Methodenartikel

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

DOI:

10.3791/60029

⸱

21 augustus 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamische eiwit-eiwit interacties beheersen cellulair gedrag, van beweeglijkheid tot DNA-replicatie tot signaaltransductie. Het monitoren van dynamische interacties tussen meerdere eiwitten in een proteïne-interactie netwerk is echter technisch moeilijk. Hier presenteren we een protocol voor kwantitatieve multiplex-immunoprecipitatie (QMI), dat kwantitatieve beoordeling van vouw veranderingen in eiwit interacties mogelijk maakt op basis van relatieve fluorescentie metingen van eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde Oppervlakte epitopen (vissen). In QMI worden eiwitcomplexen van celllysates op microsferen immunoprecipitated en vervolgens gepropageerd met een gelabeld antilichaam voor een ander eiwit om de overvloed aan vissen te kwantificeren. Immunoprecipitation-antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende MagBead-spectrale gebieden, waardoor een flow-cytometer meerdere parallelle immunoprecipitaties kan differentiëren en tegelijkertijd de hoeveelheid sonde-antilichamen die aan elk is gekoppeld, kwantificeren. QMI vereist geen genetische tagging en kan worden uitgevoerd met behulp van minimale biomateriaal in vergelijking met andere immunoprecipitatie-methoden. QMI kan worden aangepast voor elke gedefinieerde groep van de interactie eiwitten, en is tot nu toe gebruikt voor het karakteriseren van signalering netwerken in T-cellen en neuronale glutamaat synapsen. Resultaten hebben geleid tot nieuwe hypothese generatie met potentiële diagnostische en therapeutische toepassingen. Dit protocol bevat instructies voor het uitvoeren van QMI, vanaf de initiële selectie van het antilichaam-panel tot en met het uitvoeren van assays en het analyseren van gegevens. De initiële assemblage van een QMI-test omvat het screenen van antilichamen voor het genereren van een panel en het empirisch bepalen van een geschikte lysisbuffer. Het daaropvolgende reagens preparaat omvat covalent koppelen van immunoprecipitatie antilichamen tegen MagBeads, en biotinylating probe antilichamen, zodat ze kunnen worden gelabeld door een streptavidine-geconjugeerd fluorophore. Om de test uit te voeren, wordt lysaat 's nachts gemengd met magbeads, en vervolgens worden kralen verdeeld en geïntrigeerd met verschillende sonde-antilichamen, en vervolgens een de-label, en gelezen door flow cytometrie. Er worden twee statistische tests uitgevoerd om vissen te identificeren die significant verschillen tussen de experimentele omstandigheden, en de resultaten worden gevisualiseerd met behulp van Heatmaps of node-Edge diagrammen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamische eiwit-eiwit interacties vormen de moleculaire signalering Cascades en beweeglijke structuren die de functionele basis van de meeste cellulaire fysiologie zijn1. Deze processen worden vaak afgebeeld als lineaire signalerings trajecten die schakelen tussen stabiele toestanden op basis van enkelvoudige ingangen, maar experimentele en modellerings gegevens tonen duidelijk aan dat ze functioneren als geïntegreerde netwerken2,3, 4. in het geval van G-eiwitten hebben verschillende receptoren vaak de mogelijkheid om hetzelfde g-eiwit te activeren, en een enkele receptor kan ook meer dan één type g-eiwit5,6activeren. Om het relatief kleine aantal G eiwit klassen specifiek te moduleren een breed scala van cellulaire functies zoals synaptische transmissie, hormoon regulatie, en Celmigratie, cellen moeten beide integreren en differentiëren deze signalen4 , 5. uit bewijsmateriaal is gebleken dat de specificiteit van dit signaal, zowel voor G-eiwitten als voor anderen, primair wordt afgeleid op basis van fijn afgestemde eiwit-eiwit interacties en hun temporele dynamiek1,3, 4 , 5 , 6 , 7. omdat signalerings netwerken bestaan uit dynamische eiwitcomplexen met meerdere ingangen, outputs en feedbacklussen, heeft één enkele perturbatie de mogelijkheid om het algemene homeostatische evenwicht van de Fysiologie van een cel te veranderen4 ,7. Het is nu algemeen overeengekomen dat signalering vanuit een netwerk perspectief moet worden onderzocht om beter te begrijpen hoe de integratie van meerdere ingangen discrete cellulaire functies regelt in gezondheid en ziekte7,8, 9,10,11,12,13. In het licht hiervan werd kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) ontwikkeld om middelmatige doorvoer te verzamelen, kwantitatieve gegevens over vouw veranderingen in dynamische proteïne-interactie netwerken.

