Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hybride Microdrive systeem met herstelbaar opto-silicium sonde en Tetrode voor Dual-site high density opname in vrij bewegende muizen

10.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60028

⸱

10 augustus 2019

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neuroscience, University of Texas Southwestern Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de bouw van een hybride Microdrive-array waarmee implantatie van negen onafhankelijk instelbare tetrodes en één instelbare opto-silicium sonde in twee hersengebieden in vrij bewegende muizen mogelijk is. Ook gedemonstreerd is een methode voor het veilig herstellen en hergebruiken van de opto-silicium sonde voor meerdere doeleinden.

Samenvatting

Multi-regionale neurale registraties kunnen cruciale informatie bieden voor het begrijpen van de interacties tussen meerdere hersen regio's met een fijne tijdschaal. Conventionele Microdrive-ontwerpen staan echter vaak slechts één type elektrode toe om te registreren vanuit één of meerdere regio's, waardoor de opbrengst van enkelvoudige of diepte-profiel opnames wordt beperkt. Het beperkt ook vaak de mogelijkheid om elektrode opnames te combineren met optogenetische hulpmiddelen om het pad en/of celtype specifieke activiteit te targeten. Hier gepresenteerd is een hybride Microdrive array voor vrij bewegende muizen om de opbrengst te optimaliseren en een beschrijving van de fabricage en het hergebruik van de Microdrive-array. Het huidige ontwerp heeft negen tetrodes en één opto-silicium sonde in twee verschillende hersengebieden tegelijkertijd in vrij bewegende muizen. De tetrodes en de opto-silicium sonde zijn onafhankelijk instelbaar langs de dorsoventral as in de hersenen om de opbrengst van eenheid en oscillerende activiteiten te maximaliseren. Deze Microdrive-array bevat ook een set-up voor licht, bemiddelende optogenetische manipulatie om de regionale-of celtypespecifieke reacties en functies van neurale circuits met lange afstand te onderzoeken. Bovendien kan de opto-silicium sonde na elk experiment veilig worden teruggewonnen en hergebruikt. Omdat de Microdrive-array bestaat uit 3D-geprinte onderdelen, kan het ontwerp van micro drives eenvoudig worden aangepast voor verschillende instellingen. Eerst beschreven is het ontwerp van de Microdrive array en hoe de optische vezel te hechten aan een silicium sonde voor optogenetica experimenten, gevolgd door de fabricage van de Tetrode bundel en implantatie van de array in een muis brein. De opname van lokale veld potentialen en unit stekelige gecombineerd met optogenetische stimulatie tonen ook de haalbaarheid van de Microdrive array systeem in vrij bewegende muizen.

Inleiding

Het is cruciaal om te begrijpen hoe Neuronale activiteit cognitief proces ondersteunt, zoals leren en geheugen, door te onderzoeken hoe verschillende hersengebieden dynamisch met elkaar omgaan. Om de dynamiek van de neurale activiteit onderliggende cognitieve taken te verhelderden, is grootschalige extracellulaire elektrofysiologie uitgevoerd in vrij bewegende dieren met behulp van Microdrive arrays1,2,3, 4. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende soorten Microdrive-array ontwikkeld om elektroden in meerdere hersengebieden te implanteren voor ratten5,6,7,8 en muizen9, 10 , 11 , 12. niettemin, huidige Microdrive ontwerpen in het algemeen niet toestaan voor het gebruik van meerdere sonde types, dwingen onderzoekers om een enkele elektrode type met specifieke voordelen en beperkingen te kiezen. Tetrode arrays werken bijvoorbeeld goed voor dichtbevolkte hersengebieden zoals de dorsale Hippocampus Ca11,13, terwijl siliconen sondes een beter geometrisch profiel geven voor het bestuderen van anatomische verbindingen14 , 15.

Tetrodes en silicium sondes worden vaak gebruikt voor in vivo chronische opname, en elk heeft zijn eigen voor-en nadelen. Tetrodes hebben bewezen aanzienlijke voordelen te hebben in een betere isolatie van één eenheid dan enkelvoudige elektroden16,17, naast kosteneffectiviteit en mechanische stijfheid. Ze bieden ook hogere opbrengsten van activiteiten met één eenheid in combinatie met micro drives8,18,19,20. Het is essentieel om het aantal gelijktijdig opgenomen neuronen voor het begrijpen van de functie van neurale circuits21te verhogen. Er zijn bijvoorbeeld grote aantallen cellen nodig om kleine populaties van functioneel heterogene celtypen te onderzoeken, zoals tijdgerelateerde22 -of belonings codering23 -cellen. Er zijn veel hogere celaantallen nodig om de decoderings kwaliteit van Spike sequenties13,24,25te verbeteren.

