Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Summary

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Abstract

Menselijke pluripotente stamcellen bieden een krachtig systeem om de genfunctie te bestuderen en specifieke mutaties te modelleren die relevant zijn voor de ziekte. Het genereren van precieze heterozygoot genetische modificaties is uitdagend als gevolg van CRISPR CAS9 gemedieerde Indel vorming in het tweede allel. Hier demonstreren we een protocol om deze moeilijkheid te helpen overwinnen door twee reparatie sjablonen te gebruiken waarin slechts één de gewenste sequentie wijziging tot uitdrukking brengt, terwijl beide templates stille mutaties bevatten om hersnijden en Indel vorming te voorkomen. Deze methodologie is het meest voordelig voor genbewerkings coderings gebieden van DNA om isogene controle en Mutant menselijke stamcellijnen te genereren voor het bestuderen van menselijke ziekten en biologie. Daarnaast is optimalisatie van transfectie-en screenings methodieken uitgevoerd om de arbeid en de kosten van een genbewerkingsexperiment te verminderen. Over het algemeen is dit protocol algemeen toepasbaar op vele genoom bewerkings projecten met gebruikmaking van het menselijke pluripotente stamcel model.

Introduction

Menselijke embryonale stamcellen (hescs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) zijn waardevolle hulpmiddelen voor het modelleren van menselijke ziekten als gevolg van hun vernieuwings capaciteit, met behoud van de mogelijkheid om celtypen van verschillende lijn afstanden te genereren^{1,2 ,3,4}. Deze modellen openen de mogelijkheid om de genfunctie te interromen en te begrijpen hoe specifieke mutaties en fenotypes gerelateerd zijn aan verschillende ziekten^5,6. Echter, om te begrijpen hoe een specifieke wijziging is gekoppeld aan een bepaald fenotype, is het gebruik van een gepaarde isogene controle en Mutante cellijnen belangrijk om te controleren op lijn tot lijn variabiliteit^7,8. Transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen (TALENs) en zink vinger nucleasen zijn gebruikt voor het genereren van inbrengen of verwijderen (indels) mutaties in diverse genetische modellen, met inbegrip van primaire cellen; maar deze nucleasen kunnen omslachtig te gebruiken en duur^{9,10,11,12,13,14}. De ontdekking van de geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalings (CRISPR)-CAS9 Nuclease heeft het veld veranderd als gevolg van efficiëntie in Indel-vorming in vrijwel elke regio van het genoom, eenvoud van gebruik en reductie in kosten^{15 , 16 , 17 , 18 , 19}.

Een uitdaging bij het gebruik van de op crispr CAS9 gebaseerde genoom Editing-technologie is het genereren of corrigeren van specifieke mutaties in één allel zonder een Indel-mutatie te creëren in het tweede allel²⁰. Het belangrijkste doel van dit protocol is om deze uitdaging te overwinnen door gebruik te maken van twee enkel-streng oligonucleotide (ssODN) reparatie templates om Indel vorming in het tweede allel te verminderen. Beide ssODNs zijn ontworpen om stille mutaties te bevatten om hersnijden door de CAS9 Nuclease te voorkomen, maar slechts één bevat de verandering van belang. Deze methode verhoogt de efficiëntie van het genereren van een specifieke heterozygoot genetische modificatie zonder het induceren van Indel vorming in het tweede allel. Met behulp van dit protocol tonen genbewerkingsexperimenten in zes onafhankelijke genomische locaties de precieze introductie van de gewenste genomische verandering in één allel zonder Indel-vorming in het tweede allel en treedt op met een totale efficiëntie van ~ 10%. Het beschreven protocol is aangepast van Maguire et al.²¹.

Protocol

1. ontwerp en constructie van gids RNA (gRNA)

Opmerking: elke gRNA bestaat uit 2 60 base pair (BP) oligonucleotiden die zijn gegloeid om een 100 BP dubbel strandde (DS) oligonucleotide (Figuur 1a-C) te genereren. De tijdlijn voor gRNA ontwerp, generatie en testen snijefficiëntie is ongeveer 2 weken (Figuur 2).

