Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60060

⸱

20 september 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Samenvatting

Hierin presenteren we een efficiënte methode die kan worden uitgevoerd met elementaire laboratorium vaardigheden en-materialen om de chemokinetische beweging van lymfocyten in een ex vivo-transmigratie systeem te beoordelen. Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) en CD4+ T helper cellen werden geïsoleerd uit milt en longen van kip ei ovalbumine (OVA)-uitgedaagd Balb/c muizen. We bevestigden de uitdrukking van CCR4 op zowel CD4+ T-cellen als ILC2, relatief. CCL17 en CCL22 zijn de bekende liganden voor CCR4; Daarom onderzochten we met deze ex vivo-transmigratie methode CCL17- en CCL22-geïnduceerde beweging van CCR4+ lymfocyten. Om Chemokine gradiënten vast te stellen, werden CCL17 en CCL22 in de onderste kamer van het transmigratiesysteem geplaatst. Geïsoleerde lymfocyten werden vervolgens toegevoegd aan topkamers en over een periode van 48 uur werden de lymfocyten actief gemigreerd via 3 μm poriën naar de Chemokine in de onderste kamer. Dit is een effectief systeem voor het bepalen van de chemokinetica van lymfocyten, maar, begrijpelijkerwijs, niet nabootsen van de complexiteiten gevonden in de in vivo Organ micro-omgevingen. Dit is een beperking van de methode die kan worden overwonnen door de toevoeging van in situ beeldvorming van het orgel en lymfocyten onder studie. Het voordeel van deze methode is daarentegen dat deze kan worden uitgevoerd door een technicus op instapniveau die een veel kosteneffectiever tarief heeft dan live Imaging. Aangezien therapeutische verbindingen beschikbaar komen om de migratie te verbeteren, zoals in het geval van tumor infiltrerende cytotoxische immuuncellen, of om migratie te remmen, misschien in het geval van auto-immuunziekten waar Immunopathologie van belang is, kan deze methode worden gebruikt als een screening tool. In het algemeen is de methode effectief als de Chemokine van belang consequent chemokinetica genereert op een statistisch hoger niveau dan de media controle. In dergelijke gevallen kan de mate van remming/verbetering door een bepaalde verbinding ook worden bepaald.

Inleiding

Deze oorspronkelijke transmigratie methode werd gepresenteerd door Stephen Boyden in 1962 in het tijdschrift van experimentele geneeskunde1. Veel van wat we weten over chemotaxis en chemokinetica zou niet mogelijk zijn zonder de ontwikkeling van de Boyden kamer. Voorafgaand aan de ontdekking van de eerste Chemokine in 1977, werden ex vivo-transmigratie systemen gebruikt om te leren over serum factoren die de cellulaire beweging in macrofagen konden arresteren terwijl de cellulaire beweeglijkheid in neutrofielen1,2werd vergroot. Een enorme rijkdom aan kennis is ontwikkeld met betrekking tot de immuuncelmigratie, en tot op heden, 47 chemokines zijn nu ontdekt met 19 overeenkomstige receptoren3,4. Bovendien, menigten van remmers/versterkers van deze Chemokine trajecten hebben ondergaan ontwikkeling voor therapeutische doeleinden5,6,7,8. Veel van deze verbindingen zijn getest in soortgelijke transmigratie kamers om te begrijpen van directe interacties tussen de verbindingen en immuuncellen responsiviteit op een bepaalde Chemokine9.

Transmigratie, of diapedesis, in ontstoken weefsel is een essentieel proces voor een gezonde ontstekingsreactie op heldere infectie10,11. Een Boyden kamer, transmigratiesysteem of trans Well-apparaat bestaan over het algemeen uit twee kamers, gescheiden door een poreus membraan van1,12. De onderste kamer bevat meestal media met de Chemokine van belang, terwijl leukocyten in de bovenste kamer worden geplaatst. De grootte van de porie in het membraan kan worden geselecteerd op basis van de grootte van de cel van belang. Voor dit project selecteerden we een 3 μm poreus membraan, omdat lymfoïde cellen 7-20 μm groot zijn, afhankelijk van het stadium van cellulaire ontwikkeling. Deze poriegrootte zorgt ervoor dat deze cellen niet passief door de poriën vallen, maar dat ze actief migreren naar aanleiding van de Chemokine gradiënt.

