In dit rapport beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bestuderen van neuriet uitgroei in embryonale rat corticale neuronen door co-transfecting met EGFP en het eiwit van belang.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neuriet uitgroei is een fundamenteel voorval in de vorming van de neurale circuits tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Ernstige neuriet schade en synaptische dysfunctie optreden in verschillende neurodegeneratieve ziekten en leeftijdsgebonden degeneratie. Onderzoek van de mechanismen die neuriet uitgroei reguleren zou niet alleen waardevolle licht werpen op de ontwikkeling van de hersenen processen, maar ook op dergelijke neurologische aandoeningen. Vanwege de lage transfectie-efficiëntie is het momenteel uitdagend om het effect van een specifiek eiwit op neuriet uitgroei in primaire zoogdieren neuronen te bestuderen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het onderzoek naar neuriet uitgroei door de co-transfectie van primaire rat corticale neuronen met EGFP en een eiwit van belang (POI). Deze methode maakt de identificatie mogelijk van POI-getransfunde neuronen via het EGFP-signaal, en dus kan het effect van de POI op neuriet-uitgroei nauwkeurig worden bepaald. Deze EGFP-gebaseerde assay biedt een gemakkelijke aanpak voor het onderzoek van trajecten reguleren van neuriet uitgroei.
Inleiding
Neurites, met inbegrip van zowel axonen en dendrites, zijn de projecties van neuronen die betrokken zijn bij de oprichting van de neurale netwerken. De dynamische uitgroei van neurites is essentieel voor neuro ontwikkeling. De onderliggende regelgevings mechanismen eronder blijven echter onduidelijk. In het bijzonder, neuriet schade wordt vaak waargenomen in verschillende neurodegeneratieve ziekten en na hersenletsel1. Daarom zou onderzoek naar de rollen van putatieve moleculen in verschillende neuriet uitgroei regelgevende trajecten ons begrip van het proces verbeteren. Bovendien, het kan onthullen nieuwe therapeutische doelen voor verschillende neurologische aandoeningen. Neuronale cellijnen zijn waardevolle modellen voor het bestuderen van neuronale processen met inbegrip van neuriet uitgroei als ze zijn gemakkelijk te manipuleren en transfect2,3. Echter, genetische drift is gemeld te voorkomen in sommige veelgebruikte cellijnen, die kunnen leiden tot variaties in hun fysiologische reacties4. Bovendien is differentiële eiwit expressie aangetoond tussen neuronale cellijnen en primaire neuronen. Bijvoorbeeld, PC12, een neuronale cellijn afgeleid van Rat bijnier die op grote schaal wordt gebruikt voor het bestuderen van neuriet uitgroei2,3, doet niet Express NMDA receptoren5. Bovendien is voorgesteld dat de verminderde responsiviteit van de muis neuroblastoom lijn neuro-2a naar neurotoxines in vergelijking met primaire neuronen is te wijten aan het gebrek aan expressie van bepaalde membraan receptoren en ionenkanalen6. Daarom, primaire neuronen zijn een meer wenselijk en representatief model voor het onderzoek van neuriet uitgroei. Echter, het gebruik van primaire neuronen wordt belemmerd door hun lage transfectie-efficiëntie7.
Hier beschrijven we een methode waarbij de co-transfectie van het eiwit van belang (POI) en EGFP aan primaire rat corticale neuronen. De EGFP fungeert als een morfologische marker voor de identificatie van succesvol getransfunde neuronen en maakt de meting van neurites mogelijk. We gevalideerd deze methode met behulp van verbindingen/moleculen die zijn gemeld aan het moduleren van neuriet uitgroei. Bovendien, FE65, een neuronale adapter eiwit dat is aangetoond dat het stimuleren van neuriet uitgroei, werd gebruikt ter illustratie van deze aanpak8,9. Dit protocol omvat (1) de isolatie van primaire corticale neuronen van embryonale dag 18 (E18) Rat embryo's, (2) de co-transfectie van neuronen met EGFP en de POI (FE65 in deze studie) en (3) de beeldvorming en analyse van de neuronen met behulp van de beeldverwerking software ImageJ met de NeuronJ plugin10,11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle gevolgde procedures waren in overeenstemming met de ethische normen van het ethische comité dier experimenten van de Chinese Universiteit van Hongkong.
1. voorbereiding van de Dekstroken
- Plaats een steriele 18 mm circulaire afdek in elke put van een 12-well weefselkweek plaat.
- Mantel de dekslip met 5 μg/mL poly-D-Lysine oplossing in een bevoficeerde 37 °C incubator gedurende ten minste 1 uur.
- Aspireren de poly-D-Lysine-oplossing van de weefselcultuur plaat en spoel de gecoate dekstroken eenmaal met steriel water.
2. rat embryonale neuron dissectie
- Offer een getimede-zwangere Sprague-Dawley rat op een zwangerschaps leeftijd van 18 dagen (E18) door beide cervicale dislocatie of CO2 asphyxiation.
Opmerking: Controleer de lokale regelgeving voor het offeren van zwangere ratten. - Open de buikholte van de zwangere rat met ontleed schaar en breng de baarmoeder over naar een 10 cm Petri schaaltje.
- Open de baarmoeder en de amniotische zak voorzichtig met een kleine ontleed schaar en verwijder de placenta van het embryo van de rat met behulp van een kleine ontleed schaar. Breng het hele embryo over in een 10 cm Petri schaaltje met voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met glucose (PBS-glucose, 10 mM natrium fosfaten, 2,68 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride en 3 g/L glucose) met behulp van een paar kleine Tang.
