Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie

5.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60065

⸱

29 september 2019

 ,  , 
1Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een zuiveringsmethode voor recombinant tag-vrij calcium bindend proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor humane monocyt stimulatie testen.

Samenvatting

In dit protocol beschrijven we een methode om humaan calcium bindende proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren te zuiveren van de Escherichia coli -cultuur voor immuuncelstimulaties. Dit protocol is gebaseerd op een tweestapschromatografie strategie, die bestaat uit eiwit voorzuivering op een anion-uitwisselings chromatografie kolom en een daaropvolgende polijst stap op een hydrofobe-interactie kolom. Deze strategie produceert S100A12 eiwit van hoge zuiverheid en rendement tegen beheersbare kosten. Voor functionele assays op immuuncellen vereist uiteindelijke restant endotoxine besmetting zorgvuldige controle en verdere reinigingsstappen om endotoxine vrij eiwit te verkrijgen. De meerderheid van de endotoxine verontreinigingen kan worden uitgesloten door een anion-uitwisselings chromatografie. Om rest verontreinigingen uit te putten, beschrijft dit protocol een verwijderings stap met centrifugale filters. Afhankelijk van de beschikbare Ion-sterkte S100A12 kan regelen in verschillende homomultimers. Om de relatie tussen structuur en functie te onderzoeken, wordt dit Protocol verder beschreven Ion-behandeling van S100A12 eiwit, gevolgd door chemische crosslinking te stabiliseren S100A12 oligomeren en hun daaropvolgende scheiding door grootte-uitsluiting Chromatografie. Ten slotte beschrijven we een cel-gebaseerde assay die de biologische activiteit van het gezuiverde eiwit bevestigt en LPS-vrije voorbereiding bevestigt.

Inleiding

S100A12 is een calcium bindend eiwit dat voornamelijk wordt geproduceerd door menselijke granulocyten. Het eiwit wordt overgedruct tijdens (systemische) ontsteking en de serumspiegels, met name bij (auto) ontstekingsziekten zoals systemische juveniele idiopathische artritis (sJIA), familiaire mediterrane koorts (FMF) of ziekte van Kawasaki (KD) kan informeren over ziekteactiviteit en respons op de therapie. Afhankelijk van patroonherkenning receptoren (PRRs) zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), het aangeboren immuunsysteem kan worden geactiveerd door pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) zoals lipopolysacchariden (LPS) of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs; ook wel ' alarmin ' genoemd). DAMPs zijn endogene moleculen zoals cellulaire eiwitten, lipiden of nucleïnezuren1. Vocht-functies zijn goed beschreven voor de leden van de calgranulin proteïne familie, S100A8/A9 en S100A122, die ook worden gerapporteerd om te werken als divalente metalen Ion-chelerende antimicrobiële peptiden3,4, 5,6. Afhankelijk van de beschikbare ionensterkte kan S100A12, net als andere leden van de S100-familie, verschillende homomultimers regelen en tot voor kort was de impact van S100A12-oligomerisatie op PRR-interactie, in het bijzonder TLR4, onbekend.

