Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Inducerende meningokokken meningitis serogroep C in muizen via Intracisternal Delivery

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60047

⸱

5 november 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 2Department of Science and Technology, Sannio University, 3CEINGE – Advanced Biotechnology

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een methode om meningokokken meningitis te induceren via een intracisternale infectie route bij volwassen muizen. We presenteren een stap voor stap Protocol van meningokokkeninfectie van de bereiding van entmateriaal tot de intracisternale infectie; Noteer vervolgens de overleving van het dier en evalueer de bacteriële ladingen in muriene weefsels.

Samenvatting

Neisseria meningitidis (Meningococcus) is een micro-organisme met een smal hostbereik, wereldwijd erkend als de belangrijkste oorzaak van bacteriële meningitis. Meningokokken is een voorbijgaande kolonisator van humane Nasofarynx van ongeveer 10% van het gezonde onderwerp. In bijzondere omstandigheden, het krijgt een invasieve vermogen om te penetreren de mucosale barrière en binnenvalt de bloedbaan veroorzaakt septikemie. In het laatste geval kan fulminating sepsis ontstaan, zelfs zonder de daaruit voortvloeiende ontwikkeling van meningitis. Omgekeerd, bacteriën kunnen slecht vermenigvuldigen in de bloedbaan, kruis de bloed-hersen barrière, bereiken het centrale zenuwstelsel, leidt tot fulminante meningitis. De Murine modellen van bacteriële meningitis vertegenwoordigen een nuttig instrument om te onderzoeken van de gastheer-pathogen interacties en voor het analyseren van de pathogenetische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze dodelijke ziekte. Hoewel verschillende experimentele modelsystemen in de afgelopen decennia zijn geëvalueerd, waren geen van deze in staat om de karakteristieke pathologische gebeurtenissen van Meningokokkenziekte te reproduceren. In dit experimentele protocol beschrijven we een gedetailleerde procedure voor de inductie van meningokokken meningitis in een muismodel op basis van de intracisternale inoculatie van bacteriën. De bijzondere tekenen van menselijke meningitis werden geregistreerd in de Murine gastheer door de beoordeling van klinische parameters (bv. temperatuur, lichaamsgewicht), evaluatie van overlevingskansen, microbiologische analyse en histologisch onderzoek van hersenletsel. Bij gebruik van intracisternal (i. CIST.) entmateriaal, meningokokken complete levering rechtstreeks in Cisterna magna, wat leidt tot een zeer efficiënte meningokokken replicatie in het hersenweefsel. Een 1.000-voudige toename van levensvatbare telling van bacteriën wordt waargenomen bij ongeveer 18 uur. Bovendien worden meningokokken ook aangetroffen in de milt en de lever van geïnfecteerde muizen, wat suggereert dat de lever een doelorgaan voor meningokokken replicatie kan vertegenwoordigen.

Inleiding

Neisseria meningitidis is een gram negatief β-proteobacterium beperkt tot de menselijke gastheer, bekend als een van de meest voorkomende oorzaken van meningitis en sepsis in de menselijke populatie over de hele wereld. Het koloniseert de bovenste luchtwegen (neus en keel) van gezonde en asymptomatische dragers (2-30% van de bevolking), maar de bacterie ontwijkt soms verschillende gastheer immuun afweer en verspreidt zich van de bloedbaan naar de hersenen waardoor een ongecontroleerde lokale ontsteking, bekend als meningokokken meningitis. Een combinatie van host-en bacteriële factoren lijkt bij te dragen aan de overgang van de commensaal naar het invasieve gedrag1.

