 10-12 mL van de media voor elke 10 cm Petri schaaltje), voorzichtig stapelen en laten stollen.
   3. Gebruik een steriel scalpel blad om kleine blokken agar te knippen van 1/2 tot 3/4 van een inch. Verwijder en plaats een agar-blok op een schone glazen Microscoop-dia.
   4. Plaats de glijbaan in een schone Petri schaal om verontreiniging te voorkomen en vocht te bewaren tijdens de incubatie.
   5. Verhoog de glijbaan van de bodem van de Petri schaal met behulp van een steriele tandenstoker om de oppervlaktespanning tussen de plaat en de glijbaan te creëren om de glazen glijbaan te verwijderen zonder de delicate groei na incubatie te verstoren.
   6. Gebruik een steriele lus of een naald om enkele schimmels van het preparaat-entmateriaal over te brengen naar elk van de vier zijden van het agar-blok op de glijbaan.
   7. Plaats een schone dekslip op het oppervlak van het agar-blok na de inoculatie. Voeg een paar druppels steriel gedestilleerd water toe aan de Petri schaal rond de glijbaan om vocht te verzekeren voor de groeiende schimmels.
   8. Sluit de plaat gedeeltelijk af met behulp van paraffine folie en inbroed de plaat op 30 °C gedurende een passende tijdsduur (voor Fusarium -soorten die voor 36 tot 48 uur worden geïnininend).
   9. Verwijder de glijbaan van de Petri schaal en scheid de strak vastgehouden dekslip van het agar-blok met een steriele Tang. Bevestig de agar-blokken in 3% Glutaaraldehyde in PBS 's nachts bij 4 °C.
2. Dehydraat de monsters door een ethanol serie te passeren: 10%, 25%, 50%, 75% en 90% met 15 min per verandering. Verwerk de monsters voor de uiteindelijke uitdroging met twee veranderingen in 100% ethanol van 30 minuten per stuk om volledige verzadiging te garanderen.
3. Drogen van kritische punten: plaats gedehydrateerde monsters in de kamer van het CPD-apparaat. Seal en koel de kamer door het openen van de kleppen om vloeistof CO₂ in en ventilatie ethanol uit, totdat vloeistof co₂ volledig vult de kamer.
   1. Seal en verwarm de kamer langzaam om een kritisch punt te bereiken wanneer de druk van de kamer hoger is dan 1000 psi en de temperatuur hoger is dan 31 °C, is de vloeibare en gasfase van CO₂ in evenwicht. Giet langzaam de CO₂ uit de kamer en het monster als gas om effecten van oppervlaktespanning te voorkomen.
4. Voer montage, goud plating en beeldvorming uit op de specimens door de stappen te volgen die zijn gespecificeerd in stappen 1.11-1.13.
5. Voer vergelijkende analyse uit door de specimens chemisch te drogen van stap 3,2 met behulp van HMDS door stappen 1.9-1.13 te volgen.

Resultaten

Figuur 1 Toon scanning elektronen micrografische analyse van geschilderde schildpad (Chrysemys picta) embryo's. Geschilderde schildpadeieren verzameld en geïnineerd op een strooisel medium, gemonteerd op aluminiumfolie na chemisch drogen werden gebruikt voor SEM-beeldvorming (Figuur 1a-E). Een zijaanzicht van een fase 12 embryo toont de craniofaciale structuren; maxillaire prominentie strekt zich verder uit dan de mandibulaire en beperk...

Discussie

In onze studie werden verschillende fixatie middelen, uitdroging en droog methoden getest om drie verschillende delicate biologische monsters voor SEM-beeldvorming te bereiden: embryo's, eierschalen en schimmel culturen. SEM wordt vaak gebruikt voor oppervlakte analyse, dus fixatieve penetratie is minder van kracht, maar het moet duidelijk zijn dat slecht vaste interne structuren tot in-en inklapende Oppervlaktestructuren zullen leiden. Verlengde fixatietijd moet ook worden overwogen voor grotere weefselmonsters, waarbij...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	Fischer Scientific	S25127A	voor kweekjes op glijbanen
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12,7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media voor isolatie en cultivatie van schimmels, gisten en schimmels
Chloramfenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibioticum voor media
Grof Vermiculiet	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedmedium
Duidelijke 12-putjesplaat	Corning	07-201-589	voor het fixeren van embryo's
Dekglasjes	Fischer Scientific	S17525B	voor kweekjes op glijbanen
Kritisch puntdroger	Quorum CPD	EMS850	drogen op kritisch punt
Kweekschalen	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	uitdrogingsmiddel
Forceps- Aquarius Pincet	Tedpella	5804	stijl 4, lengte 108mm, breedte x dikte 0,017 x 0,17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixeermiddel
Gouddoelwit voor sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gouddoelwit, 2,375″ D X.002″
Hexamethyldisilazane	Fischer Scientific	C19479-5000	chemisch droogmiddel
Kim doekjes	Kimtech	S-8115	reiniging
Microscoopglaasjes	Thermo Scientific	67-762-16	voor kweekjes op glijbanen
Microscoopschaar	Tedpella	1327	Dubbelspits, roestvrij staal, 100 mm L (3-5/8").
Microschaar	Tedpella	1346	Vannas-type, recht, 80mm L
Moria Geperforeerde Embryolepel	Fine Science Tools	10370-17	Lengte 14,5 cm, tipdiameter 20 mm, lepeldiepte 5 mm
Netwell Inzetstukken	Corning	0330B09	15 mm Inzetstukken met 74 µm Mesh Grootte Polyester Membraan fungeren als handige dragers tijdens de verwerking van monsters in verschillende oplosmiddelen
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixeermiddel
Veenmos	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedmedium
PELCO tabs dubbelzijdig carbon geleidend plakband	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	dun metaalcoating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	elektronenmicroscopie