QMI is een op antilichamen gebaseerde test waarbij cellysaat wordt geïnineerd met een panel van immunoprecipitatie-antilichamen die covalent zijn gekoppeld aan magnetische kralen met duidelijke verhoudingen van fluorescerende kleurstoffen. Het hebben van specifieke antilichamen gekoppeld aan verschillende magnetische kraal klassen zorgt voor gelijktijdige co-immunoprecipitatie van meerdere doel eiwitten uit hetzelfde lysaat. Na immunoprecipitatie (IP) worden magnetische kralen geïnfiltreerd met een tweede, fluorophore-geconjugeerd sonde antilichaam (of biotinyleerd antilichaam in combinatie met fluorophore-geconjugeerde streptavidin). Co-associaties tussen de eiwitten die worden herkend door elk IP-antilichaam-sonde antilichaam paar, of vissen (eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde oppervlak Epitopes), worden vervolgens gedetecteerd door Flowcytometrie en kunnen kwantitatief worden vergeleken tussen verschillende voorwaarden14. Illustraties in Figuur 1 tonen de stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van een QMI-test, waaronder een diagram van magnetische parels met immunoprecipitated proteïne complexen gelabeld door fluorescently geconjugeerde sonde-antilichamen (Figuur 1C).

De gevoeligheid van QMI is afhankelijk van de eiwitconcentratie van het lysaat ten opzichte van het aantal magnetische kralen dat wordt gebruikt voor immunoprecipitatie, en het bereiken van een resolutie voor het detecteren van 10% vouw veranderingen vereist slechts een kleine hoeveelheid startmateriaal in vergelijking met andere Co-IP-methoden14,15. De hoeveelheid uitgangsmateriaal die wordt gebruikt in QMI is bijvoorbeeld vergelijkbaar met die welke vereist is voor een sandwich-enzym-linked ImmunoSorbent assay (ELISA), maar er worden meerdere interacties gedetecteerd in één QMI-test. QMI assays met behulp van 20 IPs en 20 sonde targets zijn uitgevoerd met behulp van 1-5 x 105 primaire T-cellen geïsoleerd uit een 4 mm huid biopsie, P2 synaptosomale preparaten uit een 3 mm coronale sectie van muis prefrontale cortex, of 3 x 106 gekweekte muis primaire corticale neuronen14,16,17. Deze gevoeligheid maakt QMI nuttig voor analyse van cellen of weefsel met beperkte beschikbaarheid, zoals klinische monsters.

QMI kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk (op voorwaarde dat antilichamen beschikbaar zijn), en tot op heden is ontwikkeld om de T Cell antigen receptor (TCR) signalosome te analyseren en een subset van eiwitten bij glutamaterge synapsen in neuronen 17 , 18. in studies van T Cell receptor signalering werd QMI voor het eerst gebruikt om stimulatie veroorzaakte veranderingen in vissen te identificeren, en vervolgens om auto-immuunpatiënten van een controlegroep te onderscheiden, endogene auto-immuunsigna lering te detecteren en tot slot een hypothese met betrekking tot een onevenwichtige ziekte-geassocieerde subnetwerk van interacties14. Meer recentelijk werd hetzelfde QMI-panel gebruikt om te bepalen dat de selectie van thymocyte wordt bepaald door kwantitatieve, in plaats van kwalitatieve verschillen in TCR-geassocieerde proteïne-signalering19. In neuronen werd QMI gebruikt om input-specifieke herschikking van een proteïne-interactie netwerk te beschrijven voor verschillende typen ingangssignalen op een manier die nieuwe opkomende modellen van synaptische plasticiteit17ondersteunt. Bovendien, dit synaptische QMI panel werd gebruikt om de verschillen in zeven Muismodellen van autisme identificeren, cluster de modellen in subgroepen op basis van hun vissen biosignatures, en nauwkeurig veronderstellen een gedeeld moleculair tekort dat voorheen niet werd herkend in een van de modellen16. Een soortgelijke benadering kan worden gebruikt om te schermen voor andere subgroepen die kunnen reageren op verschillende medicamenteuze behandelingen, of om drugs toe te wijzen aan specifieke responsieve subgroepen. QMI heeft potentiële toepassingen in diagnostiek, het ondertypen van patiënten en de ontwikkeling van geneesmiddelen, naast de basiswetenschap.