Het eiwit monomere vorm (92 aminozuren, 10,2 kDa) bestaat uit twee EF-hand Helix-lus-Helix structuren verbonden door een flexibele linker. De C-Terminal EF-hand bevat het klassieke CA2 +-bindende motief, terwijl de N-terminale EF-hand een S100 eiwit-specifieke verlengde LUSSTRUCTUUR (' pseudo-EF-hand ') vertoont en een gereduceerde CA2 +-affiniteit onthult. CA2 +-binding door S100A12 kan leiden tot een belangrijke conformationele verandering in het C-terminus van de eiwitten, wat resulteert in blootstelling van een hydrofobe pleister op elk monomeer en vormt de door dimerisatie-interface. Zo is de kleinste Kwartaire structuur, gevormd door S100A12, onder fysiologische omstandigheden, een niet-covalente dimeer (ongeveer 21 kDa) waarin individuele monomeren in anti parallelle oriëntatie zijn. Wanneer gerangschikt als dimer, wordt S100A12 gerapporteerd aan onttrokken Zn2 + en andere divalente metaalionen, bijvoorbeeld Cu2 + met hoge affiniteit7. Deze ionen worden gecoördineerd op de S100A12 dimeer-interface door aminozuren H15 en D25 van een subeenheid en H85, evenals H89 van de anti-paralleling andere subeenheid8,9,10. Terwijl eerdere studies voorstellen datZn 2 +-loaded S100A12 de eiwit organisatie kan induceren in homo-tetramers (44 kDa) en resulteert in een verhoogdeca 2 +-affiniteit11,12, recente metaal titratie studies6 suggereren CA2 +-binding door S100A12 om de eiwit affiniteit te verhogen tot Zn2 +. Zodra de S100A12 EF-handen volledig bezet zijn door CA2 +, wordt extra CA2 + verondersteld te binden tussen dimers, triggering hexamer vorming (ongeveer 63 kDa). De architectuur van de hexamerische Kwartaire structuur verschilt duidelijk van die van de Tetramer. Er wordt voorgesteld dat de tetrameer-interface wordt verstoord om nieuwe dimer-dimer-interfaces te geven die de voordelen van hexamer-formatie10hebben. S100A12 wordt bijna uitsluitend uitgedrukt door menselijke Granulocyten, waar het ongeveer 5% van alle cytosolische eiwitten13vormt. In zijn VOCHTIGE functie werd S100A12 historisch beschreven als agonist van de multi-ligand receptor voor geavanceerde glycation end-producten (RAGE), dan genoemd extracellulaire nieuw geïdentificeerde RAGE-bindende proteïne (EN-RAGE)14. Hoewel we eerder meldden biochemische S100A12-binding aan zowel woede en TLR415, we onlangs aangetoond menselijke monocyten om te reageren op S100A12 stimulatie op een TLR4-afhankelijke manier16. Dit vereist arrangement van S100A12 in zijn CA2 +/Zn2 +-geïnduceerde hexameer Kwartaire structuur16.

Hier beschrijven we een zuiverings procedure voor recombinant humaan S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulaties16,17. Dit is gebaseerd op een tweestapschromatografie strategie, die in eerste instantie een anion-uitwisselings kolom bevat om het eiwit te isoleren en te concentreren en bulk verontreinigingen te verwijderen (bijv. endotoxinen/lipopolysacchariden)18. Ionenwisselingschromatografie harsen scheiden eiwitten op basis van verschillende netto oppervlakte heffingen. Voor zure eiwitten zoals S100A12 (isoelektrisch punt van 5,81), een buffersysteem met een pH van 8,5 en een sterke anionenwisselingshars leidt tot een goede scheiding. Gebonden eiwitten werden geellueerd met een hoogzout buffer gradiënt. Met een toename van Ionische kracht negatieve ionen in de elutie buffer concurreren met eiwitten voor ladingen op het oppervlak van de hars. Eiwitten individueel Elueer afhankelijk van hun netto-lading en in het resultaat daarvan, de buffers beschreven hierin laten toe om te isoleren en te concentreren de overexpressie S100A12 eiwit. Als gevolg van negatief geladen groepen in lipopolysacchariden, deze moleculen binden ook aan anion-uitwisseling harsen. Echter, hun hogere nettolading resulteert in latere elutie in de toegepaste hoogzout gradiënt. De tweede stap van de zuiverings procedure is ingevoerd voor polijst doeleinden. Dit maakt gebruik van het calcium bindings vermogen van S100A12 en verwijdert achtergebleven onzuiverheden op een hydrofobe-interactie kolom. Calcium binding van S100A12 leidt tot een conformationele verandering en een blootstelling van hydrofobe vlekken op het oppervlak van het eiwit. Op die voorwaarde communiceert S100A12 met het hydrofobe oppervlak van de hars. Bij calcium-chelaat door EDTA wordt deze interactie omgekeerd. In aanwezigheid van ionen, met name calcium en zink, regelt S100A12 de homomerische oligomeren. Om de structuur functie relaties van de verschillende oligomeren te bestuderen, stabiliseerde men dimeric, tetramere en hexameer recombinant S100A12 met een chemische als en scheidde de complexen op een grootte-uitsluitings chromatografie kolom. Tot slot, om de functionaliteit en biologische activiteit van het gezuiverde eiwit en de ionen-geïnduceerde oligomeren te analyseren, kan de cytokine-afgifte van S100A12 en LPS gestimuleerd monocyt worden vergeleken.