Tetrodes hebben echter een nadeel bij het opnemen van ruimtelijk gedistribueerde cellen, zoals in de cortex of de thalamus. In tegenstelling tot tetrodes, silicium sondes kunnen ruimtelijke distributie en interactie van lokale veld potentialen (lfps) en stekelige activiteiten binnen een lokale structuur14,26bieden. Multi-schacht silicium sondes vergroten het aantal opnamelocaties verder en maken opname mogelijk in enkele of naburige structuren27. Echter, dergelijke arrays zijn minder flexibel in de positionering van elektrode-sites in vergelijking met tetrodes. Bovendien zijn complexe Spike-sorteer algoritmen vereist in hoge-dichtheids tests om informatie te extraheren over actiemogelijkheden van naburige kanalen om de gegevens te spiegelen die zijn verworven door tetrodes28,29,30. Vandaar dat de totale opbrengst van enkelvoudige eenheden vaak minder is dan tetrodes. Bovendien zijn silicium sondes nadelig vanwege hun broosheid en hoge kosten. Zo is de keuze van tetrodes vs. silicium sondes afhankelijk van het doel van de opname, wat een vraag is of het verkrijgen van een hoge opbrengst van enkelvoudige eenheden of ruimtelijke profilering op de opnamelocaties prioriteit krijgt.

Naast het opnemen van neurale activiteit, is optogenetische manipulatie uitgegroeid tot een van de krachtigere instrumenten in de neurowetenschappen om te onderzoeken hoe specifieke celtypen en/of trajecten bijdragen aan neurale circuit functies13,31, 32,33. Echter, optogenetische experimenten vereisen extra aandacht in Microdrive array ontwerp om de vezel connector te hechten aan stimulatie lichtbronnen34,35,36. Vaak is het aansluiten van Fiber-Optics een relatief grote kracht, wat kan leiden tot een mechanische verschuiving van de sonde in de hersenen. Daarom is het niet een triviale taak om een implanteerbare optische vezel te combineren met conventionele Microdrive-arrays.

Om bovengenoemde redenen zijn onderzoekers verplicht om de selectie van het type elektrode te optimaliseren of om een optische vezel te implanteren, afhankelijk van het doel van de opname. Tetrodes worden bijvoorbeeld gebruikt om een hogere eenheids opbrengst te bereiken in Hippocampus1,13, terwijl silicium sondes worden gebruikt om het laminaire diepte Profiel van corticale gebieden te onderzoeken, zoals de mediale entorhinale cortex (MEC)37. Op dit moment werden micro drives voor gelijktijdige implantatie van tetrodes en silicium sondes gerapporteerd voor ratten5,11. Het is echter zeer uitdagend om meerdere tetrodes en silicium sondes bij muizen te implanteren vanwege het gewicht van de micro drives, beperkte ruimte op de muis, en ruimtelijke vereisten voor het ontwerpen van de Microdrive om verschillende voelers te gebruiken. Hoewel het mogelijk is om silicium sondes zonder een Microdrive te implanteren, staat deze procedure niet toe dat de sonde wordt aangepast en wordt het slagingspercentage van het herstel van silicium sonde12,38lager. Bovendien, optogenetische experimenten vereisen aanvullende overwegingen in Microdrive array ontwerp. Dit protocol demonstreert het construeren en implanteren van een Microdrive array voor chronische opnames in vrij bewegende muizen, waardoor implantatie van negen onafhankelijk instelbare tetrodes en één instelbare opto-silicium sonde mogelijk is. Deze Microdrive-array vergemakkelijkt ook optogenetische experimenten en herstel van de silicium sonde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de University of Texas Southwestern Medical Center.

1. preparaten van Microdrive array-onderdelen

  1. Print de Microdrive array-onderdelen met behulp van een 3D-printer met behulp van tandheelkundige model hars (Figuur 1a, B). Zorg ervoor dat de dikte van afzonderlijke 3D-gedrukte lagen kleiner is dan 50 μm om de kleine gaatjes op de afgedrukte onderdelen helder en levensvatbaar te houden.
    Opmerking: de Microdrive-array bestaat uit vijf delen (afbeelding 1c): (1) de hoofdtekst van de Microdrive-array, die negen Microdrive-schroeven voor tetrodes en één schroef voor een silicium sonde (figuur 1ca-d) bevat. De coördinatie van de Tetrode bundel en het gat voor de opto-silicium sonde aan de onderkant is afhankelijk van de coördinaten van het doel hersengebied (figuur 1Cd); (2) een shuttle om een silicium sonde of optrode te bevestigen (figuur 1Ce); (3) een elektrische connector van de sonde om de silicium sonde connecter vast te houden (figuur 1Cf); (4) een vezel Ferrule houder die aan het middelste deel van het lichaam klemmen om ongewenste bewegingen van de geïmplanteerde opto-silicium sonde te voorkomen bij het aansluiten/loskoppelen van een glasvezel connector (figuur 1Cg); en (5) een afscherming kegel die fysieke en elektrische afscherming biedt aan de Microdrive-array voor stabiele opnames (figuur 1Ch). Het totale gewicht van de Microdrive-array is 5,9 g, inclusief de beschermkegel (tabel 1). Als gaten zijn verstopt in de bedrukte delen, boor de gaten met behulp van boor-bits: #76 voor de binnenste gaten en #68 voor de buitenste gaten voor Tetrode-Microdrive schroeven, #71 voor Tetrode Microdrive-schroef supporter Hole, en #77 voor de gaten voor de gids-palen aan de onderkant van het lichaam.
  2. Inbrengen van geleidings posten in de Microdrive array body.
    1. Cut 2 16 mm lengtes van 26-ga roestvrijstaal draad. Slijp de draad uiteinden voorzichtig met een roterende slijpmachine.
    2. Plaats de draden in de onderste gaten van het lichaam (Figuur 2a). Breng een kleine hoeveelheid Cyanoacrylaat lijm aan de onderkant van het lichaam aan om de geleidings palen te beveiligen.