Om een QMI-antilichaam paneel samen te stellen, worden de eerste antilichamen screening en selectie protocollen beschreven in sectie 1 hieronder. Wanneer antilichamen worden geïdentificeerd, worden de protocollen voor conjugatie van de geselecteerde antilichamen tegen magnetische kralen voor IP en voor biotinylatie van de geselecteerde antilichamen van de sonde beschreven in rubriek 2. Het protocol voor het uitvoeren van de QMI-test op cel-of weefsel lysaten wordt beschreven in rubriek 3. Ten slotte, omdat een enkel experiment kan genereren ~ 5 x 105 individuele data Points, instructies en computercodes om te helpen bij de verwerking van gegevens, analyse en visualisatie worden gegeven in sectie 4. Een overzicht van de werkstroom die wordt beschreven in secties 2-4 wordt weergegeven in Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ontwerp van de assay

  1. Voorbereiding van kandidaat-antilichamen
    1. Voor elk eiwit van belang, kies 3 tot en met 5 antilichamen op het scherm. Gebruik indien mogelijk monoklonale antilichamen die verschillende epitopes herkennen. Ook een niet-specifieke controle antilichamen bevatten.
    2. Om tris te verwijderen, voert u buffer uitwisseling uit door het antilichaam toe te voegen aan een 30 kDa-spin filter, te draaien tot het minimum volume, 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen en 3 keer te herhalen. Om drager eiwitten te verwijderen, voert u de antilichaam zuivering uit volgens het Protocol van de fabrikant (Zie tabel van de materialen voor specifieke zuivering aanbeveling).
      Opmerking: dit wordt gedaan omdat drager eiwitten en buffers met vrije amine groepen (zoals tris) zullen reageren met COOH groepen en de daaropvolgende kraal koppeling en biotinylatie reacties moeten doven. Zorg ervoor dat alle antilichamen worden gezuiverd (geen drager eiwitten) en in een buffer zonder primaire amines (d.w.z. geen tris).
    3. Koppel elk antilichaam aan carboxylaat gemodificeerde latex (CML) kralen zoals beschreven door Davis en Schrum20. Om het antilichaam te sparen, moet u de kraal koppelings reacties met maximaal 1/5 (d.w.z. 3,6 x 106 parels met 10 μL van 0,2-1 mg/ml antilichaam) opschalen.
    4. Geschatte kraal nummers met behulp van een hemocytometer (meestal ~ 108/ml) en bewaren bij 4 °c. Kralen zijn opgeslagen voor meer dan een jaar en met succes gebruikt in QMI assays, maar houdbaarheid of vervaldata zijn niet formeel vastgesteld. NaN3 in de B/S buffer voorkomt bacteriële groei.
    5. Biotinylaat een deel van elk antilichaam (zie punt 2,2 hieronder). Bewaren bij 4 °C.
    6. Bevestig effectieve CML kraal koppeling en nauwkeurig tellen door kleuring 1 x 105 kralen met een PE-geconjugeerd antilichaam reactieve aan de soort waarin het antilichaam is opgegroeid en het lezen van een flow-cytometer.
    7. Bevestig antilichaam biotinylatie door dot Blot met behulp van streptavidin-HRP.
    8. Zodra het lab reagentia heeft gegenereerd waarvan bekend is dat ze effectief zijn, gebruikt u die reagentia als positieve controles in de bevestigings reacties in de stappen 1.1.5 en 1.1.6.
  2. Screening van antilichamen door IP-FCM (immunoprecipitatie gedetecteerd door flow cytometrie)