Verschillende methoden voor het zuiveren van S100A12 zijn tot nu toe beschreven. Jackson et al.19publiceerde bijvoorbeeld een protocol met zuivering via een anion-uitwisselings kolom en een daaropvolgende grootte-uitsluitings chromatografie. Het polijsten van zuivering op een kolom met grootte uitsluiting leidt tot goede resultaten, maar ― vanwege bijvoorbeeld beperkte laadvolumes ― is minder flexibel in schaalbaarheid. Een andere aanpak, gepubliceerd door Kiss et al.20, beschrijft de zuivering van gelabelde eiwitten via ni2 + affiniteits kolom als de eerste zuiveringsstap, gevolgd door enzymatische splitsing om de tag en verdere zuiveringsstappen te verwijderen. In tegenstelling tot de avooropgestelde studies19,20, wordt het geproduceerde eiwit zoals beschreven in dit protocol bepaald voor experimenten met immuuncellen. Daarom is restant endotoxine besmetting van bacteriële cultuur een uitdaging. Hoewel er tot dusver verschillende benaderingen voor de verwijdering van endotoxine zijn beschreven, is er geen uniforme methode die even goed werkt voor een bepaalde eiwit oplossing21,22.

Kortom, ons protocol combineert de voordelen van een tagvrije expressie in een bacterieel systeem met efficiënte endotoxine verwijdering en hoge opbrengst van zuivere eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Zie aanvullende tabel 1 voor de bereiding van buffers en voorraadoplossingen.

1. eiwit expressie in E. coli

  1. Klonen
    1. Kloon tag-vrije Human S100A12 (referentie sequentie van NCBI: NP_ 005612.1) in bacteriële expressie vector pET11b. Om het eiwit uit te drukken, Transformeer de constructie in E. coli BL21 (DE3).
  2. Cultuur
    1. Bereid een starter cultuur voor door het inoculeren van een enkele kolonie in 5 mL groeimedium (LB bouillon met 100 μg/mL ampicileen) in een 14 mL ronde bodem buis. Incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 220 rpm. Breng 2 − 4 mL van de overnachtings cultuur over in 400 mL groeimedium in een Erlenmayer kolf van 2 L en inbroed de kweek bij 37 °C met schudden bij 220 rpm.
      Opmerking: De initiële dichtheid van de hoofd cultuur moet een optische dichtheid zijn bij 600 nm (OD600) = 0,1.
    2. Bewaak de OD600 tijdens de groei. Induceren van eiwit expressie door toevoeging van 1 M Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tot een eindconcentratie van 1 mM bij OD600 = 0,5 − 0,6. Inincuberen bij 37 °C en 220 rpm voor extra 4 uur.
      Opmerking: Over het algemeen wordt een OD600 van 0,6 bereikt na 1,5 − 2,5 uur bij 37 °c.
    3. Bereid 50 mL sonicatie buffer door 50 mM Tris, 50 mM NaCl en 1 mM ethyleendiamine tetraazijnzuur (EDTA) in 40 mL gedeïoniseerd water op te lossen. Pas de pH aan met HCl tot 8,0 en maak tot 50 mL. Voeg proteaseremmer toe (1 tablet per 50 mL oplossing) en equilibreren de buffer tot 4 °C.
    4. Breng de bacteriecultuur over in geschikte centrifuge flessen en oogst de cellen op 3.200 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c. Gooi de supernatant weg en regeer de pellet in 25 mL ijskoude ultrasoonapparaatbuffer. Houd de cellen voortaan op ijs.
      Opmerking: Resuspendeerde cellen kunnen bij-20 °C worden bewaard voor kortstondig en bij-80 °C voor de lange termijn.
  3. Sonicatie/Lysis
    1. Soniceren de cellen gedurende 6 cycli van 30 s op ijs. Na elke cyclus, rust cellen voor 30 − 60 s om de cellen te beschermen tegen oververhitting.
    2. Breng de celsuspensie over in een voorgekoelde 50 mL hogesnelheidcentrifugeer buis en centrifugeer in een vaste hoekrotor bij 15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c. Decaner het geclearde lysaat dat de oplosbare cytosolische eiwitten bevat in een verse 50 mL Tube en gooi de pellet weg.