N. meningitidis is uitsluitend gespecialiseerd in menselijke kolonisatie en infectie. Het heeft een smal ontvangstbereik en heeft daarom beperkte in vivo pathogenese studies als gevolg van het ontbreken van geschikte diermodellen die de menselijke Meningokokkenziekte reproduceren. Dientengevolge, het had geleid tot fundamentele lacunes in het begrip met betrekking tot de pathogenese van septicemie en meningitis veroorzaakt door meningokokken. In de laatste decennia, de ontwikkeling van veel in vitro systemen toegestaan de identificatie van verschillende meningokokken virulentie factoren2,3,4. Hoewel deze waardevolle studies belangrijke inzichten hebben verschaft om de rol van deze factoren voor een succesvolle meningokokkeninfectie te begrijpen, konden deze modellen geen beoordeling geven van de gevolgen van bacteriële interacties met de humorale en cellulaire immuunsysteem en nog minder met het hele weefsel. In vivo diermodellen van infectie zijn ook van groot belang voor de evaluatie van de beschermingsgraad die wordt toegekend door vaccinformuleringen. Als humaan-Tropic pathogeen bezitten meningokokken geschikte determinanten die nodig zijn voor een succesvolle infectie, zoals Oppervlaktestructuren (d.w.z. type IV pili en opaciteits eiwitten) en ijzeropname systemen voor menselijke receptoren en transporteiwitten (d.w.z. transferrine en lactoferrine)5,6,7 om goed te hechten, te overleven en de menselijke gastheer binnen te vallen. Tot slot dragen de genetische variatie capaciteiten van de pathogeen bij tot het ontwijken en/of blokkeren van de menselijke immuunrespons verder bij aan het hoge soort tropisme8,9. Daarom kan de afwezigheid van specifieke gastheerfactoren, die betrokken zijn bij de interactie, stappen van de levenscyclus van het pathogeen blokkeren, waardoor aanzienlijke moeilijkheden ontstaan bij de ontwikkeling van kleine diermodellen met een samenvatting van de meningokokken levenscyclus.

In de afgelopen decennia zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om ons begrip van de meningokokken infectieuze cyclus te verbeteren. Infecties van twee diermodellen, muizen en ratten, ofwel intraperitoneaal (i.p.) of intra lateraal (i.n.), werden ontwikkeld om Meningokokkenziekte te reproduceren10,11,12,13,14 ,15,16,17. De laboratorium muis is waarschijnlijk een van de veelzijdiger dieren voor het induceren van experimentele meningokokkeninfectie.

Echter, de i.p. manier van infectie leidt tot de ontwikkeling van ernstige sepsis, hoewel het niet de natuurlijke route van de infectie nabootsen, terwijl de i.n. infectie route nuttig was om meningokokken pathogenese te evalueren, hoewel het longinfectie kan induceren vóór sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.

Het i.p. muismodel was een belangrijke rol om de bescherming tegen de meningokokken Challenge10,11,12te beoordelen. Het muismodel van meningokokken kolonisatie op basis van de i.n. besmettingsroute is ontwikkeld met zuigelingen muizen, omdat ze gevoeliger zijn voor meningokokken, om een invasieve infectie te reproduceren die het beloop van de Meningokokkenziekte bij mensen nabootsen 13,14,15,16,17. Bovendien werd, ter bevordering van meningokokken replicatie in de Murine-gastheer, ook een groeiend aantal technische strategieën toegepast, waaronder de toediening van het ijzer aan de dieren om de infectie te verbeteren, het gebruik van hoog bacterieel entmateriaal, muis-doorgang bacteriestam evenals de tewerkstelling van zuigeling of immuungecompromitteerde dieren hosts10,13,15,18,19. De expressie van specifieke menselijke factoren zoals CD4620 of transferrine21 heeft de gevoeligheid van muizen voor deze humane-trope bacterie verhoogd; de tewerkstelling van het xenotransplantaatmodellen is-infectie model van de menselijke huid is ook nuttig geweest om de wrijvings capaciteit van meningokokken te evalueren op humaan endotheel22,23. Gezamenlijk heeft de recente ontwikkeling van gehumaniseerde transgene muizen het begrip van de meningokokken pathogenese en de interacties van de gastheer verbeterd.

Eerder ontwikkelden we een muriene model van meningokokken meningitis waarbij de inoculatie van bacteriën werd uitgevoerd in de Cisterna magna van volwassen muizen met muis-doorgangen van bacteriën24. Klinische parameters en de overlevingskans van geïnfecteerde muizen toonden de oprichting van meningitis met kenmerken vergelijkbaar met die gezien in de menselijke gastheer, evenals, de microbiologische en histologische analyses van de hersenen. Uit deze geïnfecteerde muizen, bacteriën waren, ook, teruggewonnen uit bloed, lever, en milt, en bacteriële ladingen van perifere organen gecorreleerd met de infectieuze dosis. In het bijzonder werd dit model gebruikt om de virulentie van een isogene Mutant stam defect in de L-glutamaattransporter GltT24te evalueren. Onlangs, met behulp van onze muismodel van meningokokken meningitis op basis van i. CIST. route met serogroep C stam 93/42862,24 en een isogene Mutant defect in cssa gen codering voor UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase25, hebben we de rol van blootgestelde sialuzuur geanalyseerd in de inrichting van de ziekte bij muizen.