1. Selecteer het DNA-gebied van belang om genoom te worden bewerkt en Identificeer 3-4 23 BP-sequenties die passen bij het formaat, 5 '-G (N₁₉) NGG-3 '. Deze sequenties moeten binnen 20 BP van het interessegebied liggen.
   Opmerking: targeting kan worden uitgevoerd op de Sense-of anti-Sense-streng.
2. Evalueer de gRNA-sequenties voor genomische redundantie en niet-doel waarschijnlijkheid met behulp van een resource zoals CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
3. Neem de 20 BP doel sequentie (met uitzondering van het protospacer aangrenzend motief of PAM) op in 2 60-Mer oligonucleotiden zoals afgebeeld (sequenties zijn 5 ' tot 3 ' en rood en groen zijn omgekeerde aanvullingen zoals weergegeven in Figuur 1C).
4. Bestel de 2 60 BP oligonucleotiden van de leverancier naar keuze. Als de oligonucleotiden eenmaal zijn ontvangen, hervat u elk tot een eindconcentratie van 100 μM in ddH₂O. Maak een werkende voorraad van 10 μM.
5. Anneal de twee oligonucleotiden en het genereren van een 100 BP dsDNA fragment met behulp van DNA-polymerase (tabel van materialen). Combineer 5 μL van 10 μM voorwaarts oligonucleotide en 5 μL 10 μM reverse oligonucleotide in een polymerase kettingreactie (PCR) strip buis en inincuberen bij 95 °C gedurende 5 min. laat de reactie gedurende 10 minuten afkoelen bij kamertemperatuur (RT).
6. Stel de PCR in zoals beschreven in tabel 1. Voer PCR-versterking uit in een thermische cycler met behulp van de parameters die worden beschreven in tabel 2.
7. Visualiseer de PCR-producten op een 1,5% (w/v) ethidiumbromide bromide (etbr) agarose gel elektroforesed bij 80-100 V voor 40 min. accijnzen de 100 BP band (Figuur 3a), GEVISUALISEERD op een LED lichtbak, van de gel met een scheermesje en zuivert met een gel extractie Kit (tabel van materialen).

2. ontwerp van PCR-primers voor screening

1. Voer screening van het bewerkte DNA uit met behulp van voorwaartse en omgekeerde PCR-primers die specifiek zijn ontworpen om een 400-500 BP-regio van het gen van belang te versterken (tabel 2). Gebruik DNA geïsoleerd van elke controle-iPSC-lijn om een schone ampliconlengte voor Temp te bevestigen bij het uitvoeren van de screening-PCR.
2. Visualiseer PCR-producten op een 1,5% (w/v) gel na Elektroforese bij 80-100 V gedurende 1 uur.
   Opmerking: Sequentiëren van bewerkte klonen wordt uitgevoerd met behulp van een geneste primer die is ontworpen na bevestiging van de screening primer set. Monsters worden verzonden naar een commerciële bron voor sequentiëren.

3. bereiding van gRNA_cloning vector plasmide

1. Om de kloon vector te linealiseren, neemt u een centrifugebuis van 1,5 mL en voegt u 1-5 μg DNA van de gRNA_cloning vector toe, samen met 4 μL van de AFLII-beperkings enzym buffer en 1,5 μl AFLII-restrictie-enzym. Breng de reactie op 24 μL ddH₂O. Meng de reactie door Pipetteer op en neer. Incuberen bij 37 °C 's nachts (O/N).
2. Electrophorese op een 1% agarose gel bij 80-100 V voor 1 h en accijnzen banden (verwachte band grootte is ~ 3519 BP).
3. Extract en zuiveren zoals in stap 1,6.

4. assemblage van gRNA vector

1. Reacties instellen en DNA-fragmenten samenstellen met behulp van de montagekit (tabel met materialen) bij 1:5 ratio's van AFLII verteerd grna klonen vector naar 100 BP gel gezuiverde wisselplaat, zoals beschreven in tabel 3.
2. Incuberen de reactie bij 50 °C gedurende 15 min. Verdun de reactie 1:3 in ddH₂O en gebruik 3 μL voor bacteriële transformatie volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen). Plaat cellen op kanamycine LB/agar platen.
3. Kies 3-5 kolonies per gRNA. Inoculeren elke kolonie in 4 mL LB en groeien O/N bij 37 ° c in een orbitaal schudden incubator.
4. Reinig plasmide DNA met behulp van een miniprep plasmide isolatiekit en volg elke gRNA met behulp van de volgende primers om een succesvol klonen te garanderen: doorsturen: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Omgekeerde: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.