Het grote voordeel van dit protocol is de kosteneffectiviteit. In vivo is transmigratie moeilijk omdat het uitgebreide training vereist in dier hantering en chirurgie, en vaak gaat het om krachtige microscopie die niet altijd beschikbaar is voor een onderzoeker. Kostenefficiënte screening van verbindingen die bedoeld zijn om de transmigratie te verbeteren of te remmen, kan worden uitgevoerd voordat in vivo beeldvorming mogelijk is. Omdat het transmigratiesysteem strak wordt gecontroleerd, kunnen cellen aanvankelijk worden behandeld en vervolgens aan de trans well-apparatuur worden toegevoegd, of omgekeerd kan de Chemokine eerst met een Chemokine remmer worden behandeld, waarna cellen worden toegevoegd aan de trans well-apparatuur. Tot slot kunnen endotheelcellen en/of basaalmembraan proteïnen worden toegevoegd aan de onderzijde van de transwell insert 1-2 dagen voorafgaand aan het transmigratieexperiment om de betrokkenheid van deze barrière cellen in de chemokinetica te begrijpen. Nogmaals, deze manipulaties van het systeem bieden een krachtig middel om belangrijke informatie over de effectiviteit van een bepaalde compound te bepalen voor de ingewikkeldere in vivo studies.

Het gebruik van een systeem voor de transmigratie kamer is een effectieve manier om de lymfocyten mobiliteit te beoordelen onder verschillende in vivo en in vitro omstandigheden12,13,14. Hierin beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor het beoordelen van de responsiviteit van ex vivo lymfocyten op chemokinen in een transmigratiekamer. In dit voorbeeld experiment werden CD4+ T-cellen en groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) geïsoleerd van mannelijke en vrouwelijke, Balb/c-muizen na blootstelling aan OVA-allergenen. Er werd een hypothese gegenereerd dat CCR4+ CD45+ Lineage-(Lin-) ILC2 van met allergenen betwiste muizen efficiënter zou migreren naar CCL17 en CCL22 dan CCR4+ CD4+ T-helpercellen. CCL17 en CCL22 zijn chemokines die gewoonlijk worden geproduceerd door dendritische cellen en macrofagen van het m2 (allergische) fenotype, onder andere cellen, bij allergie15,16. CCL17 en CCL22 kunnen worden gezien als biomarkers van allergische ontsteking, omdat ze gemakkelijk in de longen worden gedetecteerd tijdens luchtweg exacerbaties16,17,18. Belangrijk is dat CCR4 expressie wordt verhoogd in vergelijking met onbehandelde controles, zoals blijkt uit bioinformatische gegevens die zijn gegenereerd uit ILC2 geïsoleerd van huisstofmijt behandelde dieren, en op dezelfde manier ILC2 van naïeve dieren behandeld ex vivo met IL-33 ( allergenen-bevorderend aangeboren cytokine) upregulates CCR419,20. Bovendien, volgens gegevens voor ILC2 in de database van het immunologische genoom project (www.immgen.org), CCR4 mRNA wordt sterk uitgedrukt in deze aangeboren immuuncellen. Tot op heden is er weinig bekend over de handel in ILC2 in weefsels, maar het is waarschijnlijk dat de ILC2 en CD4+ T-cellen soortgelijke chemokines en receptoren voor chemotaxis en chemokinetica gebruiken, omdat ze vergelijkbare transcriptiefactoren en receptoren uitdrukken. Zo vergeleken we CCL17 versus CCL22 responsiviteit, van ILC2 en CD4+ T-lymfocyten, van zowel mannelijke als vrouwelijke, met eicellen betwiste dieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg-en gebruiks comités van de Universiteit van Nebraska Medical Center (UNMC) en de Universiteit van Utah.