In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om experimentele meningokokken meningitis te induceren op basis van de i. CIST. infectie route in Balb/c volwassen muizen. Deze methode is met name nuttig voor de karakterisering van meningokokkeninfectie in een muriene gastheer, evenals voor de beoordeling van de virulentie tussen wild type referentie stammen en isogene mutanten. De intra-cisterne-infectie route zorgt voor een volledige levering van het meningokokken rechtstreeks in de Cisterna magna, die op zijn beurt de bacteriële replicatie in de cerebrospinale vloeistof (CSF) vergemakkelijkt en meningitis induceert met functies die die nabootsen aanwezig bij de mens2,24,25,26.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol werd uitgevoerd om dierenleed te minimaliseren en het aantal muizen te verminderen in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 24 november 1986 (86/609/EEG). In vivo werden de in deze studie gerapporteerde experimenten goedgekeurd door het ethisch Dierenzorg-en gebruiks Comité (prot. nummer 2, 14 december 2012) en het Italiaanse ministerie van volksgezondheid (prot. Number 0000094-A-03/01/2013). Alle procedures moeten worden uitgevoerd binnen de Biosafety Cabinet 2 (BSC2) in een BSL2 kamer, en het potentiële geïnfecteerde afval moet worden weggegooid in speciale containers.

1. infectie van muizen met N. meningitidis serogroep C stam

Let op: N. meningitidis is mogelijk een schadelijk pathogeen en alle nodige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij de behandeling van dit micro-organisme. De volledige experimenten vereist Biosafety niveau 2 (BSL2) containment. De onderzoeker die betrokken is bij dierproeven moet voor de duur van het experiment persoonlijke beschermingsmiddelen voor eenmalig gebruik (PBM) dragen.