- Snijd langs het sagittale hecht deel van de schedel en open het zorgvuldig met een paar kleine ontleden schaar. Breng het embryonale brein over met een kleine platte spatel naar een 10 cm Petri schaaltje met ijskoude PBS-glucose.
- Scheid de twee hersenhelften van het cerebellum en de hersenstam met behulp van twee #5 pincet onder een dissectie Microscoop.
Opmerking: Raadpleeg referentie12 voor de structuur van de hersenen van de rat. - Verwijder de hersenvliezen met de #5 pincet.
- Isoleer de cortex van de hersenhelften met twee rechte #5 pincet.
- Breng de geïsoleerde cortex over naar ijskoude PBS-glucose in een 15 mL centrifugebuis.
3. primaire corticale neuron cultuur
Opmerking: Alle procedures in stap 3 en 4 worden uitgevoerd in een klasse II Biosafety Cabinet.
- Plaats de geïsoleerde cortex gedurende 5 minuten op 4 °C en zuig de PBS-glucose op.
- Voeg 1 mL 0,05% trypsine-EDTA toe aan de geïsoleerde cortex en meng zachtjes door het weefsel gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C te tikken en te inbroed om enzymatische spijsvertering mogelijk te maken. Tik de buis zachtjes om de 2 minuten te mengen.
- Voeg 4 mL onderhouds medium (bijv. Neurobasal medium) toe aan het weefsel/trypsine-mengsel.
Opmerking: Al het onderhouds medium dat in dit protocol wordt gebruikt, wordt aangevuld met Penicillair-streptomycine en B-27 supplement13. - Dissociëren het weefsel zachtjes door trituratie met behulp van een 1 mL pipet.
- Pellet de gedissocieerde cellen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant.
- Herhaal de stappen 3,5 tot en met 3,7 tweemaal.
- Respendeer de celpellet in 1 mL onderhouds medium.
- Voeg 10 μL 0,4% Trypeen blauwe oplossing toe aan een celsuspensie van 10 μL voor het tellen van levensvatbare cellen met een hemocytometer.
- Plaat de neuronen met een dichtheid van 65.000/cm2 (levensvatbare cellen) in 1 ml onderhouds medium per put in een 12-well plaat.
4. celtransfectie en fixatie
- Na 2 dagen in vitro (DIV2), transfect 0,5 μg EGFP construct (pEGFP-C1) samen met of zonder van 0,5 μg NP met behulp van 1 μL transfectie reagens (bijv. Lipofectamine 2000). Gebruik de instructies van de fabrikant.
Opmerking: De uitdrukkings constructies voor zoogdieren werden bereid met behulp van een endotoxine gratis plasmide voorbereidings Kit. Behandeling met chemicaliën/moleculen (in dit manuscript cytochalasin D (CYTO D) en zenuw groeifactor (NGF) werden gebruikt) kan worden gedaan om 6 h na transfectie. - Aspirate de cultuurmedium 24 h post-transfectie en was de getransfunde cellen eenmaal met 37 ° c PBS (10 mM natrium fosfaten, 2,68 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride).
- Repareer de cellen met 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Was de vaste cellen drie keer met PBS.
- Voeg een minimale hoeveelheid fluorescentie-bevestigings medium toe op een Microscoop-glas glijbaan. Breng het afdekplaatje voorzichtig over van de 12-put plaat op het afdekmedium met het monster naar de glazen glijbaan.
Opmerking: Sluit de rand van de Afdeklijst af met nagellak als er een waterig afdekmedium wordt gebruikt.
5. meting van de neuriet uitgroei
- Gebruik een 40x doelstelling voor het vastleggen van beelden met een epi-fluorescerende Microscoop.
- Leg beelden vast van ten minste 40 intact neuronen met EGFP-signaal per trans fectie.
- Open het vastgelegde beeld in imagej-software met de neuronj-plugin11 om de lengte van de langste neuriet te meten, van het cellichaam tot het puntje van de groei kegel, van elk afbeelding gemaakt neuron.
- Analyseer de gegevens die zijn verkregen met de software om het effect van de beoogde eiwitten in neuriet uitgroei te bepalen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om deze methodologie te testen, we gebruikten cyto D en zenuw groeifactor NGF, die is aangetoond dat remt en stimuleren van neuriet uitgroei respectievelijk14,15,16. De neuriet lengte van neuronen getransffecteerd met EGFP werden gemeten na behandeling met cyto D of NGF. De transfectie-efficiëntie van EGFP naar de neuronen was 2,7% (1.068 neuronen geteld). Zoals getoond in Fi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zoals eerder vermeld, PC12 en de subclones worden op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neurite uitbreiding omdat ze uitstekende transfectie efficiëntie2,3. In tegenstelling, primaire neuronen hebben een lage transfectie tarief, dat is een groot obstakel voor het bestuderen van neuriet uitgroei regulators door transfectie7. Hier beschrijven we een handig protocol voor het kwantificeren van neuriet uitgroei in primaire neuronen. ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door fondsen van de Raad voor onderzoeksbeurzen Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), cuhk direct subsidie Scheme, het United College begiftiging Fund en de tuyf liefdadigheid Trust.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilizeer voor gebruik |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Opgelost in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Zie a.u.b. verwijzingen 8 en 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
Referenties
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18(2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899(2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