1. installatie en bereiding van reagentia

  1. Maak een complete RPMI (Roswell Park Memorial Institute) media.
    1. Voeg 10 mL warmtegeïnactiveerd foetaal serum (FBS) toe aan 90 mL RPMI.
    2. Voeg 1 mL 100x Penicillaire-streptomycine-glutamine toe aan 100 mL 10% FBS RPMI.
  2. Bereid ILC2 Expansion media voor.
    1. Voeg IL-2 en IL-33 (20 ng/mL elke cytokine) toe aan 10 mL volledige RPMI.
    2. Als voorraad cytokinen 10 μg/mL zijn, Pipetteer 20 μL IL-2 en IL-33 in een buis van 15 mL die 10 mL volledige RPMI-media bevat.
  3. Bereid Long dissociatie medium.
    1. Voeg 50 mg type 1 Collagenase toe aan 250 mL niet-aangevuld RPMI.
    2. Voeg in stap 1.3.1 2,5 mL 100x penicillaire-streptomycine-glutamine toe aan de 250 mL media.
    3. Meng de media voorzichtig om ervoor te zorgen dat het type 1 Collagenase vóór gebruik volledig is opgelost.
  4. Serum vrije RPMI voorbereiden.
    1. Verdun 1 g gelyofiliseerd boviene serumalbumine (BSA) in 200 mL RPMI.
    2. Voeg 2 mL 100x penicillaire-streptomycine-glutamine toe.
    3. Meng de media voorzichtig om ervoor te zorgen dat de BSA volledig is opgelost in de media voor gebruik.
  5. Migratie medium voorbereiden met CCL17.
    1. Verkrijg 10 mL serum vrije RPMI en voeg CCL17 [50 ng/mL] toe.
      1. Als voorraad CCL17 10 μg/mL is, voeg dan 50 μL CCL17 kolf toe aan 10 mL serum vrije RPMI-media.
  6. Migratie medium voorbereiden met CCL22.
    1. Verkrijg 10 mL serum vrije RPMI en voeg CCL22 [50 ng/mL] toe.
    2. Als voorraad CCL22 10 μg/mL is, voeg dan 50 μL CCL22 kolf toe aan 10 mL serum vrije RPMI-media.
  7. Bereid CCR4 Antilichaamkleurings cocktail.
    1. Voeg gedurende 10 tests totaal 5 μL van elk van de volgende antilichamen toe aan een tube van 5 mL: anti-muis CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 en ICOS.
      Opmerking: Voorbeeld van het maken van een antilichaam cocktail voor 10 monsters: 0,5 μL van elk antilichaam x 10 monsters = 5 μL van elk van de in 1.7.1 vermelde antilichamen.
    2. Voeg gedurende 10 tests totaal 2,5 μL van de volgende antilichamen toe aan de cocktail van antilichamen uit stap 1.7.1: anti-muis CD3, CD11c en NK 1.1.
      Opmerking: Voorbeeld om de antilichaam cocktail voor 10 monsters te voltooien: 0,25 μL x 10 monsters = 2,5 μL van CD3, CD11c en NK 1.1 antilichamen.
    3. Bewaar de CCR4 Antilichaamkleurings cocktail bij 4 °C tot u klaar bent om de monsters toe te voegen. Gooi antilichaam cocktail na 1 week indien niet gebruikt.
  8. Bereid 1x stabiliserende Fixeermiddel.
    1. Voeg 10 mL gedeïoniseerd-gedestilleerd water toe aan 5 mL 3x stabiliserende fixatief concentraat

2. bereiding van voor de allergenen uitgedaagde BALB/c muizen

Opmerking: Mannelijke en vrouwelijke BALB/c muizen werden gekocht bij Charles River (UNMC) of Jackson Laboratories (Universiteit van Utah) op 6 tot 8 weken oud.

  1. Na acclimatie (1 week), sensibiliseren alle dieren aan eicellen.
    1. Combineer 100 μg/mL OVA geadsordeerd aan aluminiumhydroxide (20 mg/mL) in een 5 mL polystyreen buis.
    2. Meng de buis en trek onmiddellijk 500 μL van de OVA-Alum suspensie in een 1 mL, 28 G spuit (insulinespuit).
    3. Plaats een muis in een stolp met Isofluraan (1 – 2 ml onder een valse vloer, zodat het dier niet direct in Isofluraan staat). Laat de muis ongeveer 1 – 2 minuten onder anesthesie gaan, of totdat de ademhalingssnelheid daalt.
    4. Neem de muis snel op door de vacht op de rug en schouders en Injecteer 100 μL OVA-Alum intraperitoneaal per muis21,22.
    5. Plaats de muis terug in zijn kooi en kijk om te zorgen dat ze weer beweeglijkheid krijgen; Dit moet gebeuren binnen 2 – 5 min.
  2. Zeven dagen na sensibilisatie, alle dieren onderworpen aan intranasale (i.n.) 1,5% eicellen verdund in steriele zoutoplossing in een Vernevel kamer (Data Sciences International) gedurende 20 min.
    1. Verwijder muizen uit hun kooien en plaats ze in de dierlijke Vernevel kamer. Sluit de deksel van de kamer.
    2. Bevestig de vernevelaar aan de ingangs uitloop op de Vernevel kamer.
    3. Voeg 30 mL 1,5% OVA verdund in steriele zoutoplossing toe aan de vernevelaar op de vernevelaar.
    4. Schakel de vernevelaar in en laat de kamer 20 minuten met mist vullen.
    5. Schakel de vernevelaar uit en laat de nevel zich vestigen.
    6. Dieren terug te brengen naar hun kooien.
  3. Herhaal stap 2,2 voor een totaal van 5 keer, op 5 opeenvolgende dagen, om allergische ontsteking te induceren.