  1. Bereiding van bacteriën voor in vivo infectie studies
    1. Kies een enkele kolonie uit een verse Neisseria meningitidis cultuur op GC (Gonococcal) agar plaat aangevuld met 1% (vol/vol) Polyvitox supplement en inoculeren in 10 ml GC Bouillon.
    2. Kweek de bacteriën bij 37 °C in een orbitale Shaker incubator met een snelheid van 220 rpm. Blijf de O.D. van de cultuur controleren met een spectrofotometer. Kweek de cultuur tot de vroege exponentiële fase bij een optische dichtheid OD600nm van 0,7, overeenkomend met ≈ 7 x 108 CFU/ml.
    3. Als de vereiste O.D. is verkregen, moet u bevroren voorraden maken door 10% glycerol toe te voegen. Doseer 1 mL van de kweek in de cryoflesjes. Bewaar de injectieflacons bij-80 °C tot het gebruik.
      Opmerking: Hoewel het beter is om verse bacteriële cultuur te gebruiken, werden bevroren voorraden gebruikt om het in vivo-experiment te vereenvoudigen en te standaardiseren. Meestal zijn de bevroren voorraden binnen ongeveer 6 maanden na de bereiding werkzaam geweest.
    4. Voor de infectie, ontdooien bevroren bacteriën bij kamertemperatuur.
    5. Oogst de bacteriële cellen door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 1.500 x g en respendeer in 1 ml verse GC bouillon met ijzer dextran (5 mg/kg).
      Opmerking: De GC-Bouillon wordt bereid met de toevoeging van ijzer dextran (5 mg/kg) om de replicatie van meningokokken in het gastheer weefsel14,18,27te bevoordelen.
    6. Voor het gebruik, uitvoeren van levensvatbare graven van bacteriën om te bepalen van het exacte aantal CFU voor infectie. Om dit te doen, haalt u 10 μL bacteriële suspensie op en gaat u verder met seriële verdunningen en verspreidt u elke verdunning op GC agar-platen en bebroed u bij 37 °C met 5% CO2, voor 18-24 uur.
  2. Intra-cisterne injectie van muizen
    Opmerking:De hele procedure wordt uitgevoerd in de laminaire flowkast om aseptische condities te behouden.
    1. Huis laboratorium muizen (8 weken-oud, vrouwelijke Balb/c) onder specifieke pathogeen vrije condities. Geef voedsel pellets en water ad libitum.
    2. Vereffen de dieren in de nieuwe omgeving voor 1 week voordat u begint met het experiment.
    3. Weeg en evalueer de lichaamstemperatuur voordat u met het experiment begint.
      Opmerking: De inteelt Balb/c vrouwelijke muizen van acht weken oud wegen gemiddeld ongeveer 19 g. De gemiddelde temperatuur van laboratorium muizen fysiologisch variërend van 36-38 °C24.
    4. Scruff het dier uit de nek, reinig het abdomen gebied met de 70% ethanol en Injecteer i.p. ijzer dextran (opgelost in 1% fosfaat zout buffer, 250 mg/kg) in de rechteronderkwadrant van de buik van de Murine met behulp van een 25 G naald 0,5 mm x 16 mm , ongeveer 2-3 h voor de infectie.
      Opmerking: De intraperitoneale injectie werd uitgevoerd in het rechteronderkwadrant van de buik van de Murine om beschadiging van buikorganen zoals urineblaas, Cecum, etc. te voorkomen. De toediening van exogene ijzer bron, in de vorm van ijzer dextran, aan dieren voorafgaand aan de infectie gunsten de bacteriële vermenigvuldiging in de gastheer14,18,27.
    5. Na 2-3 h, voer dieren anesthesie met ketamine (50 mg/kg) en xylazine (3 mg/kg) en oftalmisch smeermiddel.
    6. Controleer op de diepte van de anesthesie door ervoor te zorgen dat de afwezigheid van pijn reactie bij het knijpen van de teen.
    7. Plaats de muis in borstbeen decubitus en strek de ledematen en de cervicale wervelkolom zorgvuldig uit om de ruggengraat in een rechte positie te houden.
    8. Meng de bacteriële suspensie zachtjes om een consistente suspensie te behouden voordat u een injectiespuit van 30 G naald x 8 mm laadt.
      Opmerking: De bacteriële suspensie zo dicht mogelijk bij de injectie tijd bereiden; Bewaar het ondertussen bij kamertemperatuur.
    9. Op basis van het na ontdooien van de bacteriële titer (kve/mL), gaat u verder met de berekening van het totale te gebruiken CFU, met betrekking tot het totale aantal te besmet dieren (CFU bacteriële dosis per aantal dieren). Ga verder met de berekening van het exacte volume dat uit de injectieflacon moet worden genomen om de totale KFU te verkrijgen die een verhouding tussen de post dooien van bacteriële titer (kve/mL) en de totale KFU nuttig is voor de infectie van n muizen (post ontdooien van bacteriële titer CFU : ml = totaal kve: x). het eindvolume vaststellen met betrekking tot het totale aantal besmette dieren.
      Opmerking: Bij deze experimenten werd een breed scala aan titer van 104 tot 109 per dier gebruikt.
    10. Reinig het chirurgische gebied met 70% ethanol.
    11. Identificeer het injectie punt met behulp van een naald en Injecteer de vastgestelde CFU van meningokokken (wild type stam en isogene Mutante stam), of GC-Bouillon aangevuld met ijzer dextran (5 mg/kg) als controle, in een totaal volume van 10 μL in de Cisterna magna van muizen door een occipitale Braam opening met een 30 G naald x 8 mm.
      1. Voer de cisternal entmateriaal door het plaatsen van de naald op de craniocervicale kruising, met name in de dorsale subarachnoïdale ruimte. Ventroflex het hoofd om deze ruimte toegankelijk te maken28.
      2. Kort, plaats het dier in laterale ligigheid, houd de oren uit de weg en buig de nek matig (90 tot 100 °). Zorg ervoor dat de middenlijn van de nek en het hoofd (van de neus tot de occiput) in perfecte parallelle positie op het tafelblad staan.
      3. Raak de vleugels van de atlas aan en zorg ervoor dat ze elkaar overlappen, waardoor axiale rotatie wordt geëlimineerd. Een natuurlijke inkeping kan meestal worden aangeraakt op de middenlijn waar de naald het meest waarschijnlijk het occipitale gat binnenkomt.
      4. Gooi de spuit en naald veilig weg na de injectie van muizen met Neisseria.
    12. Plaats het dier in de kooi en wacht op het ontwaken en volledig herstel van de beweging.
    13. Houd de kooien met geïnfecteerde muizen onder een laminaire flowkast.
    14. Monitor muizen, 24 uur na infectie, voor klinische verschijnselen van Coma volgens de Coma schaal29. Coma schaal: 1 = Coma, 2 = staat niet rechtop nadat hij op de achterkant is gedraaid, 3 = rechtop binnen 30 s, 4 = rechtop binnen 5 s, minimale ambulante activiteiten, 5 = normaal.
       Opmerking: Wanneer bij dieren pijn werd geconstateerd, werd analgesie met Meloxicam (5 mg/kg i.p. voor de duur van de studie) toegediend.
    15. Ga verder voor de Animal Survival of CFU counts assay op de geïnfecteerde dieren zoals beschreven in stap 2.
    16. Uitvoeren van euthanasie van muizen met een Score van 2 door cervicale dislocatie en opnemen als dood voor statistische analyse.