2. eiwit zuivering

  1. Chromatografie met anion-uitwisseling
    1. Dialyse
      1. Bereid anion-uitwisselings chromatografie (AIEX) buffer A door 20 mM Tris, 1 mM EDTA en 1 mM ethyleenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA) op te lossen in gedeïoniseerd water en de pH op 8,5 met HCl aan te passen. Voor dialyse bereiden 2 x 5 L en chromatografie 2x 1 L AIEX buffer A.
        Opmerking: Het dialysaat-volume moet ongeveer 100 keer het sample volume zijn. Alle buffers die voor chromatografie worden gebruikt, moeten worden gefilterd (0,45 μm of kleiner) en ontgast (bijv. door ultrasoon bad of vacuüm ontgassing).
      2. Geknipte dialyse slang (de cut-off van het molecuulgewicht [MWCO]: 3,5 kDa) in een passende lengte met extra ruimte voor lucht om het drijfvermogen boven de roterende roerstaaf te verzekeren.
        Opmerking: Glycerol behoudt het membraan en moet vóór gebruik worden verwijderd.
      3. Om de viscositeit van de geclearde eiwit oplossing uit stap 1.3.2 te verlagen, Verdun de oplossing met 25 mL AIEX buffer A om de daaropvolgende toepassing in de chromatografie kolom te vergemakkelijken. Bevestig de eerste sluiting op de slang, laad het monster in het membraan en bevestig de tweede sluiting ten minste 1 cm van het bovenste uiteinde van de slang.
      4. Plaats de 5 L-container met AIEX-buffer A op een roer plaat, voeg een roerstaaf toe en het membraan gevuld met eiwit oplossing. Pas de snelheid aan om het monster te roteren door interferentie met de roterende roer stang te voorkomen. Dialyze voor 12 − 24 uur bij 4 °c, vervang vervolgens de dialysaat buffer (aiex buffer A) door een verse voorgekoelde bereiding en blijf gedurende ten minste 4 extra uren. Breng de dialyzed proteïne-oplossing over naar een buis van 50 mL en filtreer door een filtereenheid van 0,45 μm.
        Opmerking: Opslag mogelijk.
    2. Chromatografie
    3. Start het vloeistofchromatografie systeem (FPLC) met algemeen onderhoud, verbind kolom buffers AIEX A en AIEX B (AIEX buffer A met 1 M NaCl) en de anion-uitwisselings hars met kolom. Raadpleeg tabel 1 voor algemene chromatografische parameters.
      Opmerking: buffers, kolommen en FPLC-apparatuur moeten op dezelfde temperatuur worden gebracht voordat de uitvoering wordt gestart (Zie chromatografische parameters in tabel 1, tabel 2, tabel 3, tabel 4en tabel 5).
    4. Evenwichts de kolom met aiex-buffer A, laad het monster vervolgens op de kolom en elueer de eiwitten met een lineair verloop van 0% tot 100% hoogzout buffer (aiex B). Raadpleeg tabel 2 voor een gedetailleerd methode protocol.
    5. Verzamel 2 mL fracties tijdens de elutie en analyseer 10 μL van elke fractie op een Coomassie-gekleurd 15% natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE). Pool de fracties met S100A12 eiwit voor dialyse.
      Opmerking: Het molecuulgewicht van S100A12 is 10.575 da.
  2. Calcium-afhankelijke hydrofobe-interactie chromatografie (HIC)
    1. Dialyse
      1. Dialyseer de eiwit oplossing tegen 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5 volgens de procedure beschreven in punt 2.1.1.
    2. Chromatografie
      1. Bereid 1 L chromatografie buffer HIC A door het oplossen van 20 mM Tris, 140 mM NaCl en 25 mM CaCl2 in gedeïoniseerd water en pas de pH op 7,5. Voor HIC buffer B, los 20 mM Tris, 140 mM NaCl en 50 mM EDTA op. Stel de pH in op 7,0 en filter en Degas de buffers. Voeg CaCl2 toe aan het monster tot een eindconcentratie van 25 mm en filtreer door 0,45 μm. EQUILIBRATE hic buffers en sample tot 4 °c (kolomtemperatuur).
      2. Start het vloeistofchromatografie systeem met algemeen onderhoud, verbind kolom buffers HIC A en B en de kolom. Zie tabel 3 voor verdere chromatografische parameters.
      3. Evenwichts de kolom, laad het monster en verleng het blok ' niet-afhankelijke monster ' totdat het UV-signaal opnieuw Baseline niveau bereikt. Begin dan met elutie met een calciumchelator die buffer bevat (EDTA). Raadpleeg tabel 4 voor een gedetailleerd methode protocol.
        Opmerking: Eerdere experimenten hebben aangetoond dat een overmaat calcium gunstig lijkt te zijn voor de binding van S100A12 aan de chromatografie hars.
      4. Verzamel piek fracties van 2 mL en analyseer 10 μL van elke fractie op een Coomassie-bevlekt 15% SDS-PAGE. Zwembad zuivere S100A12 fracties en dialyze tegen Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0) zoals beschreven in punt 2.1.1.
        NB: de extinctiecoëfficiënt van monomerische S100A12 is 2980 M-1 cm-1.