2. voorbereiding van de opto-silicium sonde

  1. Bereid de Microdrive-schroef voor op een silicium sonde.
    Opmerking: de Microdrive-schroef voor de silicium sonde bestaat uit een aangepaste schroef (pitch van 300 μm), die een steunbuis en een L-vorm buis ondersteunt (Figuur 2b).
    1. Bereid de mal voor de Microdrive-kop (figuur 2c). Voor het construeren van de mal bereidt u het 3D-gedrukte plastic patroon van de Microdrive voor (figuur 2Ca). Giet vervolgens vloeibare siliconen gel na het maken van een temporale muur door tapes rond het patroon te plaatsen. Verwijder luchtbellen door zachtjes te schudden, wacht totdat het is genezen en verwijder vervolgens de siliconen-gelmal uit het patroon (figuur 2Cb).
    2. Snijd 18 mm en 9,5 mm lengtes van 23 G roestvrij draad met behulp van een roterende slijpmachine. Roughen de top 2 – 3 mm van de draden met een roterende Grinder ter verbetering van de hechting van de tandheelkundige acryl.
    3. Neem één aangepaste schroef en breng kleine hoeveelheid silicium olie aan om de wrijving met de tandheelkundige acryl te verminderen. Stel de draden en een aangepaste schroef aan de mal.
    4. Giet tandheelkundige acryl in de mal met behulp van een spuit om luchtbellen rond de draden en de schroeven te elimineren. Luchtbel besmetting zal de Microdrive fragiel maken. Wacht tot de tandheelkundige acryl volledig is uitgehard, haal dan de Microdrive schroeven uit de mal. Buig 6 mm van de langere draad punt tot een hoek van 60 ° met behulp van een tang.
    5. Controleer de kwaliteit van de micro schijf schroeven (bijv. scheuren, luchtbellen en wrijving) om de schroef te draaien. Als er een hoge wrijving, draai de schroef totdat ze glad worden met behulp van een elektrische schroevendraaier met een aangepaste bestuurder tip, die paren met de Microdrive schroef.
    6. Installeer de Microdrive-schroef in de Microdrive array Body om te controleren of deze soepel beweegt door de schroef te draaien. Draden voor de schroef worden automatisch gemaakt bij het inbrengen van de schroef in het gat van het lichaam.
  2. Bereid de shuttle (figuur 3Aa).
    1. Snijd twee 5 mm lengtes polyetheretherketon (Peek) slang met een scherpe schaar. Lijn de buizen aan beide zijden van de shuttle uit. Lijm de buizen en de shuttle met behulp van epoxy.
    2. Breng kleine hoeveelheid silicium olie aan op de geleidings palen. Controleer de kwaliteit van de shuttle door op de geleidings palen van de Microdrive array body te plaatsen. Zorg ervoor dat de shuttle soepel beweegt zonder overmatige wrijving.
  3. Maak een optorode (figuur 3Ab). Deze stap kan worden overgeslagen als een optogenetische experiment niet vereist is.
    1. Kleef de optische vezel op een lengte van 21 mm met behulp van een ruby-frees. Slijp de fiber tip om de tip plat en glanzend te maken.
    2. Plaats de optische vezel op de voorzijde van de silicium sonde. De vezel tip is gepositioneerd 200 – 300 μm boven de bovenkant van de elektrode-locaties. Houd de vezel tijdelijk vast met transparante tape.
    3. Lijm de optische vezel op de basis van de silicium sonde met behulp van kleine hoeveelheid epoxy. Wacht ten minste 5 uur totdat de epoxy volledig is uitgehard.
      Opmerking: het wordt aanbevolen om de optische vezel aan dezelfde kant als de elektrode plaatsen te bevestigen. Het bevestigen van de vezel aan de achterzijde kan voorkomen dat licht de opname plaatsen goed verlicht.
  4. Bevestig de shuttle aan de silicium sonde (figuur 3Ac): Breng een kleine hoeveelheid epoxy aan de achterkant van de basis van de silicium sonde aan. Bevestig het onderste deel van de shuttle aan de basis van de Silicon-probe en houd de positie gedurende 2 – 3 minuten zachtjes vast om vorming van een spleet tussen de shuttle en silicium sonde Base te voorkomen tijdens de eerste genezing van de epoxy. Wacht ten minste 5 uur totdat de epoxy volledig is uitgehard.
  5. Plaats de shuttle buizen voorzichtig op de geleidings palen van het hoofd lichaam onder de Microscoop (Figuur 3b). Tijdens deze procedure, houd de groef van de shuttle met fijne pincet.
  6. Steek de Microdrive-schroef in het schroefgat door de schroef te draaien. Betrek de silicium sonde en de Microdrive-schroef door de punt van de L-vorm draad in de groef van de shuttle kop te plaatsen (figuur 3c).
  7. Bevestig de elektrische aansluitinghouder van de sonde aan de Microdrive array Body (figuur 3D).
    1. Knip twee #0 schroeven tot 3,5 mm draadlengte. Slijp de tips om bramen te verwijderen.
    2. Plaats de probe-connecter houder op het lichaam. Plaats de elektrische connector van de silicium sonde in de houder.
    3. Bevestig de silicium sonde connector in de houder met behulp van epoxy, en zorg ervoor dat niet lijm aan de Microdrive array Body om de herstelprocedure van de silicium sonde mogelijk te maken. Plaats de schroeven om de probe connecter houder vast te houden.
  8. Bevestig de Ferrule-houder aan de opto-silicium sonde en Microdrive array Body (figuur 3D).
    1. Knip twee #0 schroeven tot 6 mm draadlengte. Slijp de tips om bramen te verwijderen.
    2. Slijp de buitenkant van twee #0 Machineschroef moeren om kleine zeskant moeren te maken met een buitendiameter van 2,5 – 3,0 mm om het gewicht en de ruimte te verminderen.
    3. Steek de schroeven in component A van de houder. Lijm de schroefkoppen met epoxy.
    4. Breng kleine hoeveelheid silicium vet aan op component A en B om de wrijving met het lichaam te verminderen. Plaats component A in het lichaam en houd vervolgens tijdelijk vast met behulp van inverse pincet.
    5. Plaats component B op de schroeven van component A. Rijg de aangepaste moeren in de schroeven. Gebruik een tang om de moeren aan te spannen om de Ferrule houder op het lichaam te beveiligen.
    6. Plaats de vezel Ferrule in de groef van de vezel Ferrule-houder (component B). Zorg ervoor dat de vezel Ferrule 4 – 5 mm uit de houder steekt.
    7. Breng een kleine hoeveelheid epoxy aan tussen de Ferrule en de houder groef. Wacht tot de epoxy volledig is uitgehard en controleer of de Ferrule niet beweegt. Controleer de shuttle en de Ferrule-houder voor een soepele beweging door de moeren los te maken voordat u de Microdrive-schroef draait.
    8. Controleer de werkafstand van de sonde. Zorg ervoor dat de sondepunt volledig in het lichaam wordt teruggetrokken wanneer de Ferrule-houder zich op de bovenste positie bevindt terwijl de shuttle buizen nog steeds aan de geleidings palen zijn gekoppeld. De maximale werkafstand wordt bepaald door de lengte van de siliconen sonde en het doelgebied van de hersenen.
    9. Als de Microdrive-schroef los is, breng dan kleine hoeveelheid tandheelkundige acryl rond de schroef aan om meer draden voor ondersteuning toe te voegen. Wanneer het is genezen, draai de schroef om dichtheid en stabiliteit te controleren.