2. overleving van dieren en aantal CFU

  1. Overleving van dieren
    1. Bereid bacteriële entmateriaal bij verschillende doseringen (variërend van 104 tot 109 CFU per muis) om dieren te infecteren door de i. CIST. route (zie stap 1,2).
    2. Inoculeren controle muizen met GC Bouillon, aangevuld met ijzer dextran (5 mg/kg), op dezelfde manier.
    3. Monitor dieren voor klinische symptomen: gegolfde vacht, opgejakt uiterlijk, hypothermie, gewichtsverlies, lethargie of stervende24,25,26,30, elke dag gedurende het hele experiment voor 168 h (7 dagen) ten minste tweemaal per dag gedurende de duur van het experiment.
    4. Meet het lichaamsgewicht en de temperatuur met behulp van een digitale balans en een rectale thermometer, respectievelijk elke dag.
    5. Noteer het voortbestaan van muizen voor een week.
      Opmerking: Noteer de natuurlijke dood van dieren post infectie terwijl de dieren die een coma waarde van 2 of die overleven meer dan 168 h observatie zal worden geëualiseerd.
    6. Anesthetiseer muizen met een coma-waarde van 2 of die overleven over de observatietijd met ketamine (50 mg/kg) en xylazine (3 mg/kg) en breng oftalmische zalf aan.
    7. Controleer of de pijn reactie afwezig is door een teen pinch.
    8. Uitvoeren van euthanasie van muizen door cervicale dislocatie en opnemen als dood voor statistische analyse.
  2. Evaluatie van kolonie vormende eenheden (CFU) telt in perifere organen
    1. Gebruik een subletale bacteriële dosis (5 x 105kve/muizen) op basis van dierlijke overlevings resultaten om dieren te beënten door de i. CIST. de route (Zie onderafdeling 1,2).
    2. Bewaak de rectale temperatuur elke dag tijdens de infectie en het uitvoeren van anesthesie van dieren op 48 h post infectie zoals vermeld in stap 2.
    3. Ga verder met de 70% ethanol desinfectie van de borstkas en zuig 600-700 μL bloed op door een hart punctie van de borstholte met een 25 G naald van 0,5 mm x 16 mm.
    4. Verzamel het bloed in een buisje met 3,8% Natriumcitraat en bewaar bij-80 °C voor de latere levensvatbare bacteriecellen.
    5. Voer cervicale dislocatie om de dieren op te offeren. Bevestig de dood opname de afwezigheid van hartslag, na het opofferen van de muis volgens alle relevante institutionele en ethische richtlijnen.
    6. Leg de muis in de liggende positie en gebruik een schaar en een tang om door te gaan met de snede van de vacht langs het sagittale vlak van het lichaam. Bevestig de huid met de vacht aan de zijkanten van het lichaam met pinnen.
    7. Knip het peritoneale membraan af met een scherpe schaar. Gebruik een schaar en wegwerp tang om de organen (bijv. milt en lever) te accijnzen en zet ze in een steriele Petri schaal met 1 mL GC Bouillon aangevuld met 10% (vol/vol) glycerol.
    8. Gooi de muis Body veilig af volgens de IACUC-richtlijnen.
    9. Homogeniseer de organen mechanisch bij kamertemperatuur met de zuiger van een 5 mL spuit voor ongeveer 2-3 min totdat een eencellige suspensie wordt gevormd en breng deze over in een buis.
    10. Leg de buis met het gehomogeniseerde weefselmonster onmiddellijk op het droogijs.
      Opmerking: Monsters kunnen worden bewaard bij-80 °C in een 2 mL steriele buis voor het uitvoeren van de levensvatbare bacteriële celtellingen evaluatie op latere punten.
    11. Maak GC agar-platen met antibiotica indien nodig. Droog de platen voorafgaand aan het gebruik vóór incuberen bij 37 °C gedurende 2-3 uur.
    12. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van de monsters in GC-Bouillon van elk gehomogeniseerd weefsel en plaat op GC agar-platen. Incuberen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2.