    1. Beslissen over een geschikte screening lysate. Voor deze en alle andere pre-QMI screening stappen (alles inbegrepen in deze sectie 1: assay ontwerp), gebruik geen biosamples met beperkte beschikbaarheid. Kies in plaats daarvan een vergelijkbaar controlemateriaal zoals wild type muis weefsel, cellijnen of normaal menselijk donor weefsel dat geen beperkende bron is.
      Opmerking: het kiezen van een lysisbuffer voor deze test is niet triviaal, en wordt besproken in paragraaf 1,5: detergenten selectie, evenals in de voorlaatste paragraaf van de discussie sectie. Standaard lysisbuffers hebben een basis van 150 mM NaCl, 50 mM tris (pH 7,4), 10 mM Natriumfluoride, 2 mM natrium orthovanadaat, en protease-en fosfatase-remmers cocktails. Detergenten die compatibel zijn met QMI zijn onder meer 1% NP-40, 1% digitonin, 0,1-1% Triton X-100 en 0,5-1% deoxycholaat14,16,17,18,19,21.
    2. Bereken het totale volume lysaat dat voor elk IP-adres moet worden gebruikt, met 10 μL voor elke te screenen IP-probe-combinatie. Bij het screenen van X-sonde-antilichamen en het gebruik van één IgG-regeling, zal elk IP-adres (X + 1) * (10 μL) * (1,1 voor Pipetteer fout) gebruiken; X + 1 is om rekening te kunnen maken met de vereiste IgG-sonde controle. Bijvoorbeeld, in een 3x3 antilichaam scherm, elk IP moet 44 ul gebruiken. Vergeet niet een IgG IP-besturingselement op te nemen (zie voorbeeld screening-instellingen in Figuur 2).
    3. Bereken het CML kraal nummer dat moet worden gebruikt. Als u X sonde-antilichamen screening, gebruik [(X + 1) * 5 X 104 kralen]. Idealiter zullen 5.000 kralen per well resulteren in > 2000 kralen per goed gelezen door de flow cytometer. Bijvoorbeeld, in een 3 x 3 antilichaam scherm, elk IP moet 20.000 kralen, die ongeveer 0,66 μL van bereide CML kraal voorraad uit stap 1.1.3 (kralen moeten eerst worden gekwantificeerd met behulp van een hemocytometer om nauwkeurigheid te garanderen).
    4. Inbroed het volume van lysaat van stap 1.2.2 met het volume van elke cml kraal te worden gescreend vanaf stap 1.2.3, 's nachts bij 4 ° c met rotatie om te voorkomen dat kralen te vestigen. Voer gewoonlijk incubaties uit in de eerste kolom van een 96-well PCR-plaat en dop met PCR-buisstrip doppen.
    5. Spin neer cml kralen bij 3.200 x g gedurende 1 minuut en verwijder lysaat door een enkele, snelle al vegend van de plaat over de gootsteen. Een kleine witte pellet moet zichtbaar zijn aan de onderkant van elk goed, zowel voor als na het flicking.
    6. Respendeer CML kralen in een volume FlyP buffer tot 20 μL voor elk paar van de kraal sonde; voor X-sonde-antilichamen, gebruik (X + 1) * (20 μL) * (1,1 voor Pipetteer fout), vergelijkbaar met stap 1.2.2. Voor een 3 x 3-scherm, respendeert u in 88 μL FlyP-buffer. FlyP-buffer is 100 mM NaCl, 50 mM tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Verdeel elk IP over (X + 1) putten van een 96-well PCR-plaat, waarbij X het aantal sonde-antilichamen is dat wordt gescreend met 20 μL/well. Figuur 2 A toont een voorbeeld screening Setup.
    8. Was 2 extra keer met behulp van 200 μL FlyP-buffer per put. Draai de plaat zoals in stap 1.2.5 en veeg de plaat om de wasbuffer na elke wasbeurt te verwijderen. Pellets zullen extreem klein zijn, maar moeten na elke wasbeurt zichtbaar zijn.