3. Tetrode voorbereiding

Opmerking: deze procedure is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde artikelen8,19,20,39.

  1. Bereid de Microdrive schroeven voor de Tetrode. De Microdrive voor een Tetrode bestaat uit een op maat bewerkte schroef en een buis van 23 G (Figuur 2b). Deze procedure is vergelijkbaar met paragraaf 2,1.
  2. Maak een bundel van 30 G roestvrijstalen buizen met een 5,5 mil draad binnenin. In dit geval werden een totaal van 9 30 G slangen (acht opname-tetrodes en één referentie-elektrode) gebruikt.
  3. Rijg de 30 G-bundel van de onderkant van de aandrijf behuizing en bevestig ze met 20 G dunwandige slangen aan het hoofd lichaam. Knip de onderkant van de bundel af met een roterende slijpmachine om de tip gelijkmatig te maken en te spoelen. Trim bovenste deel van de 30 G buizen met een roterende Grinder zodat de 30 G buis steekt ongeveer 0,5 mm van het hoofd lichaam.
  4. Laad 5,5 mil polyimide isolatiebuizen in de 30 G slang. Maak Tetrode draden en laad ze in een 32-kanaals Electric interface Board (EIB). Controleer de elektrische verbinding met de impedantie tester voordat u de eind precisie snijdt.
  5. -Impedantie van een lagere elektrode tot 250 – 350 kΩ met goudplating oplossing. Repareer alle tetrodes met superlijm.
  6. Vul overmatige kloof tussen polyimide buis en Tetrode met minerale olie voor afdichting en smering. Leid de grond draad naar de EIB.
    Opmerking: indien nodig kan de optische vezel worden geïntegreerd langs Tetrode draden12.

4. de beschermkegel bevestigen

  1. Verf zilver geleidende afscherming verf aan de binnenkant van de bedrukte kegel. Plaats de Microdrive-array in de kegel (figuur 3e).
  2. Knip twee #0 schroeven tot 3,5 mm draadlengte. Bevestig de schroeven van de buitenkant van de kegel om de Microdrive-array op zijn plaats te houden.
  3. Breng zilverkleurige verf rond de schroefkop aan om de beschermkegel elektrisch aan te sluiten met elektrische ondergrond. Controleer de elektrische verbinding tussen de aarddraad en de kegel. Breng een kleine hoeveelheid epoxy aan tussen het lichaam van de Microdrive array en de afscherming kegel om het lichaam veilig te bevestigen.
    Opmerking: een andere manier om de afschermings kegel voor te bereiden is het gebruik van aluminium tape40 (figuur 3F). Bereid eerst het patroon papier voor de afschermende kegel voor na het plakken van aluminiumfolie op het papier (figuur 3Fa). Rol vervolgens het papier en bevestig het aan het lichaam van de Microdrive met een kleine hoeveelheid Cyanoacrylaat lijm (figuur 3Fb). Het gewicht van deze kegel is 0,72 g en het totale gewicht van de Microdrive-array wordt gereduceerd tot 4,7 g (tabel 1).