3. bereiding van Hersenweefsels voor CFU Count

  1. Gebruik een subletale bacteriële dosis (5 x 105 kve/muizen) op basis van dierlijke overlevings resultaten om dieren te beënten door de i. CIST. de route (Zie onderafdeling 1,2).
  2. Voer anesthesie van dieren op vastgestelde infectie tijd zoals vermeld in stap 2.
  3. Voer euthanasie van dieren door cervicale dislocatie.
  4. Reinig het chirurgische gebied met 70% ethanol.
  5. Knip het hoofd van de muis af met een grote schaar.
  6. Resect de vacht en de huid met behulp van kleine chirurgische schaar en een fijn getipt stalen Tang, verder naar de top van de schedel om duidelijk de hechtingen te kunnen zien en om de opening van de cranium te begeleiden.
  7. Steek de punt van een kleine schaar door het foramen magnum om de schedel te openen.
  8. Snijd naar het midden van de cranium en over de middellijn van het pariëtale bot naar de andere kant van de schedel. Snijd zachtjes langs de laterale rand van de lambdoïde hecht.
  9. Til de schedel vanaf de achterste pariëtale hoek en trek deze diagonaal omhoog om de hersenen te ontdekken, met behulp van fijne getipt Tang.
  10. Zorg ervoor dat het hersenweefsel niet is bevestigd aan een bot van het hoofd, wanneer de schedel wordt opgeheven.
  11. Gebruik de wegwerp tang om het bindweefsel tussen de schedel en de hersenen te verwijderen, om ervoor te zorgen dat het hersenweefsel samen met de schedel wordt verwijderd.
  12. Laat het hersenweefsel niet te veel drogen. Plaats de hersenen met behulp van wegwerp Tang, in een Petri schaaltje met 1 mL GC Bouillon aangevuld met 10% (vol/vol) glycerol.
  13. Homogeniseer de hersenen mechanisch met de zuiger van een 5 mL spuit (zie stap 2.2.9). Breng de monsters over in een steriele buis van 2 mL en bewaar-80 °C voor de latere evaluatie van de levensvatbare bacteriecellen, zoals besproken in stap 2,2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Overleving van muizen geïnfecteerd met N. meningitidis wild type en isogene Mutant stammen.
De stammen van de Neisseria meningitidis die in deze representatieve resultaten worden gebruikt, zijn de serogroep C-referentiestam 93/4286 (ET-37) en de isogene Mutant 93/4286Ωcssa verkregen door inactivatie van het cssa -gen, coderen voor de UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase, die kaarten in capsule synthese Locus25. Om de virulentie graad van de