5. test de snijefficiëntie van gRNA

1. Plaat hESCs op bestraalde muriene embryonale fibroblasten (Mef's) in een 6-put plaat, zoals eerder beschreven²¹. Wanneer de cellen 70-80% confluency bereiken, bereidt u de transfectie Master mix voor in tabel 4.
2. Meng door pipetteren en inbroed bij RT gedurende 15 min. Voeg druppelsgewijs toe aan de cellen en inincuberen bij 37 °c gedurende 48 uur (met een media verandering na 24 uur).
3. Oogst cellen voor sortering na 48 h.
   1. Verwijder MEFs enzymatisch (tabel met materialen) met een incubatie van 3 min RT.
   2. Spoel cellen 1x met hesc medium (tabel 5) en schraap in hesc medium + 10 μM Y-27632 dihydrochloride (tabel van materialen).
   3. Pellet cellen bij 300 x g gedurende 3 minuten en respenderen in 0,5 ml hesc medium + 10 μM Y-27632 dihydrochloride.
   4. Filtreer in een 5 mL buis door een 35 μm celstrainer dop.
4. Met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), poort op levende cellen en sorteer de groene fluorescerende proteïne (GFP) positieve cellen.
5. Breng maximaal 1,5 x 10⁴ gesorteerde cellen rechtstreeks over in een schotel van 10 cm² met 1:3 Basement membraan matrix (tabel met materialen) en bestraalde mef's in hesc-medium (tabel 5) met Y-27632 dihydrochloride.
6. Verander medium dagelijks met behulp van de hESC medium (tabel 5) zonder Y-27632 dihydrochloride en handmatig te plukken klonen na 10-15 dagen, wanneer kolonies zijn ~ 1 mm in diameter.
   1. Met behulp van een P200 pipet en Microscoop, zorgvuldig schrait een enkele kloon en trek cellen in de pipet.
   2. Dispergeren de cellen door zachtjes pipetteren 3-4x in een 96 goed bord in het medium opgesteld met de kolonie.
   3. Afdoseren van PCR-strip buizen voor screening en pellet de cellen door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 min. Kies 20 kolonies per grna.

6. kloon screening

1. Isoleer DNA door celpellets te inbrokkelen in 20 μL proteïnase K-buffer (tabel 5) (1 uur bij 55 °c en 10 min bij 95 °c) en Vortex krachtig. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 minuten en vang het supernatant op.
2. Voer screening-PCR (sectie 2) uit in een totaal volume van 20 μL met behulp van een Master-Mix, inclusief primers die zijn ontworpen om het gebied van belang te versterken en 5 μL van de proteïnase K Digest. Gebruik genomisch DNA geïsoleerd van de cellijn die genbewerkt was als een controle.
3. Evalueer grootte wijzigingen van PCR-producten na 1 uur Elektroforese bij 70-90 V op een 2,5% (w/V) agarose-gel (Figuur 3B, C). Elke grootte verschil is indicatief voor decolleté.

7. precieze genoom bewerking in pluripotente stamcellen met behulp van enkele streng oligo DNA (ssODNs)

1. Ontwerp 100 BP ssODNs gecentreerd rond de meest efficiënte gRNA-sequentie, vastbesloten om de beste snijefficiëntie te hebben.
2. Voorkom opnieuw splijting van de hercombineerde ODN door het introduceren van stille mutaties in de gRNA-sequentie. Een enkele stille mutatie in de PAM-reeks volstaat, maar als dit niet mogelijk is, zullen 3-4 stille mutaties werken.
   Opmerking: om de screening van gerichte klonen te vergemakkelijken, is de introductie van een beperkings site binnen ~ 20 BP van de gRNA-reeks ideaal.
3. Ontwerp een ODN met de gewenste basis wijziging (en) om de mutatie van belangstelling te creëren en een ODN zonder de basis wijziging (en).
   Opmerking: deze wijzigingen mogen niet meer dan ~ 20 BP van de voorspelde CRISPR/CAS9 cut site, als recombinatie daalt aanzienlijk op grotere afstanden.
4. Bestel de twee ssODNs van de leverancier van keuze en respendeer in water om 1 μg/μL voorraden te maken. Winkelvoorraden bij-20 °C.