    9. Bereken het totale volume (Y + 1) * 1,1 * 50 μL, waarbij Y het aantal IP-antilichamen is dat wordt gescreend voor elk biotinyleerd antilichaam dat wordt vertoond Verdun antilichamen tegen een werkconcentratie in dit volume van de FlyP-buffer, meestal beginnend met 1:100 verdunning van een 0,5 mg/mL kolf.
    10. Verdeel elke verdunde antilichaam naar beneden elke kolom van de 96 goed plaat, en zorg ervoor dat CML kralen worden geresuspendeerd.
    11. Inincuberen bij 4 °C gedurende 1 uur, hetzij met rotatie of pipetteren met intervallen van 15 minuten om ervoor te zorgen dat CML kralen in suspensie blijven.
    12. Was 3x in 200 μL FlyP-buffer, voor elke wascentrifuge en verwijder lysaat zoals in stap 1.2.5.
    13. Respendeer alle CML kralen in 50 μL van 1:200 Streptavidin-PE in FlyP buffer.
    14. Inincuberen bij 4 °C in het donker gedurende 30 minuten.
    15. Was 3x in 200 μL FlyP-buffer, voor elke wascentrifuge en verwijder lysaat zoals in stap 1.2.5.
    16. Respendeer in 200 μL FlyP-buffer en loop vervolgens op een flow-cytometer.
  3. Het kiezen van antilichamen om op te nemen in assay
    1. Poort op maat met FSC-h VS SSC-H, en Elimineer dubbeltjes met FSC-H vs FSC-A.
    2. Genereer histogrammen van de intensiteit van de PE-fluorescentie en overlay beide IgG-besturingselementen (IgG-kraal test sonde, test kraal-IgG-sonde) op geteste paren (Figuur 2).
    3. Kijk voor een kraal-probe paar dat duidelijk signaal over lawaai geeft (Figuur 2B). Bovendien is het niet ideaal om hetzelfde antilichaam te gebruiken voor zowel kraal als sonde. Differentiële epitoop herkenning maximaliseert de kans op het observeren van interacties, omdat sommige epitopen kunnen worden verstopt in bepaalde eiwitcomplexen. Als er geen acceptabele opties zijn, herhaalt u het scherm met extra antilichamen.
  4. Bevestiging van de specificiteit van antilichamen
    1. Om de specificiteit van het antilichaam voor de beoogde doelstellingen te waarborgen, moet een lysaat monster worden gebruikt waarin het doelwit is uitgeschakeld; bijvoorbeeld een knock-outmuis of een RNAi-cellijn. U ook lysaat gebruiken uit een doelnegatieve cellijn waarin het doeleiwit kunstmatig is uitgedrukt.
    2. Voer IP-FCM uit zoals beschreven in stap 1,2, aanpassen aan het experiment.
  5. Reinigingsmiddel selectie
    1. Aangezien detergenten kritisch zijn in co-IP-experimenten, testen ze verschillende variaties empirisch om ervoor te zorgen dat de assay een maximale kans op het detecteren van veranderingen heeft. Om te beginnen, kies een relatief klein panel van interacties (4-8) waarvan bekend is dat ze veranderen in een bepaalde voorwaarde en/of zijn van bijzonder belang voor uw studie.
    2. Met behulp van de niet-fluorescerende, antilichaam geconjugeerde CML kralen gemaakt voor de eerste schermen, voer IP-FCM zoals beschreven in 1,2 met behulp van gevarieerde lysis buffer reinigingsmiddel condities. Detergenten schermen kunnen worden uitgevoerd met detergens als enige variabele, of met verschillende celcondities voor elk reinigingsmiddel. Gebruik altijd IgG-bedieningselementen voor zowel kralen als sondes, aangezien detergenten af en toe onverwachte achtergrond in sommige combinaties van IP-probe produceren.
    3. Op basis van de Mfi's van het scherm, kies een wasmiddel dat het signaal voor de vissen van belang optimaliseert. Het is waarschijnlijk dat er een aantal compromissen moet worden gesloten22.

