Hier presenteren we een mechanisch dissociatie protocol om macrofagen snel te isoleren van de dorsale wortel ganglion voor fenotypering en functionele analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle isolatie van dorsale wortel ganglion macrofagen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn groeiende belangen om te bestuderen van de moleculaire en cellulaire interacties tussen immune cellen en sensorische neuronen in de rugwortel ganglia na perifere zenuw letsel. Perifere monocytische cellen, waaronder macrofagen, zijn bekend om te reageren op een weefsel letsel door middel van fagocytose, antigeen presentatie, en cytokine vrijlating. Opkomende bewijsmateriaal impliceerde de bijdrage van rugwortel ganglia macrofagen aan neuropathische pijn ontwikkeling en axonale reparatie in de context van zenuw letsel. Snel fenotypen (of "snelle isolatie van") de reactie van rugwortel ganglia macrofagen in de context van zenuw letsel is gewenst om de onbekende neuroimmuunfactoren te identificeren. Hier laten we zien hoe ons lab snel en effectief macrofagen isoleert van de dorsale wortel ganglia met behulp van een enzymvrij mechanisch dissociatie protocol. De monsters worden op het ijs gehouden om cellulaire stress te beperken. Dit protocol is veel minder tijdrovend in vergelijking met het standaard enzymatische protocol en is routinematig gebruikt voor onze fluorescentie-geactiveerde Celsorterings analyse.
Inleiding
Er is nu aanzienlijk bewijs dat immuuncellen bijdragen aan de neuropathische pijn na beschadiging van de perifere zenuw1,2. Perifere monocytische cellen, waaronder volwassen macrofagen, zijn bekend om te reageren op weefsel letsel en systemische infectie door middel van fagocytose, antigeen presentatie, en cytokine vrijlating. Parallel aan de zenuw letsel-geïnduceerde Microglia activering in de ruggenmerg rughoorn, macrofagen in de dorsale wortel ganglia (DRG) ook uit te breiden aanzienlijk na zenuw letsel3,4. Met name, er zijn groeiende belangen om te....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dier experimenten werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Californië in San Francisco en werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Verzamel lumbale DRG van experimentele muizen
- Voordat u begint met het experiment, bereidt u de werkoplossing voor van het dichtheidsgradiënt medium (bijv. Percoll) door 9 volumes van het medium te mengen met 1 volume van CA+ +/mg+ +-vrije 10x HBSS. Houd het op ijs.
- Anesthetiseer de muis met 2,5% Avertin. Bevestig dat het dier volledig verdoofd d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de geïsoleerde cellen te valideren, kozen we eerst voor de macrophage FAS-geïnduceerde apoptosis (MAFFIA) transgene muizen17. Deze lijn drukt een drug-inducible FK506-bindend eiwit (FKBP)-FAS Suicide Fusion gen en groene fluorescerende proteïne (eGFP) onder de controle van de promotor van CSF1 receptor (CSF1R), die specifiek wordt uitgedrukt in zowel macrofagen en Microglia. Systemische injectie van FK-bindende proteïne dimerizer, AP20187 (AP), induceert de apoptosis van de cellen die het trans.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier introduceren we een nieuwe methode om geïsoleerde macrofagen effectief te verrijken van muis DRG. De conventionele aanpak voor het isoleren van DRG-immuuncellen vereist enzymatische spijsvertering15,18, die nu wordt vervangen door mechanische homogenisatie in ons protocol om ongewenste celbeschadiging te beperken en de opbrengst te verhogen. Daarom is het nieuwe protocol veel minder tijdrovend. Wat nog belangrijker is, de enzym vertering kan de macrofagen st.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen met betrekking tot dit manuscript.
Dankbetuigingen
De studie werd gesteund door: Stichting voor anesthesie onderwijs en onderzoek (XY); de afdeling van de UCSF anesthesie en perioperatieve zorg (XY); en 1R01NS100801-01 (GZ). Deze studie werd deels ondersteund door het HDFCCC-laboratorium voor de gedeelde bronnen faciliteit voor Celanalyse door middel van een subsidie van de NIH (P30CA082103).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-muis CX3CR1-APC antilichaam | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cel zeef (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce weefsel homogenisator | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS buizen (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-vrij) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium jodide | Sigma | P4864-10ml |
Referenties
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