8. transfection Setup

1. Voor het transfect van de ssodn en de crispr CAS9 plasmiden, plaat de doelcel lijn in een 6-well gerecht op bestraalde mefs om 70-80% confluentie te bereiken na een incubatie van O/N.
2. De transfectie reactie instellen zoals beschreven in tabel 6. Meng de reactie door pipetteren en incuberen gedurende 15 minuten bij RT. Voeg het transfectie-reactiemengsel druppelsgewijs toe aan de cellen.
3. Na 48 h, bereidt u de cellen voor op celsortering zoals beschreven in paragraaf 5,3.
4. Kies kolonies ~ 10 dagen na het bekleden van enkele cellen met een pipet van 200 μL. Breng 100 μL cellen over naar een put van een 24-of 48-goed plaat die eerder is bekleed met gelatine en bestraalde Mef's in hESC-medium met Y-27632 dihydrochloride. Gebruik de resterende 100 μL voor DNA-isolatie zoals beschreven in rubriek 6.

9. controle op mutaties in enkele kolonies

1. Om te controleren op een geslaagde integratie van de ssODN, neemt u 5 μL DNA geïsoleerd van elke kolonie om PCR uit te voeren met behulp van de screenings primers die zijn ontworpen in sectie 2. Reinig de PCR-producten (tabel met materialen) en bereid de vergisting van het restrictie enzym voor met behulp van de unieke enzym site die in de ssodn is gemaakt.
   Opmerking: deze spijsvertering omvat ook de restrictie-enzym buffer en de aanbevolen concentratie van het beperkings enzym van de fabrikant in een volume van 40 μL.
2. Meng de reactie door pipetteren en inbroed op de aanbevolen temperatuur van de fabrikant voor 1-3 h.
3. Visualiseer de verteerde PCR-producten op een 1,5% (w/v) EtBr agarose gel elektroforesed bij 80-100 V voor 40 min. Als er een succesvolle integratie van de ssODN heeft plaatsgevonden, volg dan specifieke mutaties met behulp van een geneste primer.

Results

Generatie gRNAs en screening voor indels

Elke gRNA wordt gekloond in een plasmide vector en uitgedrukt met de promotor U6. Het AFLII restrictie-enzym wordt gebruikt voor het linealiseren van het plasmide (addgene #41824) en bevindt zich na de promotor U6. De 100 BP-band gegenereerd na het gloeien van de 2 60 BP oligos wordt gekloond in de gRNA expressie vector met behulp van de DNA-verzameling. Zodra de gRNA plasmiden worden gegenereerd, worden ze omgezet in hESCs of ...

Discussion

In dit protocol wordt het gebruik van CRISPR CAS9 samen met twee ssODN-reparatie sjablonen voor het genereren van specifieke heterozygoot-of homozygoot-genoom veranderingen aangetoond in menselijke pluripotente stamcellen. Deze methode resulteerde in de succesvolle generatie van isogene cellijnen die heterozygoot genomische veranderingen uitdrukken met een efficiëntie dicht bij 10%. Dit protocol is geoptimaliseerd voor zowel menselijke Esc's en iPSCs geteeld op bestraalde Mef's die celgroei en overleving ondersteunen na ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ml polystyreen buis met ronde bodem en cel-strainer dop	Corning	352235
6-wells polystyreen weefselkweekschalen	Corning	353046
AflII restrictie-endonuclease	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) apparaat
Gel extractie kit	Macherey-Nagel	740609
Gibson Assembly Kit	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB agar platen bevattende 50 μg/ml kanamycine
Lipofectamine Stem Reagent	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	354230
Murine embryonale fibroblasten (MEFs)
Nucleospin Gel Extractie en PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609
Orbitaal schuddende incubator
pCas9_GFP vector	Addgene	44719
PCR stripbuizen	USA Scientific	1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase en 5× Phusion buffer	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM elektrocompetente Escherichia coli cellen	Takara	636763
SOC medium	New England Biolabs	B9020S
TrypLE Express Enzym	ThermoFisher	12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)	Tocris	1254