3. isolatie van CD4+ T-cellen uit milt en longen van met eicellen uitgedaagde muizen

  1. Alle met OVA behandelde mannelijke en vrouwelijke dieren op humane wijze euthanaseren door CO2 -asphyxiatie volgens goedgekeurde IACUC-protocollen, waarbij 2 tot 3 dieren per groep worden gebruikt, per experiment.
  2. Accijns longen en milt van dieren en plaats weefsels in afzonderlijke dissociatie buizen op basis van het weefseltype en het geslacht van het dier23.
  3. Dissociaat longweefsel in 500 μL Long dissociatie media (25 U/mL; Collagenase, type 1) in de geautomatiseerde weefsel dissociator met behulp van het Long-protocol.
    1. Herhaal 3,2 en 3,3 in totaal twee keer.
  4. Dissociaat milt weefsel in 500 μL van volledige rpmi-media met gebruikmaking van het ' milt '-protocol op de geautomatiseerde weefsel dissociator.
    Opmerking: De resterende stappen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met behulp van steriele techniek.
  5. Spoel de dissociatie buisjes met Long-en milt homogenaten met 5 mL extra Long dissociatie media of volledige RPMI, respectievelijk.
  6. Filter cel suspensies door een 40 μm celzeef en verzamel in 50 mL conische buizen.
  7. Incubate Long homogeneert gedurende 15 – 30 minuten in een incubator van 37 °C met 5% CO2 om het longweefsel verder te ontkoppelen.
  8. Voeg 5 mL complete RPMI toe aan de Long en de milt homogeneert en pellet de cellen aan de onderkant van de 50 mL buizen met behulp van centrifugeren; 378 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.
  9. Combineer splenocyten en longcellen in één conische buis van 50 mL en bepaal het totale aantal celtellingen met behulp van de geautomatiseerde celteller.
  10. Pas mannelijke en vrouwelijke celsuspensies aan 1 x 108 cellen/ml in scheidings buffer en voeg toe aan een 5 ml polystyreen buis.
    Opmerking: Het verrijkings protocol kan worden aangepast tot 14 mL polystyreen buizen wanneer meer cellen worden verkregen uit de milt en de longen. Dit protocol is ontworpen voor weefsels van 2 – 3 muizen per groep; Daarom moet een tube van 5 mL volstaan.
  11. Gebruik ongeveer tweederde van de totale cellen voor ILC2 isolatie volgens het ILC2 verrijkings protocol.
    1. Voeg een antilichaam cocktail (50 μL/mL) toe aan de celsuspensie en inincuberen gedurende 5 minuten bij RT.
    2. Vortex Rapid-bollen voor 30 sec. en voeg aan het monster toe met een snelheid van 75 μL/mL celsuspensie. Zachtjes mengen en inbroed gedurende 5 minuten bij RT.
    3. Boven de buis tot 3 mL totaal volume met scheidings buffer en plaats in de 8-kamer Easy separatie magneet. Incuberen gedurende 3 min bij RT.
    4. Tip de magneet naar voren (weg van de bol-antilichaam-cel complexen aan de achterkant van de buis) en Pipetteer de celsuspensie in een schone tube van 5 mL.
    5. Voeg 1,5 mL complete RPMI toe aan de buisjes en centrifugeer bij 378 x g gedurende 5 min bij RT.
    6. Giet de media uit de celpellet en rebreng de ILC2 op 1 x 107 cellen per ml.
    7. Plaats 100 uL mannelijk en vrouwelijk ILC2 per put in een U-Bottom, 96-well plate en voeg 100 μL ILC2 Expansion media toe aan elk goed.
    8. Incuberen de cellen voor 4 – 5 dagen om de ILC2 uit te vouwen.
    9. Verzamel de ILC2 in een tube van 5 mL en voeg tot 4,5 mL serum vrije RPMI toe. Centrifugeer de cellen op 378 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    10. Tel cellen met behulp van een hemacytometer en respenderen bij 1 x 107 ILC2 per ml in serum vrije rpmi.
  12. Gebruik de overgebleven cellen voor de CD4+ t cell isolation procedure, die wordt uitgevoerd volgens het CD4+ t cell isolation protocol met enkele modificaties.
    1. Voeg rat serum (50 μL/mL) toe aan de CD4 T Cell verrijkings suspensie.
    2. Voeg een isolatie cocktail (50 μL/mL) toe aan het monster en incuberen gedurende 10 minuten bij RT.
    3. Vortex snelle bollen voor 30 sec. en voeg toe aan het monster met een snelheid van 75 μL/mL.
    4. Meng de celsuspensie zachtjes en inincuberen voor 2,5 min en RT
    5. Boven de monsters tot 3 mL en plaats de 5 mL buisjes in de 8-kamer Easy separatie magneet en inincuberen gedurende 5 min bij RT.
    6. Tip de magneet naar voren en Pipetteer de celsuspensie in een schone tube van 5 mL.
    7. Voeg aan de buizen 1,5 mL serum vrije RPMI toe en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT bij 378 x g .
    8. Giet de media van de celpellet af en breng de CD4+ T-cellen met 1 x 107 cellen per ml in serum vrije rpmi uit.