3. detectie en verwijdering van endotoxine

  1. Detectie van endotoxine
    1. Om de endotoxine besmetting te bepalen, meet u de concentraties van verdund eiwit uit stap 2.2.2.4. (bijv. 1:10 en 1:100 in HBS) met behulp van een enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)-gebaseerde, fluorescerende endotoxine detectie test (tabel met materialen). Voer deze test uit door het Protocol van de fabrikant te volgen.
      Opmerking: Gebruik vers bereide HBS-oplossingen opgelost in ultrapuur gedeïoniseerd water om (nieuwe) endotoxine verontreiniging door de buffer te voorkomen.
  2. Verwijdering van endotoxine en concentratie van eiwitten
    1. Laad 15 mL monster op een centrifugale filter unit 50 kDa en centrifugeer ongeveer 10 minuten bij 3.200 x g en 10 °C. Breng de doorstroom in een nieuw vat (op ijs) en centrifugeer de 50 kDa filter buis zo vaak als nodig. Was het filtermembraan tweemaal met HBS om zoveel mogelijk eiwitten na elke stap te herstellen.
    2. Concentreer de S100A12-bevattende doorstroming met behulp van een 3 kDa-centrifugale filter totdat het volume tot een vijfde wordt teruggebracht tot een tiende van het initiële laadvolume (centrifugeren bij 3.200 x g, 10 °c gedurende ongeveer 30 minuten). Vul het filter zo vaak als nodig in, spoel het membraan en breng de geconcentreerde oplossing over naar een nieuwe buis na elke vulling. Gooi de doorstroming weg. Filter opnieuw via 50 kDa zoals hierboven beschreven.
      Opmerking: Tijdens deze procedure is het verlies van eiwitten opmerkelijk (tot 50%), maar het resterende eiwit preparaat is volledig uitgeput van LPS. Deze methode levert ongeveer 10 − 15 mg eiwit uit 400 mL cultuur.
    3. Stel de eiwit oplossing in op 1 mg/mL met endotoxine vrije HBS en meet het LPS-gehalte zoals beschreven in stap 3.1.1. In het geval dat de eiwit oplossing nog steeds niet wordt getest als LPS-vrij (< 0.1 EU/mL), Elimineer restant verontreinigingen met behulp van een endotoxine verwijderings hars.
      Opmerking: Met een eiwitconcentratie van 1 mg/mL is besmetting van 0,1 EU/mL LPS gelijk aan ongeveer 0,01 PG LPS/μg eiwit.