5. implantatie chirurgie

Opmerking: deze procedure is gewijzigd van eerder gepubliceerde artikelen18,39,41 voor dubbele site implantatie. Zorg ervoor dat het gewicht van het dier is meer dan 25 g voor de Microdrive implantaat voor sneller herstel na de operatie.

  1. Voorbereiding
    1. Om een grond schroef te bereiden, bevestig je de zilver draad aan een schedel schroef en breng je zilveren verf aan. Bevestig vervolgens een gouden speld aan de andere kant van de draad met behulp van zilver verf.
    2. Bereid de drive-vasthoud adapter voor om de Microdrive-array op een Stereotactisch apparaat te houden. Bevestig een male connecter aan een roestvrij handvat met epoxy. Zorg ervoor dat de uitlijning van de connecter en roestvrij handvat recht is.
    3. In het geval dat histologische bevestiging nodig is na de opname, moet di-I worden toegepast op de tetrodes of achterzijde van de silicium sonde38.
    4. Verlaag de silicium sonde omlaag om de gewenste diepte te krijgen. Draai de moeren van de Ferrule houder met behulp van een tang, verlaag de silicium sonde (opto-silicium sonde) door de Microdrive-schroef van de Silicon-probe te draaien en bevestig de moeren om de Ferrule houder te bevestigen. Bij het implanteren van tetrodes in hippocampal gebied CA1 en een silicium-probe in MEC, de afstand tussen de Tetrode canule en Silicon-probe tip is 3 – 4 mm.
  2. Stel de verdoofd Mouse (0,8% – 1.5% isoflurane) in een stereotaxic apparaat. De verdovings toestand van de muis wordt bevestigd door afwezigheid van de teen-pinch reflex. Breng heldere zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Bedek de ogen met een stukje folie om te beschermen tegen sterke blootstelling aan chirurgisch licht.
  3. Desinfecteer de hoofdhuid van de muis met jodium en isopropanol na het scheren van de vacht. Maak een incisie van 1,5 – 2,0 cm op de hoofdhuid met behulp van een standaard chirurgische schaar en verwijder het weefsel over de schedel met wattenstaafjes na subcutaan aanbrengen van lidocaïne.
  4. Lijn de muis hoofd uit met het stereotaxic gereedschap. Zorg ervoor dat het hoogteverschil tussen bregma en Lambda kleiner is dan 100 μm. Bepaal de locatie van de craniotomie met behulp van een Atlas en markeer deze locaties met een gesteriliseerd potlood.
  5. Anker de schedel schroeven (0,8 mm diameter, 0,200 mm draad pitch) door ze te roteren 1,5 bochten (0,3 mm) op de schedel, met behulp van chirurgische pincet en een schroevendraaier na het boren 8 – 11 gaten in de schedel met behulp van 0,5 mm boor.
    Opmerking: 2 – 4 gaten in de frontale schedel, 2 – 3 gaten in elke kant van de pariëtale schedel, en 1 – 2 gaten in de interpariëtale schedel worden gesuggereerd.
  6. Bevestig de grond schroef aan het gat door hem een draai te draaien (0,2 mm) na het boren van een gat in het interpariëtale bot. Zorg ervoor dat dit gat niet door het bot in de hersenen geval doordringen; anders zullen cerebellaire signalen de opname besmetten. Controleer of de impedantie minder dan 20 kΩ bij 1 kHz is tussen de grond schroef en de schedel schroeven met behulp van een impedantie meter.
    Opmerking: grotere impedantie zorgt voor de introductie van bewegings artefacten tijdens het opnemen.
  7. Voer de craniotomie uit op de gemarkeerde locaties. De Dura kan intact gelaten worden bij muizen.
  8. Sluit de mannelijke pin van de grond schroef en de massa-connector van de Microdrive-array aan. Controleer de connectiviteit met behulp van de impedantie meter door te meten tussen de grond schroef en de afscherming.
  9. Stel de Microdrive-array in op de adapter, stel deze in op het stereotaxic-apparaat en verlaag de silicium sonde langzaam tot de gewenste diepte. Zorg ervoor dat de Tetrode bundels boven het hersen oppervlak worden geplaatst, maar nog steeds in de Microdrive-array wanneer de silicium sonde in de hersenen wordt ingebracht (figuur 4a).
  10. Breng het silicium vet voorzichtig aan om het gebied van de silicium sonde en de Tetrode-bundel te verzegelen (figuur 4b). Plaats een kleine hoeveelheid silicium vet op de punt van een 20 G naald en breng het vet rond de sondes met behulp van de naald. Herhaal dit totdat Silicon Grease het gebied rond de sonde volledig bedekt, zodat tand acryl niet op of onder de elektroden/sondes stroomt. Let op dat u het vet niet aan de elektrode plaatsen laat raken, anders zal de impedantie van de opnamelocaties drastisch toenemen.
  11. Breng tandheelkundige acryl aan om de Microdrive array te fixeren op de verankerings schroeven in de schedel.
    Opmerking: het wordt aanbevolen om tandheelkundige acryl in drie lagen toe te passen om overmatige hitte te vermijden die wordt geproduceerd tijdens het uitharden van het acryl.
  12. Verwijder de adapter zorgvuldig uit de Microdrive-array. Injecteer 1 mL PBS subcutaan om uitdroging te voorkomen. Injecteer 5 mg/kg Meloxicam subcutaan als een analgetische behandeling.
  13. Bedek de Silicone-probe-connector door een stukje tape om te voorkomen dat vuil in de elektrische aansluitingen komt. Bedek de Microdrive-array met behulp van een plastic paraffine film en plak deze op zijn plaats.
  14. Toediening van een geschikte analgetische behandeling gedurende 3 dagen (bijv. subcutane injecties van 2 mg/kg Meloxicam eenmaal per dag). Laat 3 – 5 dagen voor herstel voor het starten van de Tetrode aanpassing. De geïmplanteerde muis na de herstelperiode wordt weergegeven in figuur 4c.