2. multiplex reagens voorbereiding

  1. Magnetische kraal koppeling
    1. Selecteer met behulp van de magnetische kraal regiokaart, kraal gebieden te gebruiken in een patroon dat het risico van kruis detectie minimaliseert. Magnetische kraal meestal uitsmeren en naar rechts, dus vermijd kraal gebieden die diagonaal aangrenzend. Kralen van elke andere kolom van het kraal diagram getoond op de website van luminex worden aanbevolen (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Bereid het drager vrije antilichaam voor op 0,1 mg/mL in PBS (zoals in 1.1.2) in 250 μL. Blijf op ijs voor later gebruik.
    3. Vortex magnetische kralen uitgebreid, en vervolgens aliquot 250 μL in een Amber micro centrifugebuis (om kralen te beschermen tegen fotobleaching).
    4. Magnetisch gescheiden magnetische kralen voor 60 s en verwijder het supernatant.
    5. Voeg 250 μL MES-buffer (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), Vortex, magnetisch gescheiden voor 60 s, en verwijder het supernatant. Herhaal en rebreng magnetische parels in 200 μL MES-buffer.
    6. Voeg 40 μL MES toe aan een 2 mg buis van sulfo-NHS voor eenmalig gebruik om een 50 mg/mL kolf te maken.
    7. Voeg 25 μL vers gemaakte sulfo-NHS toe aan de magnetische kralen. Vortex.
    8. Voeg 25 μL van 50 mg/mL vers opgeloste EDAC [1-ethyl-3-( -3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide hydrochloride, ook wel EDC genoemd] toe aan de MES-buffer. Vortex.
    9. Bedek en schud op een vortexer met een buis houder voor 20 minuten bij kamertemperatuur, 1000 rpm.
    10. Magnetisch gescheiden voor 60 s en verwijder het supernatant.
    11. Respendeer in 500 μL PBS, Vortex, magnetisch gescheiden voor 60 s en verwijder het supernatant. Herhaal.
    12. Respenderen in 250 μL antilichaam oplossing uit stap 2.1.2. Vortex.
    13. Incuberen 2 uur bij kamertemperatuur met schudden op een vortexer bij 1000 rpm.
    14. Voeg 500 μL PBS toe aan de magnetische kralen, Vortex, magnetisch gescheiden voor 60 s, en verwijder het supernatant.
    15. Voeg 750 μL blokkering/opslag (B/S) buffer toe (1% BSA in PBS pH 7,4, 0,01% NaN3). Bedek en incuberen 30 min bij kamertemperatuur, 1000 rpm.
    16. Magnetisch gescheiden voor 60 s en verwijder het supernatant. Respenderen in 100 μL B/S buffer.
    17. Bewaren bij 4 °C. Kralen zijn opgeslagen voor meer dan een jaar en met succes gebruikt in QMI assays, maar houdbaarheid of vervaldata zijn niet formeel vastgesteld. NaN3 in de B/S buffer moet bacteriegroei voorkomen.
    18. Valideer magnetische kraal koppeling door kleuring ~ 0,25 μL van gekoppelde magnetische kralen met een fluorescerende anti-hostsoort secundair en lezing op een flow cytometer, zoals in stap 1.1.5.
  2. Biotinylation
    1. Zorg ervoor dat antilichamen zich in PBS bevinden zonder dragerproteïne.
    2. Bereken het totale aantal μg antilichamen als biotinyated (100-200 μg aanbevolen voor gebruik in multiplex, 25-50 μg aanbevolen voor screening).
    3. Bereid verse 10 mM sulfo-NHS-Biotine (kan worden gedaan door toevoeging van 224 μL ddH2O aan een 1 mg no-weeg buis).
    4. Voeg 1 μL 10 mM sulfo-NHS-Biotine toe per 25 μg antilichaam, Vortex of pipet op en neer om te mengen.
    5. Incuberen bij kamertemperatuur voor 1 uur.
    6. Incuberen bij 4 °C gedurende 1 uur.
    7. Gebruik een 30 kDa-spin filter om ongebonden Biotine te verwijderen en de reactie te stoppen. Voeg 500 μL PBS toe en draai de kolom om tot het minimum volume is bereikt. Voeg 500 μL extra PBS toe en herhaal dit voor 3 totale buffer uitwisselingen.
    8. Bereken de concentratie door de extinctie van 1-2 μL op een spectrofotometer te meten en breng de antilichaam concentratie vervolgens naar 0,5 mg/mL.
    9. Bewaren bij 4 °C.