4. chemische crosslinking en Oligomer scheiding

  1. Chemische crosslinking
    1. Bereid zeer zuivere (endotoxine-vrije) stockoplossingen van 1 M CaCl2 en 100 mm zncl2 in ultrapuur gedeïoniseerd water (tabel met materialen). Gebruik deze buffer, vers gemaakt, voor de volgende stap.
    2. Incubeer 10 mL gezuiverde endotoxine vrije S100A12 (concentratie 1 mg/mL in HBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) met 25 mM CaCl2 voor dimeric/tetrameric, of 25 mm CACL2 en 1 mm zncl2 voor HEXAMERIC/tetrameric S100A12 Oligomeren.
    3. Bereid als door het oplossen van 8 mg BS3 in 500 μL endotoxine-vrij water direct voor gebruik (8 mg als voor 10 ml Ion-spiked eiwit oplossing is gelijk aan een uiteindelijke concentratie van 1,4 mm). Meng als en monster door pipetteren en inbroed voor extra 30 min bij RT. Quench de reactie door 1 M Tris-HCl toe te voegen, pH 7,5 tot een eindconcentratie van 50 mm en filtreer door 0,45 μm.
  2. Grootte-uitsluitings chromatografie
    1. Het kruikoppelde monster wordt op 12 − 15 °C (kolomtemperatuur) en start het vloeistofchromatografie systeem met algemeen onderhoud. Verbind kolom buffer (HBS) en de kolom voor grootte uitsluiting. Raadpleeg tabel 5 voor gedetailleerde informatie.
    2. Evenwichts de kolom in HBS, laad monster en verzamel piek fracties (1 − 2 mL) tijdens de run. Analyseer deze fracties op een 4 − 20% gradiënt SDS-PAGE en pool fracties met grote banden van het gewenste proteïne complex.
      Opmerking: Hydrolyse van NHS-Ester reagentia, zoals BS3 in waterige oplossingen, resulteert in een sterke extinctie bij 280 nm. Ongebonden als (moleculair gewicht: 572 g/mol) afdempt aan het einde van de run en resulteert in een sterke piek.
    3. Concentreer de oplossingen met behulp van centrifugale filter units met MWCOs van 10 kDa (dimer), 30 kDa (Tetramer) of 50 kDa (hexamer). Bepaal de endotoxine contaminatie zoals beschreven in punt 3,1. Verwijder indien nodig resterende LP'S met een endotoxine verwijderings hars volgens de aanbevelingen van de fabrikant (tabel van de materialen).