4. Bepaal CCR4 expressie op CD4+ T-cellen en groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) van OVA-betwiste dieren door Flowcytometrie

Opmerking: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd op een open Bench top omdat ze niet-steriele technieken.

  1. Verkrijg ongeveer 1 – 2,5 x 105 ILC2 cellen uit stap 3.11.10 en 1 – 2,5 x 106 CD4+ T-cellen uit stap 3.12.8 in afzonderlijke buisjes van 5 ml.
    1. Houd een extra buis van ten minste 5,0 x 104 CD4 + T-cellen als een onbevlekte controle.
  2. Onderbreek de cellen in 100 – 200 μL van de FACS buffer en voeg 1 μL FC block toe aan elke buis, vervolgens inincuberen op ijs (of in een koelkast van 4 °C) gedurende 10 minuten.
  3. Voeg 1 – 2 mL FACS buffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 378 x g gedurende 5 min bij RT.
  4. Giet het supernatant af en breng de cellen in 100 – 200 μL FACS buffer uit.
  5. Voeg 37,5 μL CCR4-Antilichaamkleurencocktail toe aan de celsuspensie in elke buis, behalve de buis met de ' ongekleurde ' cellen.
  6. Inbroed de buisjes op ijs, of in een koelkast van 4 °C, gedurende 20 – 30 minuten.
  7. Voeg 1 – 2 mL FACS buffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 378 x g gedurende 5 min bij RT.
  8. Giet het supernatant af.
  9. Herhaal de stappen 4,7 en 4,8.
  10. Voeg 250 – 300 μL 1x stabiliserende fixeermiddelen (Zie tabel van de materialen) toe aan elke buis.
  11. Maak één kleurige kraal bediening voor elk antilichaam in de cocktail van het CCR4-antilichaam volgens het protocol dat is meegeleverd met de compensatie kralen.
    1. Vortex de compensatie kralen.
    2. Voeg één druppel kralen toe aan elke enkele gekleurde controle buis.
    3. Voeg 1 μL van elk antilichaam in de cocktail van het CCR4 antilichaam toe aan zijn eigen gelabelde buis.
    4. Meng en inbroed 10 min. in een koelkast van 4 °C of op ijs.
    5. Voeg 1 – 2 mL FACS buffer toe aan alle buisjes en centrifugeer bij 378 x g gedurende 5 min bij RT.
    6. Giet het supernatant af en breng de parels in 200 μL FACS buffer uit.
    7. Koel de enkelvoudig gekleurde bedieningselementen totdat alle monsters zijn gekleurd en klaar om te worden geanalyseerd op de flow-cytometer.
  12. Analyseer de Onbevlekte cellen, éénkleurige bedieningselementen en de experimentele samples op de flow-cytometer binnen 24 uur fixatie.

5. ex-vivo-transmigratie procedure

Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast, omdat ze een steriele techniek vereisen.