3. kwantitatieve multiplex immunoprecipitatie

  1. Plaat indeling
    Opmerking: deze test werkt het best wanneer uitgevoerd met 96-well platen en 2-4 sample condities.
    1. Voer altijd passende controles (d.w.z. gestimuleerd v. ongestimuleerde cellen) op dezelfde plaat om veranderingen tussen de condities te detecteren. Verdeel elk monster horizontaal over de plaat en gebruik elke kolom voor een ander antilichaam van de sonde. Een set van technische replicaten voor elke sonde moet worden uitgevoerd onmiddellijk na de eerste set. Zie afbeelding 3 voor een voorbeeld.
    2. Documenteer zorgvuldig de plaat indeling om nauwkeurige plaat belasting en-analyse te vergemakkelijken.
  2. Monstervoorbereiding & immunoprecipitatie (dag 1)
    1. Lyse weefsels of cellen in geschikt reinigingsmiddel met protease-en fosfatase remmers en incuberen op ijs gedurende 15 minuten. Wees voorzichtig om het lysaat te allen tijde koud te houden.
      Opmerking: de precieze hoeveelheid van het vermelden van de eiwitconcentratie van biomateriaal en lysaat moet empirisch worden bepaald, en enkele voorbeelden van eerder gebruikte monsters zijn opgenomen in de derde alinea van de inleiding. Over het algemeen is in het bereik van 200 μL van 2 mg/mL eiwit per monster in het verleden succesvol geweest voor 20 IP-en 20-sonde targets, maar ideale ingangen voor elk antilichaam paneel en cel of weefseltype moeten empirisch worden bepaald.
    2. Spin naar beneden bij 4 °C gedurende 15 minuten bij 16.000 x g om membranen en puin te verwijderen; Bewaar supernatant als lysaat.
    3. Voer een BCA-assay of soortgelijke te bepalen eiwit concentraties, en vervolgens normaliseren eiwitconcentratie tussen monsters. Als u cellen gebruikt, begint u met een gelijk aantal cellen per voorwaarde en normalisering is optioneel.
    4. Bereid een Master magnetische kraal mix die ~ 250 magnetische kralen van elke klasse per put in de assay bevat. Pas de kraal nummers na de data-analyse, zodat in de toekomst assays een gemiddelde van 110 kralen van elke klasse zal worden gelezen per put.
      Opmerking: voorbeeld berekening: (nieuwe kraal volume) = [(run average)/110] * (vorige kraal volume). Kraal volumes moeten op deze manier worden aangepast over elke 8 runs of indien nodig. Typisch, 3-4 μL van elke magnetische kraal (bereid als hierboven) worden gebruikt voor een 2-plaat experiment.
    5. Was de magnetische kraal mix 2x in FlyP buffer met magnetische scheiding, en vervolgens respenderen in FlyP buffer. Gebruik voor resuspensie 10 μL per monster per plaat. FlyP-buffer is 100 mM NaCl, 50 mM tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Na grondig grondig van de magnetische kraal mix, aliquot 10 μL in ijskoude micro centrifugebuizen (één buis per monster). Voeg gelijke hoeveelheden lysaat (met genormaliseerde concentraties) toe aan elke buis voor immunoprecipitatie.
    7. Aliquot het lysaat-magnetische kraal mengsel in één buis voor elke plaat die wordt uitgevoerd; bijvoorbeeld voor een 2-plaat experiment, splitsen het lysaat in twee buizen. Plaats tubes op een Rotator bij 4 °C 's nachts voor immunoprecipitatie, bedekt om licht te houden.
  3. De test uitvoeren (dag 2)
    1. Begin met de lysate-magnetische kraal buizen voorplaat #1. Gebruik een magnetisch kraal rek om lysaat van de magnetische kralen te verwijderen en reserveer lysaat voor toekomstige analyse. Was kralen 2x in 500 μL ijskoude FlyP-buffer. Houd buizen buizen altijd op ijs of bij 4 °C.
    2. Bereken het volume van de resuspensie als (aantal sondes) * (2 technische replicaten) * (25 μL per put) * (1,1 voor Pipetteer fout). Respendeer IPs in het berekende volume van de ijskoude FlyP-buffer.
    3. Na grondig resuspende magnetische kralen door voorzichtig pipetteren, verdelen 25 μL per goed over een vlakke bodem 96 goed plaat, op ijs.
    4. In een andere 96-well plaat, verdunde biotinyleerd probe antilichamen tot 2x werkconcentratie (werkconcentratie is meestal 1:100 of 1:200, empirisch bepaald) in flyp buffer zodat de volgorde overeenkomt met de kolommen op de plaat indeling (Zie Figuur 3 ). Het laatste volume aan sonde-antilichamen bij de werkconcentratie is 50 μL per put, dus het volume van elk 2x antilichaam dat wordt bereid, dient te zijn (25 μL) * (aantal biologische monsters) * (2 technische replicaten) * (1,1 voor Pipetteer fouten).
    5. Gebruik een multikanaalspipet om 25 μL van elke verdunning van de sonde antilichamen in de magnetische kraal-bevattende test plaat te verdelen.
    6. Schud op een horizontale plaat Shaker om de magnetische kralen te mengen en te hervatten, en vervolgens te inbroeden bij 4 °C gedurende 1 uur, schudden bij 450 rpm in het donker.
    7. Was 3x met FlyP-buffer op een magnetische plaat ring bij 4 °C.
    8. Respendeer de magnetische kralen in 50 μL van 1:200 Streptavidin-PE.
    9. Schud om kralen te mengen en te remixen, en inincuberen bij 4 °C gedurende 30 minuten, schudden bij 450 rpm in het donker.
    10. Was 3x met FlyP-buffer op een magnetische plaat ring bij 4 °C.
    11. Respenderen in 125 μL FlyP-buffer.
    12. Schud gedurende 1 minuut bij 900 rpm om kralen grondig te hervatten.
    13. Uitvoeren op gekoelde flow-cytometer (Zie afbeelding in figuur S1). Gebruik de instelling ' High RP1 target ' in de flow cytometer-software en een stopvoorwaarde van 1.000 kralen per regio (het getal dat in een bepaald individu moet voorkomen dat de machine vroegtijdig stopt) en het monstervolume van 80 μL, wordt sterk overgeschoten.
    14. Pauzeer de run halverwege en hervat de kralen om te voorkomen dat ze worden bezinken.
    15. Exporteer gegevensbestanden in de. XML-indeling.
    16. Herhaal het proces voor de resterende platen, beginnend bij stap 3.3.1.