6. de silicium sonde herstellen (figuur 4D)

  1. Injecteer ketamine (75 mg/kg) en dexmedetomidine (1 mg/kg) anesthetica intraperitoneaal en bevestigde afwezigheid van de teen-pinch reflex. Repareer de verdomde muis door met behulp van een capuchon direct de 4% Paraformaldehyde door het hart te perfectioneren. Chirurgische methoden voor knaagdieren worden eerder beschreven42.
  2. Draai de moeren van de Ferrule houder los met een Plier. Verplaats het vervolgens voorzichtig naar de bovenkant van het lichaam door de instelschroef te draaien om de silicium sonde volledig in de richting van de behuizing van de Microdrive-array te verplaatsen. Bevestig de moeren om de sonde op de bovenste positie te houden.
  3. Neem de muis hersenen uit de bodem door het kraken van de schedel van de zijkant. De Microdrive-array is nu gescheiden van het dier.
  4. Verwijder de L-vormige Microdrive-schroef die de silicium sonde aandrijfas volledig. Maak de moeren van de Ferrule houder los en verwijder deze met behulp van een tang. Haal de component A van de Ferrule-houder eruit.
  5. Schroef de bevestiging van de sonde connector los van de aandrijf behuizing. Controleer of de bevestiging van de probe-connector uit de behuizing van de Microdrive-array kan komen.
  6. Houd het bovenste gedeelte van de shuttle met een pincet vast en schuif de siliconen-probe-eenheid voorzichtig uit de Microdrive-array.
  7. Reinig de sonde uiteinde met contactlens reiniger (eerst met enzym, dan 3% waterstofperoxide) gedurende ten minste 1 dag. Veeg de elektrode punt voorzichtig schoon met behulp van isopropanol pads onder de Microscoop. Houd de sonde in een statische vrije opbergdoos.
    Opmerking: de montage van de shuttle en Probe connector blijft bevestigd aan de silicium sonde en kan in de volgende implantatie worden hergebruikt.
    Opmerking: sommige siliconen sondes zijn niet draaglijk met waterstofperoxide. Gebruik in dit geval de contactlens oplossing die alleen proteolytisch enzym bevat.
  8. Om de Microdrive array Body voor de volgende operatie te hergebruiken, verwijdert u de tandheelkundige acrylaat met een combinatie van fijne boor boren en Nippers. Dan, de schedel-schroeven te herstellen door het onderdompelen van de verwijderde tandheelkundige acryl in aceton. Merk op dat de aceton de plastic delen van de Microdrive-array zal oplossen.
  9. Verwijder de epoxy tussen de Microdrive lichaam en afscherming kegel met behulp van een scalpel.
    Opmerking: er hoeven geen extra onderdelen opnieuw te worden afgedrukt voor de volgende operatie als de Microdrive niet kapot is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De Microdrive-array werd binnen 5 dagen gebouwd. De tijdlijn van de voorbereiding van Microdrive wordt beschreven in tabel 2. Met behulp van deze Microdrive, negen tetrodes en een silicium sonde werden geïmplanteerd in de hippocampal CA1 en MEC van de muis [21 week oud/29 g lichaamsgewicht mannelijke pOxr1-CRE (C57BL/6 achtergrond)], respectievelijk. Deze transgene muis drukt CRE in MEC Layer III piramidale neuronen. De muis werd geïnjecteerd met 200 nL van AAV5-DIO-ChR2-YFP (titer: 7,7 x 1012...