  1. Verkrijg de ILC2 uit stap 3.11.10 en CD4 T-cellen uit stap 3.12.8 en bepaal het aantal trans well-inserts dat nodig is voor het experiment.
    Opmerking: Voorbeeld: voor 1,2 mL verrijkte CD4 T-cellen uit stap 3.12.8 vermenigvuldigt u 1,2 x 1.000 μL = 1.200 μL; Verdeel vervolgens 1.200 uL met 100 μL = 12, het aantal wisselplaten dat nodig is voor CD4 T-transmigratie.
  2. Beweeg de 3 μm trans well inserts voorzichtig van de middelste rijen van een 24-Well plaat.
  3. Voeg 500 μL migratie media met CCL17 toe aan ongeveer een derde van de putjes.
  4. Voeg 500 μL migratie media met CCL22 toe aan een ander eenderde van de putjes.
  5. Voeg aan de laatste eenderde van de putjes 500 μL serum vrije RPMI met geen Chemokine toe.
  6. Label het deksel op de plaat duidelijk met de juiste transmigratie media geplaatst in de bodem putjes.
  7. Plaats de trans well inserts terug in de putten die de verschillende behandelingen bevatten.
  8. Voeg voorzichtig 100 μL CD4 T-cellen of ILC2 toe aan de bovenste put van elke wisselplaat. Meng of Pipetteer de celsuspensie niet op en neer in de trans putten, omdat dit de resultaten van het experiment kan verduren.
  9. Label de deksel van de plaat duidelijk met het celtype dat in elk goed is geplaatst en noteer de datum en tijd van de dag waarop de cellen zijn toegevoegd.
  10. Herhaal de stappen 5,2 tot 5,9 totdat alle cellen in trans well inserts met media zijn geplaatst.
  11. Plaats de plaat voorzichtig in een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor 48 h. Minimaliseer het contact met de plaat gedurende de incubatieperiode.

6. kwantificering van de ex vivo-transmigratie

  1. Verwijder voorzichtig de plaat uit de incubator en verwijder alle trans well inserts van de middelste rijen in de lege putten net boven of onder.
  2. Verzamel de cellen van de bodem en de bovenste putjes van de trans well-inserts in buizen met het label boven of onder, met CCL17, CCL22 of media, met het celtype en met het replicatienummer (ten minste 3 replicaties per experiment).
  3. Spoel de onderste putjes af met 500 μL 1x PBS en vang deze spoeling op in de bijbehorende buis.
  4. Spoel de bovenste putjes af met 250 μL 1x PBS en vang deze spoeling op in de bijbehorende buis.
  5. Pellet de cellen door centrifugeren bij 378 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  6. Pipetteer voorzichtig alle supernatant van de celpellet.
  7. Respendeer T-cellen en ILC2 in 50 μL 1x PBS.
  8. Neem 10 μL celsuspensies en voeg toe aan 90 μL 0,4% trypeen blauw.
  9. Tel de cellen op de teller van de geautomatiseerde cel.
    1. % Levensvatbaarheid vastleggen.
    2. Noteer het aantal cellen per mL voor elk voorbeeld.
    3. Bepaal het totale aantal cellen per behandeling in de bovenste en onderste kamer; Noteer het aantal cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

CCR4 expressie op CD4 + T-cellen en ILC2.