4. gegevensanalyse

Opmerking: de ANC-code is ontworpen om twee voorwaarden te vergelijken van N = 4-experimenten, elk met 2 technische replicaten voor elke aandoening. Bijvoorbeeld, cellen worden gestimuleerd vier onafhankelijke tijden, QMI wordt uitgevoerd op vier verschillende dagen op de controle (ongestimuleerd) en gestimuleerd cellen, met technische replicaten zoals hierboven, en data-analyse wordt voortgezet zoals hieronder beschreven.

  1. Adaptieve niet-parametrische met instelbare Alfa cutoff (ANC)
    1. Open MATLAB en stel de Active Directory in op een map met de onderdelen van het ANC-programma en de. XML-bestanden die worden geëxporteerd vanuit de flow cytometer.
    2. Vul het "ANC input" bestand in om de details van het experimentele ontwerp weer te geven. Het voorbeeldbestand dat in het aanvullende bestand is opgenomen, is vooraf ingevuld om de voorbeeldgegevens te kunnen uitvoeren, ook beschikbaar.
    3. Voer het programma uit, dat een CSV-bestand naar de Active Directory zal schrijven. Het bestand rapporteert vissen die significant verschillend zijn, op een vals positief (alpha) niveau van 0,05, tussen controle en experimentele omstandigheden, in alle 4 experimentele replicaten, of ten minste 3/4 replicaten.
    4. Opmerking ' ANC hits ', die worden gedefinieerd als vissen met aanzienlijke verschillen in ten minste 3 experimentele replicaten, weergegeven als 3/4 ∩ 4/4 in het bestand, voor gebruik in stap 4.3.1.
  2. Gewogen correlatie netwerk analyse23 (CNA)
    1. Plakken-Transponeer de kolomtitels van de uitvoer van het gegevensbestand door MATLAB eindigend in "_MFI. CSV "in de eerste rij van een nieuw Excel-blad. Voeg de kolommen "experiment" voor experiment nummer, en "behandeling", voor experimentele behandeling, of andere variabelen worden geanalyseerd. Sla dit bestand op als "Eigenschappen. csv".
    2. Open R Studio en stel de werkmap in op een map met de "_MFI. CSV "en" Eigenschappen. CSV "-bestanden.
    3. Voer de R-opdrachten uit zoals aangegeven in het becommentarieerde opdracht bestand en de gedetailleerde instructies in de bestanden. De wcna modules significant gecorreleerd met elke experimentele eigenschap zijn uitvoer als een grafisch bestand, en de correlatie van elke interactie IPi_probeJ met elke module wordt uitgevoerd als een CSV-bestand.
    4. Opmerking ' CNA hits, ' die worden gedefinieerd als interacties met module lidmaatschap (MM) > 0,7 en p < 0,05 voor lidmaatschap van een module die is geïdentificeerd als significant gecorreleerd met de experimentele variabele van belang, voor gebruik in stap 4.3.1.
  3. Positieve ' hits ' & visualisatie
    1. Voor elke interactie in de "3/4 ∩ 4/4 hits" lijst in het ANC uitvoerbestand (uit stap 4.1.4), identificeren als die interactie is ook een "CNA hit" door het controleren van de CNA output bestand (zie stap 4.2.6). Maak een nieuwe kolom die aangeeft of elke ANC-hit ook een CNA-hit is.
    2. Bereken de gemiddelde log2 -voudige veranderingswaarde voor elke ANC ∩ CNA hit door gemiddelden van de waarden in de ANC output spreadsheet "_hits. csv" uit stap 4.1.3. Converteer waarden naar Log2 fold verandering voor het gemiddelde. Voor interacties die significant waren in slechts 3/4 replicaties, verwijdert u de waarde uitschieter.
    3. Maak een spreadsheet met elke ANC ∩ CNA hit vermeld als een IP in één kolom, een sonde in de tweede kolom, en de fold verandering waarde in de derde kolom. Gebruik dit werkblad om een knooppunt randdiagram in Cytoscape te maken door het bestand als een netwerk te importeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Screening van antilichamen
Figuur 2 B toont de resultaten van een scherm voor de proteïne Connexin36. De meeste IP_probe-combinaties produceren geen signaal over IgG-besturingselementen. IP met het monoklonaal antilichaam 1E5 en sonde met 1E5 of het polyklonale antilichaam 6200 produceert een rechts verschuiving in de kraal verdeling in vergelijking met IgG-besturingselementen. Hier werden IP 1E5 en Probe 6200poly geselecteerd om te voorkomen dat hetzelfd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De QMI-test vereist substantiële investeringen in de ontwikkeling, apparatuur en reagentia van het antilichaam paneel, maar zodra de test is vastgesteld, kan men hoogdimensionale gegevens verzamelen die de proteïne-interactie netwerken observeren terwijl ze reageren op experimentaal gecontroleerde stimuli. Technisch vereist QMI zorgvuldige Pipetteer-en traceer controle van monster-en antilichaam goed locaties. Zorgvuldig labelen van de test platen is nuttig, zoals het maken van een gedetailleerd sjabloon van goed locatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen tessa Davis erkennen voor belangrijke bijdragen aan de ontwikkeling van QMI Assay, en aan huidige en voormalige leden van de laboratoria Smith en Schrum voor technische begeleiding en intellectuele input. Dit werk werd gefinancierd door NIMH subsidies R01 MH113545 en R00 MH 102244.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System met HTFBio Rad171000205gewijzigd om gedeeltelijk gekoeld te blijven, zie Figuur S1 voor details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML-kralenInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is het 3-cijferige kralengebied
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206gebruikt voor antilichaamzuivering
MESSigmaM3671
Microplate film, niet-sterieelUSA Scientific2920-0000
Phosphatase-remmercocktail #2SigmaP5726
Protease-remmercocktailSigmaP8340
Sandwich Prep KoelkastNorlakeSMP 36 15voor aangepaste koeling van Bioplex 200
NatriumfluorideSigma201154
NatriumorthovanadateSigma450243
Streptavidine-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kwantitatieve Multiplex ImmunoprecipitatieFlowcytometrie analyseMagnetische Bead ImmunoprecipitatieProte ne coassociatiesSignaaltransductiesystemenSelectie van AntilichaampanelStreptavidine PE labelingCytoscape Netwerkvisualisatie

Gerelateerde artikelen