5. functionele testen op monocyten

  1. Bereiding van monocyten
    1. Isoleer monocyten van menselijke Buffy jassen door dichtheidsgradiënt centrifugeren en daaropvolgende monocyt verrijking met behulp van een magnetische kraal separatie Kit (tabel van materialen).
      Opmerking: Dit protocol zal resulteren in ongeveer 5 − 7 x 107 monocyten (één buffycoat) met een zuiverheid van 83 − 95%. Aangezien het aantal, maar ook de responsiviteit van de cellen sterk afhangt van de donor, moet het protocol mogelijk worden opgeschaald (afhankelijk van het aantal vereiste aantallen).
    2. Voor dichtheids centrifugeren wordt de separatieoplossing (dichtheid = 1,077 g/mL) naar RT en breng 20 mL over in 50 mL centrifugebuizen (2 tubes per buffy coat). Verdun bloed uit de menselijke buffy coat met de gebufferde zoutoplossing van Hank (HBSS) tot een totaal volume van 60 mL en laag 30 mL van dit mengsel voorzichtig bovenop het scheidings medium. Centrifugeer bij 550 x g voor 35 min bij RT. Schakel de centrifuge-rem uit.
    3. Na centrifugeren bevinden de mononucleaire perifere bloedcellen (PBMCs) zich direct bovenop het scheidings medium. Breng deze cellen over in een nieuwe centrifugebuis van 50 mL, maak tot 50 mL met HBSS en centrifugeer bij 170 x g gedurende 10 minuten. aspireren van de supernatant en hervatten van de celpellet in een klein volume van HBSS door pipetteren.
    4. Vul de buis tot 50 mL en centrifugeer bij 290 x g gedurende 10 min. aspireren de supernatant opnieuw, Redigeer de cellen in HBSS (50 ml) en centrifuge bij 170 x g gedurende 10 min. Tel de cellen en hervat ze in Celscheidings buffer (tabel met materialen < /C9 >) tot een concentratie van 5 x 107 cellen/ml.
      Opmerking: In plaats van HBSS kan fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) worden gebruikt voor het wassen van de cellen.
    5. Voor monocyt-isolatie van PBMCs gebruikt u een magnetische negatieve cel isolatie kit en volgt u het Protocol van de fabrikant. Graaf monocyten en respenderen in monocyt medium (rpmi 1640, 15% warmte-geïnactiveerd foetaal kalf serum [FCS], 4 mm L-glutamine, 100 U/ml penicillaire/streptomycine) tot een concentratie van 2 x 106 cellen/ml.
    6. Cultuur monocyten, Coat cultuur gerechten (bijv. 100 mm) met een hydrofobe, gasdoorlatbare film, geschikt voor suspensie cellen (tafel van materialen). Steriliseer de platen met UV-licht gedurende ongeveer 30 min. Breng de cellen over naar deze kweek platen en laat ze 's nachts rusten bij 37 °C en 5% CO2.
      Opmerking: Gebruik 15 − 25 mL celsuspensie per gecoate schaal.
  2. Monocyt stimulatie
    1. Stimulatie met S100A12 (wild type)
      Opmerking: Om onbehandelde S100A12 (eindproduct uit punt 2.2.2) van kruisgebonden eiwitten te onderscheiden, wordt S100A12 in het volgende aangeduid als "wild type".
      1. Breng de uitgerust cellen over in een centrifugale buis van 50 mL en centrifugeer bij 350 x g gedurende 10 minuten. aspireren de supernatant en reactiveren van de celpellet in stimulatie medium (rpmi 1640, 5% Heat-GEÏNACTIVEERD FCS, 4 mm L-glutamine, 100 U/ml penicillaire/ streptomycine) bij een concentratie van 2 x 106 cellen/ml.
      2. Gebruik voor stimulatie 24 goed geveerde platen en voeg 250 μL celsuspensie per goed toe (0,5 x 106 cellen/goed). Voeg 50 μg/mL Polymyxine B toe aan de beoogde putjes, gevolgd door ofwel LPS in verschillende concentraties (25, 50, 100 en 200 PG/mL) of wild type S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/mL). Verder, breng het eiwit ofwel onbehandeld of hitte-gedenatureerd (99 ° c, 10 min) in verschillende concentraties aan de cellen.
        Opmerking: Een korte hittebehandeling denaturen S100A12 eiwit, maar heeft minder tot geen effect op LPS.
      3. Incuberen de platen gedurende 4 uur bij 37 °C en 5% CO2. Oogst de cellen door het overbrengen van de celsuspensie van elke put naar 1,5 mL reactie buisjes. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 min. Breng de supernatanten over naar verse buisjes en meet de tnfα-afgifte in verschillende verdunningen (bijv. 1:2, 1:5, 1:10) met een humane tnfα-ELISA-kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Stimulatie met S100A12 oligomeren
      1. Bereid en zaad uit monocyten in 24 goed geveerde platen zoals hierboven beschreven. Stimuleer cellen door S100A12 oligomeren uit stap 4.2.3 toe te voegen. in verschillende molaire concentraties (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
        Opmerking: Om de capaciteiten van de verschillende oligomeren te vergelijken om monocyten te stimuleren, werden oligomeren toegepast op de cellen in vergelijkbare molaire concentraties.
      2. Inbroed voor 4 uur bij 37 °c en 5% Co2, oogst de cellen en meet de tnfα-afgifte in de supernatanten zoals hierboven beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na pre-zuivering op de AIEX-kolom (Figuur 1a-C) en daaropvolgende calcium-afhankelijke hic (Figuur 2a, B) werd zeer zuivere eiwitten verkregen (figuur 2c). Bovendien onthulde metingen van endotoxine succesvolle LPS verwijdering. De LPS-inhoud na AIEX werd gemeten in een 1:10-verdunning boven de detectiegrens van de Assay, d.w.z. boven 500 EU/mL. Na de eerste filtratie door een 50 kDa filter unit wer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol beschrijven we tag-vrije bacteriële expressie van menselijke S100A12 en de zuivering ervan, evenals scheiding in verschillende ionen-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulatie. Vergeleken met gepubliceerde literatuur over S100A12 proteïne zuivering8,23,24, het gebruik van hoge CACL2 (25 mm) in hydrofobe-interactie chromatografie is onze kennis uniek. Verschillende protocollen die concentraties va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gesteund door subsidies van het intramurale Innovative Medical Research Program van Muenster University Medical Faculty (KE121201 to C.K.) en de German Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 tot D.F.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pET11b vectorNovagen  
BL21(DE3) competent E. coliNew England BiolabsC2527 
    
