Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Kristi  J. Warren; Todd  A. Wyatt

doi:10.3791/60060

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60060

⸱

20 september 2019

Kristi J. Warren¹^,³ , Todd A. Wyatt²^,³^,⁴

¹Department of Internal Medicine, University of Utah, ²Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, ³Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, ⁴Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Samenvatting

Hierin presenteren we een efficiënte methode die kan worden uitgevoerd met elementaire laboratorium vaardigheden en-materialen om de chemokinetische beweging van lymfocyten in een ex vivo-transmigratie systeem te beoordelen. Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) en CD4⁺ T helper cellen werden geïsoleerd uit milt en longen van kip ei ovalbumine (OVA)-uitgedaagd Balb/c muizen. We bevestigden de uitdrukking van CCR4 op zowel CD4⁺ T-cellen als ILC2, relatief. CCL17 en CCL22 zijn de bekende liganden voor CCR4; Daarom onderzochten we met deze ex vivo-transmigratie methode CCL17^- en CCL22-geïnduceerde beweging van CCR4⁺ lymfocyten. Om Chemokine gradiënten vast te stellen, werden CCL17 en CCL22 in de onderste kamer van het transmigratiesysteem geplaatst. Geïsoleerde lymfocyten werden vervolgens toegevoegd aan topkamers en over een periode van 48 uur werden de lymfocyten actief gemigreerd via 3 μm poriën naar de Chemokine in de onderste kamer. Dit is een effectief systeem voor het bepalen van de chemokinetica van lymfocyten, maar, begrijpelijkerwijs, niet nabootsen van de complexiteiten gevonden in de in vivo Organ micro-omgevingen. Dit is een beperking van de methode die kan worden overwonnen door de toevoeging van in situ beeldvorming van het orgel en lymfocyten onder studie. Het voordeel van deze methode is daarentegen dat deze kan worden uitgevoerd door een technicus op instapniveau die een veel kosteneffectiever tarief heeft dan live Imaging. Aangezien therapeutische verbindingen beschikbaar komen om de migratie te verbeteren, zoals in het geval van tumor infiltrerende cytotoxische immuuncellen, of om migratie te remmen, misschien in het geval van auto-immuunziekten waar Immunopathologie van belang is, kan deze methode worden gebruikt als een screening tool. In het algemeen is de methode effectief als de Chemokine van belang consequent chemokinetica genereert op een statistisch hoger niveau dan de media controle. In dergelijke gevallen kan de mate van remming/verbetering door een bepaalde verbinding ook worden bepaald.

Inleiding

Deze oorspronkelijke transmigratie methode werd gepresenteerd door Stephen Boyden in 1962 in het tijdschrift van experimentele geneeskunde¹. Veel van wat we weten over chemotaxis en chemokinetica zou niet mogelijk zijn zonder de ontwikkeling van de Boyden kamer. Voorafgaand aan de ontdekking van de eerste Chemokine in 1977, werden ex vivo-transmigratie systemen gebruikt om te leren over serum factoren die de cellulaire beweging in macrofagen konden arresteren terwijl de cellulaire beweeglijkheid in neutrofielen^1,2werd verg^root. Een enorme rijkdom aan kennis is ontwikkeld met be....