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie beschrijven we een experimenteel protocol voor het opwekken van meningokokken meningitis bij volwassen muizen door i. CIST. inoculatie van meningokokken bacteriën. Voor onze kennis is er geen ander model van meningokokken meningitis ontwikkeld in laboratorium muizen geïnfecteerd door i. CIST. route in het verleden is deze manier onderzocht om modellen van meningokokken meningitis te leveren in zowel rat31 als konijn32. Het is bekend dat de hoogste graad van M...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De studies werden deels ondersteund door PRIN 2012 [subsidie nummer 2012WJSX8K]: "host-microbe interaction modellen in mucosale infecties: ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën" en door PRIN 2017 [2017SFBFER]: "een geïntegreerde aanpak om de wisselwerking tussen aanpassing, stressvolle omstandigheden en antimicrobiële resistentie van uitdagende pathogenen ".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,8 Skirted Cryovial With external threadStarlabE3090-6222
50 mL Polypropylene Conical TubeFalcon35207030 mm x 115 mm
Adson ForcepsF.S.T.11006-12Roestvrij staal
Alarm-ThermometerTESTO9000530
BactoTM Proteose PeptoneBD211693
BD Micro Fine syringeBD320837U-100 Insulin
BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inchBD30001405 mm x 16 mm
BD Plastipak syringe 5 mLBD30806207 mm x 30 mm
BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINETBio Air s.c.r.l.Aura B3
BioPhotometerEppendorfModel #6131
Bottle DTecniplastDGraduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm
C150 CO2 IncubatorBinder9040-0078
Cage Body Eurostandard Type IITecniplast1264C267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2
Cell Culture Petri Dish With LidThermo Scientific150288Working Volume: 5 mL
CentrifugeEppendorfMicrocentrifuge 5415R
Cuvetta semi-micro L. FormKartell S.p.A.01938-00
di-Potassium hydrogen phosphate trihydrateCarlo erba471767
di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysisCarlo Erba480141g1000
Diete Standard CertificateMucedola s.r.l.4RF21Food pellet for animal
Dumont Hp Tweezers 5 Stainless SteelF.S.T. by DUMONTAGT50340.10 x 0.06 mm2 tip
Electronic BalanceGibertiniEU-C1200Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g
Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lockEppendorfT3545-1000EA
ErythromycinSigma-AldrichE-637625 g
Extra Fine Bonn ScissorsF.S.T.14084-08Roestvrij staal
Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clampsTecniplast1264C400SUC
GC agar baseOXOIDCM0367
Gillies Forceps 1 x2 teethF.S.T.11028-15Roestvrij staal
Glicerin RPECarlo Erba4537521 L
Graefe ForcepsF.S.T.11052-10Serrated Tip Width: 0.8 mm
Inner lidTecniplast1264C116
Iron dextran solutionSigma-AldrichD8517-25ML
KetamineIntervet
Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class IIFasterBH-EN 2004
Microcentrifuge tubes 1.5 mL BRANDPP780751screw cap PP, grad
Mouse Handling ForcepsF.S.T.11035-20Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm
Mucotit-F2000MERZ618462000 mL
Natural Latex GlovesMedicaM101
New Brunswick Classic C24 Incubator ShakerPBI internationalC-24 Classic Benchtop Incubator Shaker
Petri PS DishesVWR391-045390 x 14.2 mm2
Pipetman Classic P20GilsonF1236002-20 μL
Pipetman Classic P200GilsonF12360120-200 μLL
Pipetman Classim P1000GilsonF123602200-1,000 μL
PolyvitoxOXOIDSR0090A
Potassium ChlorideJ.T. Baker Chemicals B.V.0208250 g
Potassium Dihydrogen PhosphateJ.T. Baker Chemicals B.V.02401 kg
PS Disposible forcepsVWR232-0191
Removable DividerTecniplast1264C812
Round-Bottom Polypropylene TubesFalcon3520635 mL
Sodium ChlorideMOLEKULA41272436
SS retainer and Polyester FilterSheetTecniplast1264C
Standard Pattern ForcepsF.S.T.11000-12Stainless
Stevens Tenotomy ScissorsF.S.T.14066-11Roestvrij staal
Surgical Scissor - ToughCutF.S.T.14130-17Stainless
Touch N Tuff disposible nitrile glovesAnsell92-500
Ultra Low Temperature (ULT) FreezerHaierDW-86L288Volume = 288 L
Wagner ScissorsF.S.T.14070-12Roestvrij staal
XylazineIntervet

Referenties

  1. van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
  2. Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
  3. Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
  4. Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
  5. Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
  6. Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
  7. Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
  8. de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
  9. Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
  10. Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
  11. Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
  12. Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
  13. Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
  14. Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
  15. Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
  16. Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
  17. Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
  18. Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
  19. Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
  20. Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
  21. Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
  22. Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
  23. Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139(2013).
  24. Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
  25. Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
  26. Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).
  27. Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
  28. Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
  29. Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
  30. Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750(2016).
  31. Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116(2007).
  32. Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
  33. Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
  34. Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
  35. World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
  36. Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36(2004).
  37. Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137(2018).
  38. Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653(2012).
  39. Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
  40. Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
  41. Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Muismodelintracisternale inoculatieNeisseria meningitidisbacteriële meningitiscisterna magnagastheer-pathogeeninteractieinfectie van hersenweefseloverlevingsanalysehistologisch onderzoek
Inducerende meningokokken meningitis serogroep C in muizen via Intracisternal Delivery
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.