100x Non-essential amino acidsMerckK 0293
25% HClCarl RothX897.1
4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein GelsBioRad4561093
Ampicillin sodium saltCarl RothHP62.1
BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mgThermoFisher Scientific21580
Calciumchlorid DihydratCarl Roth5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 Destaining SolutionBioRad1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Staining SolutionBioRad1610436
EasySep Human Monocyte Enrichment KitStemcell19059Magnetic negative cell isolation kit
EDTA disodium salt dihydrateCarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.3
EndoLISAHyglos609033Endotoxin detection assay
Endotoxin-Free Ultra Pure WaterSigma-AldrichTMS-011-AUltrapure water for preparation of endotoxin-free buffers
EndoTrap redHyglos321063Endotoxin removal resin
FBS (heat-inactivated)Gibco10270
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14175053
HepesCarl Roth9105
Hepes (high quality, endotoxin testet)Sigma-AldrichH4034
hTNF-alpha - OptEia ELISA SetBD555212
IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid)Carl RothCN08.1
L-Glutamine (200 mM)MerckK 0282
LB-MediumCarl RothX968.1
Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5MerckL6529
Pancoll, humanPAN BiotechP04-60500Separation solution (density gradient centrifugation)
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL)MerckA 2212
Phenyl Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-1082-01Resin for hydrophobic interaction chromatography
Polymyxin BInvivogentlrl-pmb
Protease inhibitor tabletsRoche11873580001
Q Sepharose Fast FlowGE Healthcare17-0510-01Resin for anion-exchange chromatography
RoboSep bufferStemcell20104Cell separation buffer (section 5.1.4)
RPMI 1640 MediumMerckF 1215
Sodium chloride (NaCl)Carl Roth3957.2
Sodium hydroxideCarl RothP031.1
Tris BaseCarl Roth4855.3
Zinc chlorideCarl RothT887
Labware
0,45 µm syringe filterMerckSLHA033SS
14 mL roundbottom tubesBD352059
2 L Erlenmyer flaskCarl RothLY98.1
24 well suspension platesGreiner662102
5 L measuring beakerCarl RothCKN3.1
50 mL conical centrifuge tubesCorning430829
50 mL high-speed centrifuge tubesEppendorf3,01,22,178
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDaMerckUFC900324
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDaMerckUFC905024
Culture dish (100 mm)Sarstedt83.3902
Dialysis Tubing ClosuresSpectrum132738
EasySep magnet 'The Big Easy`Stemcell18001
Fraction collector tubes 5 mLGreiner115101
Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 mSarstedt94,60,77,316Film for monocyte culture plates
Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)Spectrum132724
Steritop filter unitMerckSCGPT01RE
Equipment
37 °C Incubator (with shaking)New Brunswick ScientificInnova 42
ÄKTA purifier UPC 10GE HealthcareFPLC System
Fraction collectorGE HealthcareFrac-920
Centrifuge (with rotor A-4-81)Eppendorf5810R
Fixed angle rotorEppendorfF-34-6-38
Mini Protean Tetra CellBioRad1658000EDU
NanoPhotometerImplenP330
SonicatorBrandelinUW2070
Fluorescence readerTecaninfinite M200PRO
pH meterKnick765

Referenties

  1. Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
  2. Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
  3. Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
  4. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
  5. Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
  6. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  7. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  8. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
  9. Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
  10. Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11(2009).
  11. Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
  12. Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
  13. Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
  14. Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
  15. Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
  16. Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
  17. Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
  18. GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
  19. Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
  20. Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
  21. Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
  22. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
  23. Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
  24. Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
  25. Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
  26. Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
  27. Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
  28. Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

S100A12-zuiveringanionenuitwisselingschromatografiehydrofobe interactiechromatografie大きte-uitsluitingschromatografiechemische crosslinkingendotoxineverwijderingmonocytenisolatieTNF-alfa-vrijgave
Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.