Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Summary

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Abstract

Dynamische eiwit-eiwit interacties beheersen cellulair gedrag, van beweeglijkheid tot DNA-replicatie tot signaaltransductie. Het monitoren van dynamische interacties tussen meerdere eiwitten in een proteïne-interactie netwerk is echter technisch moeilijk. Hier presenteren we een protocol voor kwantitatieve multiplex-immunoprecipitatie (QMI), dat kwantitatieve beoordeling van vouw veranderingen in eiwit interacties mogelijk maakt op basis van relatieve fluorescentie metingen van eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde Oppervlakte epitopen (vissen). In QMI worden eiwitcomplexen van celllysates op microsferen immunoprecipitated en vervolgens gepropageerd met een gelabeld antilichaam voor een ander eiwit om de overvloed aan vissen te kwantificeren. Immunoprecipitation-antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende MagBead-spectrale gebieden, waardoor een flow-cytometer meerdere parallelle immunoprecipitaties kan differentiëren en tegelijkertijd de hoeveelheid sonde-antilichamen die aan elk is gekoppeld, kwantificeren. QMI vereist geen genetische tagging en kan worden uitgevoerd met behulp van minimale biomateriaal in vergelijking met andere immunoprecipitatie-methoden. QMI kan worden aangepast voor elke gedefinieerde groep van de interactie eiwitten, en is tot nu toe gebruikt voor het karakteriseren van signalering netwerken in T-cellen en neuronale glutamaat synapsen. Resultaten hebben geleid tot nieuwe hypothese generatie met potentiële diagnostische en therapeutische toepassingen. Dit protocol bevat instructies voor het uitvoeren van QMI, vanaf de initiële selectie van het antilichaam-panel tot en met het uitvoeren van assays en het analyseren van gegevens. De initiële assemblage van een QMI-test omvat het screenen van antilichamen voor het genereren van een panel en het empirisch bepalen van een geschikte lysisbuffer. Het daaropvolgende reagens preparaat omvat covalent koppelen van immunoprecipitatie antilichamen tegen MagBeads, en biotinylating probe antilichamen, zodat ze kunnen worden gelabeld door een streptavidine-geconjugeerd fluorophore. Om de test uit te voeren, wordt lysaat 's nachts gemengd met magbeads, en vervolgens worden kralen verdeeld en geïntrigeerd met verschillende sonde-antilichamen, en vervolgens een de-label, en gelezen door flow cytometrie. Er worden twee statistische tests uitgevoerd om vissen te identificeren die significant verschillen tussen de experimentele omstandigheden, en de resultaten worden gevisualiseerd met behulp van Heatmaps of node-Edge diagrammen.

Introduction

Dynamische eiwit-eiwit interacties vormen de moleculaire signalering Cascades en beweeglijke structuren die de functionele basis van de meeste cellulaire fysiologie zijn¹. Deze processen worden vaak afgebeeld als lineaire signalerings trajecten die schakelen tussen stabiele toestanden op basis van enkelvoudige ingangen, maar experimentele en modellerings gegevens tonen duidelijk aan dat ze functioneren als geïntegreerde netwerken^{2,3, 4}. in het geval van G-eiwitten hebben verschillende receptoren vaak de mogelijkheid om hetzelfde g-eiwit te activeren, ....

Protocol

1. ontwerp van de assay

1. Voorbereiding van kandidaat-antilichamen
   1. Voor elk eiwit van belang, kies 3 tot en met 5 antilichamen op het scherm. Gebruik indien mogelijk monoklonale antilichamen die verschillende epitopes herkennen. Ook een niet-specifieke controle antilichamen bevatten.
   2. Om tris te verwijderen, voert u buffer uitwisseling uit door het antilichaam toe te voegen aan een 30 kDa-spin filter, te draaien tot het minimum volume, 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen en 3 keer te herhalen. Om drager eiwitten te verwijderen, voert u de antilichaam zuivering uit volgens het Protocol van de fabrikant (Zie tabel....

Results

Screening van antilichamen
Figuur 2 B toont de resultaten van een scherm voor de proteïne Connexin36. De meeste IP_probe-combinaties produceren geen signaal over IgG-besturingselementen. IP met het monoklonaal antilichaam 1E5 en sonde met 1E5 of het polyklonale antilichaam 6200 produceert een rechts verschuiving in de kraal verdeling in vergelijking met IgG-besturingselementen. Hier werden IP 1E5 en Probe 6200poly geselecteerd om te voorkomen dat hetzelfd.......

Discussion

De QMI-test vereist substantiële investeringen in de ontwikkeling, apparatuur en reagentia van het antilichaam paneel, maar zodra de test is vastgesteld, kan men hoogdimensionale gegevens verzamelen die de proteïne-interactie netwerken observeren terwijl ze reageren op experimentaal gecontroleerde stimuli. Technisch vereist QMI zorgvuldige Pipetteer-en traceer controle van monster-en antilichaam goed locaties. Zorgvuldig labelen van de test platen is nuttig, zoals het maken van een gedetailleerd sjabloon van goed locatie.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat bottomed plates	Bio Rad	171025001
96-well PCR plates	VWR	82006-704
Bioplex 200 System with HTF	Bio Rad	171000205	modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station	Bio Rad	30034376
BSA	Sigma
CML beads	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Microspheres	Luminex	MC12xxx-01	xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit	Thermo Scientific	45206	used for antibody purification
MES	Sigma	M3671
Microplate film, non-sterile	USA Scientific	2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2	Sigma	P5726
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
Sandwich Prep Refrigerator	Norlake	SMP 36 15	for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride	Sigma	201154
Sodium orthovanadate	Sigma	450243
Streptavidin-PE	BioLegend	405204
Sulfo NHS	Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152