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol demonstreert het construeren en implanteren van een hybride Microdrive array die het mogelijk maakt om neurale activiteiten uit te voeren vanuit twee hersengebieden met behulp van onafhankelijke instelbare tetrodes en een silicium sonde in vrij gedragen muizen. Het toont ook optogenetische experimenten en het herstel van de silicium sonde na experimenten. Terwijl instelbare silicium sonde33 of opto-silicon probe36 implantatie eerder is aangetoond bij muizen, he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd deels gesteund door Japan Society voor de promotie van Science Overseas Research Fellowships (HO), begiftigd geleerde programma (TK), Human Frontier Science Program (TK), Brain Research Foundation (TK), faculteits wetenschappen en technologie verwerving en Retentie programma (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), en door de Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Detective Research Grant (JY). Wij danken W. Marks voor waardevolle commentaren en suggesties tijdens de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#00-90 schroefJ.I. Morris#00-90-1/8EIB schroeven
#0-80 moerKleine onderdelenB00DGB7CT2messing moer voor het houden van glasvezelhulpmiddelen
#0-80 schroefKleine onderdelenB000FMZ57Gmessing machineschroef voor sondeconnectormontage, glasvezelhulpmiddelen en afschermingskegel
22 Ga polyetheretherketonbuizenKleine onderdelenSLPT-22-24voor bevestiging aan de shuttle, 0,025 inch binnendiameter
23 Ga roestvrij buisjeKleine onderdelenHTX-23Rvoor tetrode
23 Ga roestvrij draadKleine onderdelenHTX-23R-24-10voor L-vormige/steundraad
26 Ga roestvrij draadKleine onderdelenGWX-0200voor geleidingspalen
30 Ga roestvrij draadKleine onderdelenHTX-30Rvoor tetrode
3-D CAD-softwarepakketDassault SystèmesSolidWorks 2003
3D-printerFormLabForm2
5,5 mil polyimide isolerende buizenHPC Medical72113900001-012
aluminiumfolietapeTycoTyco Adhesives 617022 Aluminium Folietapevoor de alternatieve afschermingskegel
geleidende pastaYSHIELDHSF54voor afschermingskegel
aangepaste schroeven voor siliconen-sondemicrodriveAMTUNM1.25-HalfMoonhalvemaanroestvrijstalen schroef, 1,5 mm diameter, 300 µm draadgang
aangepaste schroeven voor tetrode microdriveAMTYamamoto_0000-160_9mmsleuvenroestvrijstalen schroef, 0,5 mm diameter, 160 µm draadgang, op maat gemaakt op bestelling voor ons ontwerp
tandheelkundig acrylStoelting51459
tandheelkundig modelharsFormLabRS-F2-DMBE-02
Dremel rotatiegereedschapDremelmodel 800een grinder
boortjeFine Science Tool19007-05
elektrische interfacekaartNeuralynxEIB-36-Narrow
epoxyDevconGLU-735.905 minuten epoxy
oogzalfDechraPuralube Ophthalmic Ointmentom de ogen van muizen tijdens de operatie te beschermen tegen uitdroging
vezelpolijstbladThorlabsLFG5Pvoor het polijsten van de optische vezel
fijne pincettenProtech International15-368voor het laden/herstellen van de siliconensonde
gouden pinnenNeuralynxEIB Pins Small
aardedraadA-M Systems7815000,010 inch zilveren draad
hoofdversterkerNeuralynxHS-36
impedantiemetingBAK electronicsModel IMP-21 kHz testfrequentie
minerale olieZONA36-105voor het smeren van schroeven en draden
optische vezelDoricMFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
OpnamesysteemNeuralynxDigital Lynx 4SX
robijnvezelschrijverThorlabsS90Rvoor het splijten van de optische vezel
siliconenvetFine Science Tool29051-45
siliconensondeNeuronexusA1x32-Edge-5mm-20-177Fig. 3, 4A, 4B, 5
siliconensondeNeuronexusA1x32-6mm-50-177Fig. 4C
siliconensonde wasoplossingAlconAL10078844contactlensreiniger
siliconen smeringSmooth-OnDragon Skin 10 FASTvoor de voorbereiding van de microdrivevorm
zilververfGC electronic22-023zilverprint II coating, gebruikt voor aardedraden
schedelschroefOtto Frei2647-10AC0,8 mm diameter, 0,200 mm draadgang
standaard chirurgische schaarROBOZRS-5880
stereotaxisch apparaatKopfModel 942
superlijmLoctiteLOC230992voor het aanbrengen op geleidingspalen
chirurgische pincettenROBOZRS-5135
Tetrode TwisterJun YamamotoTT-01
tetrode dradenSandvikPX000004