Voor het succes van het ex vivo transmigratie-experiment is het noodzakelijk om te bepalen of de lymfocyten reageren op CCL17 en CCL22 door middel van CCR4; Daarom bepaalden we CCR4 expressie op zowel CD4+ T-cellen als ILC2 door Flowcytometrie. Hoewel het bekend is dat OVA-specifieke CD4+ helper T cellen Express CCR4, minder is bekend van de uitdrukking van CCR4 op ILC2. Figuur 1 toon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hierin presenteren we een vaste methode voor de beoordeling van Chemokine-geïnduceerde migratie van lymfocyten in een ex vivo-transmigratiesysteem. Er zijn verschillende kritische stappen in het Protocol, waarvan de eerste de uitdrukking van de juiste Chemokine receptor op de immuuncellen in het experiment verifieert. In onze handen kozen we CCR4 vanwege het lichaam van de literatuur die het belang van CCR4 op Th2 helper T cellen in allergische ontsteking benadrukt. Ovalbumine-geïnduceerde ontsteking werd eerder aangetoo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financiële openbaarmakingen of belangenconflicten om te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de American Lung Association (K.J.W.), het Memorial Eugene Kenney Fund toegekend aan T.A.W. en K.J.W., royale start-up ondersteuning van de Universiteit van Utah voor K.J.W., en een afdeling van Veterans Affairs Award to T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. is de ontvanger van een Research Career Scientist Award (IK6 BX003781) van het departement Veterans Affairs. De auteurs willen de redactionele assistentie van mevrouw Lisa Chudomelka erkennen. De auteurs danken de unmc flow flowcytometrieonderzoeken core voor hun ondersteuning bij het verzamelen van de flow cytometrie-gegevens die voor dit manuscript zijn gegenereerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.4% Trypan BlueSigma-Aldrich15250061
1 mL-seringBD Bioscience329424U-100 Spuit Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-GlutamineGibco10378-016Verdunn tot 1x in RPMI media
15 mL conische buizenOlympus Plastics28-101polypropyleenbuizen
3 μm transwell inzetstukkenGenesee Scientific25-28824-well plate met 12 transwell inzetstukken
3x stabiliserende fixeervloeistofBD Pharmigen338036Bereid 1x oplossing volgens het protocol van de fabrikant
5 mL polystyreenbuizenSTEM Cell Technologies38007
50 mL conische buizenOlympus Plastics28-106polypropyleenbuizen
8-kamer gemakkelijk separatief magneetSTEM Cell Technologies18103
ACK Lysing BufferLife Technologies CorporationA1049201
Advanced cell strainer, 40 μmGenesee Scientific25-375nylon gaas, 40 μm strainers
Aluminium Hydroxide, Reagent GradeSigma-Aldrich239186-25G20 mg/mL
anti-muis CCR4; APC-geconjugeerdBiolegend1312110.5 μg/test
anti-muis CD11bBD Pharmigen5573960.5 μg/test
anti-muis CD11c; PE eFluor 610Thermo-Fischer Scientific61-0114-820.25 μg/test
anti-muis CD16/32, Fc blokBD Pharmigen5531410.5 μg/test
anti-muis CD19; APC-eFluor 780 geconjugeerdThermo-Fischer Scientific47-0193-820.5 μg/test
anti-muis CD3; PE Cy 7-geconjugeerdBD Pharmigen5527740.25 μg/test
anti-muis CD45; PE geconjugeerdBD Pharmigen560870.5 μg/test
anti-muis ICOS (CD278)BD Pharmigen5640700.5 μg/test
anti-muis NK1.1 (CD161); FITC-geconjugeerdBD Pharmigen5531640.25 μg/test
anti-muis ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 geconjugeerdBiolegend1453110.5 μg/test
Automatische CeltellerBIORAD1450102
Automatische DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-093-235
Bovien Serum Albumine, Gelyofiliseerd PoederSigma-AldrichA2153-10G0.5% in serum-vrij RPMI
Celteller ClidesBIORAD1450015
Kippenei Albumine, Grade VSigma-AldrichA5503-10G500 μg/mL
Collagenase, Type 1, GefilterdWorthington Biochemical CorporationCLSS-1, koop als 5 X 50 mg vials (LS004216)25 U/mL in RPMI
Compensatie kralenAffymetrix01-1111-411 druppel per controlebuis
DissociatiebuizenMACS Miltenyi Biotec130-096-335
FACS BufferBD Pharmigen5546571x PBS + 2% FBS, met natriumazid; bewaard bij 4 °C
Heat Inactivated-FBSGenesee Scientific25-525H10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Muis CCL17GenScriptZ02954-2050 ng/mL
Muis CCL22GenScriptZ02856-2050 ng/mL
Muis CD4+ T cel verrijkingskitSTEM Cell Technologies19852
Muis IL-2GenScriptZ02764-2020 ng/mL
Muis ILC2 verrijkingskitSTEM Cell Technologies19842
Muis recombinant IL-33STEM Cell Technologies7804420 ng/mL
RPMILife Technologies Corporation22400071
SeparatievloeistofSTEM Cell Technologies201441x PBS + 2% FBS; bewaard bij 4 °C
Kleine dier nevelizer en kamerData Sciences International
Steriele zoutoplossingBaxter2F7124; NDC 0338-0048-040.9% Natriumchloride

Referenties

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548(2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477(2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508(2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038(2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684(2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51(2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

ChemokinegradiëntCCR4-expressieILC2-isolatieCD4-T-celTranswell-assayflowcytometriecelviabiliteitchemokine-screening
Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.