Referenties

  1. Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
  2. Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. The Journal of Neuroscience. 16 (2), 823-835 (1996).
  3. Keating, J. G., Gerstein, G. L. A chronic multi-electrode microdrive for small animals. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 201-206 (2002).
  4. Winson, J. A compact micro-electrode assembly for recording from the freely moving rat. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 35 (2), 215-217 (1973).
  5. Michon, F., et al. Integration of silicon-based neural probes and micro-drive arrays for chronic recording of large populations of neurons in behaving animals. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046018(2016).
  6. Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
  7. Billard, M. W., Bahari, F., Kimbugwe, J., Alloway, K. D., Gluckman, B. J. The systemDrive: a Multisite, Multiregion Microdrive with Independent Drive Axis Angling for Chronic Multimodal Systems Neuroscience Recordings in Freely Behaving Animals. eNeuro. 5 (6), (2018).
  8. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  9. Lu, P. L., et al. Microdrive with Two Independent Moveable Sets for Wide-Ranging, Multi-Site, Multi-Channel Brain Recordings. Journal of Medical and Biological Engineering. 34 (4), 341-346 (2014).
  10. Haiss, F., Butovas, S. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
  11. Headley, D. B., DeLucca, M. V., Haufler, D., Pare, D. Incorporating 3D-printing technology in the design of head-caps and electrode drives for recording neurons in multiple brain regions. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2721-2732 (2015).
  12. Voigts, J., Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: an ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8(2013).
  13. Yamamoto, J., Tonegawa, S. Direct Medial Entorhinal Cortex Input to Hippocampal CA1 Is Crucial for Extended Quiet Awake Replay. Neuron. 96 (1), 217-227 (2017).
  14. Schomburg, E. W., et al. Theta phase segregation of input-specific gamma patterns in entorhinal-hippocampal networks. Neuron. 84 (2), 470-485 (2014).
  15. Fernandez-Ruiz, A., et al. Entorhinal-CA3 Dual-Input Control of Spike Timing in the Hippocampus by Theta-Gamma Coupling. Neuron. 93 (5), 1213-1226 (2017).
  16. Rey, H. G., Pedreira, C., Quian Quiroga, R. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119 (Pt B), 106-117 (2015).
  17. Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. Journal of Neuroscience Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
  18. Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
  19. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  20. Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., Angelaki, D. E. Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  21. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  22. Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321 (5894), 1322-1327 (2008).
  23. Gauthier, J. L., Tank, D. W. A Dedicated Population for Reward Coding in the Hippocampus. Neuron. 99 (1), 179-193 (2018).
  24. Davidson, T. J., Kloosterman, F., Wilson, M. A. Hippocampal replay of extended experience. Neuron. 63 (4), 497-507 (2009).
  25. Gerwinn, S., Macke, J., Bethge, M. Bayesian population decoding of spiking neurons. Frontiers in Computational Neuroscience. 3, 21(2009).
  26. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
  27. Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. Journal of Neurophysiology. 90 (2), 1314-1323 (2003).
  28. Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165-1174 (2016).
  29. Hilgen, G., et al. Unsupervised Spike Sorting for Large-Scale, High-Density Multielectrode Arrays. Cell Reports. 18 (10), 2521-2532 (2017).
  30. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  31. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001(2017).
  32. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  33. Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157 (4), 845-857 (2014).
  34. Rangel Guerrero, D. K., Donnett, J. G., Csicsvari, J., Kovacs, K. A. Tetrode Recording from the Hippocampus of Behaving Mice Coupled with Four-Point-Irradiation Closed-Loop Optogenetics: A Technique to Study the Contribution of Hippocampal SWR Events to Learning. eNeuro. 5 (4), (2018).
  35. Liang, L., et al. Integrated and Quick-to-Assemble (SLIQ) Hyperdrives for Functional Circuit Dissection. Frontiers in Neural Circuits. 11, 8(2017).
  36. Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7 (1), 2773(2017).
  37. Quilichini, P., Sirota, A., Buzsaki, G. Intrinsic circuit organization and theta-gamma oscillation dynamics in the entorhinal cortex of the rat. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11128-11142 (2010).
  38. Sauer, J. F., Struber, M., Bartos, M. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  39. Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
  40. Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. Journal of Visualized Experiments. 91 (91), e51675(2014).
  41. Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  43. Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal cortex layer III input to the hippocampus is crucial for temporal association memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
  44. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. The European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  45. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 92-100 (2018).
  46. Jones, M. W., Wilson, M. A. Theta rhythms coordinate hippocampal-prefrontal interactions in a spatial memory task. PLoS Biology. 3 (12), e402(2005).
  47. Frank, L. M., Brown, E. N., Wilson, M. A. A comparison of the firing properties of putative excitatory and inhibitory neurons from CA1 and the entorhinal cortex. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 2029-2040 (2001).
  48. Kitamura, T., et al. Eng and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science. 356 (6333), 73-78 (2017).
  49. McGaugh, J. L., Cahill, L., Roozendaal, B. Involvement of the amygdala in memory storage: interaction with other brain systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13508-13514 (1996).
  50. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304 (5672), 881-883 (2004).
  51. Mikulovic, S., et al. On the photovoltaic effect in local field potential recordings. Neurophotonics. 3 (1), 015002(2016).
  52. Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
  53. Meng, E., Hoang, T. MEMS-enabled implantable drug infusion pumps for laboratory animal research, preclinical, and clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (14), 1628-1638 (2012).
  54. Hu, S., et al. Dietary Fat, but Not Protein or Carbohydrate, Regulates Energy Intake and Causes Adiposity in Mice. Cell Metabolism. 28 (3), 415-431 (2018).
  55. Yang, Y., Smith, D. L. Jr, Keating, K. D., Allison, D. B., Nagy, T. R. Variations in body weight, food intake and body composition after long-term high-fat diet feeding in C57BL/6J mice. Obesity. 22 (10), 2147-2155 (2014).
  56. Morton, D. B., et al. Refinements in telemetry procedures. Seventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement, Part A. Laboratory Animals. 37 (4), 261-299 (2003).
  57. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  58. Lin, L., et al. Large-scale neural ensemble recording in the brains of freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 28-38 (2006).
  59. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869(2014).
  60. Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Tetrode-registratieregistratie op twee locatiesneurale circuitregistratieoptogenetische stimulatielokale veldpotentialenherstel van siliciumsondes3D-geprinte microdrive
Hybride Microdrive systeem met herstelbaar opto-silicium sonde en Tetrode voor Dual-site high density opname in vrij bewegende muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.