Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de muis oogbol met ooglid, oogoppervlak, voorste en posterieure segmenten in relatief intacte positie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Oculaire oppervlak (OS) bestaat uit een epitheel blad met drie verbonden delen: palpebrale conjunctiva, bulbaire conjunctiva en corneale epitheel. Verstoring van OS zou leiden tot keratitis, conjunctivitis of beide (keratoconjunctivitis). In experimentele diermodellen met bepaalde genetische modificaties of kunstmatige operaties, is het nuttig om alle delen van het OS epitheel blad te onderzoeken om relatieve Pathogenetische veranderingen van elk deel parallel te evalueren. Echter, dissectie van OS weefsel als geheel zonder vervorming of beschadiging is uitdagend, voornamelijk te wijten aan de zachtheid en de dunheid van het besturingssysteem aangebracht op fysiek gescheiden maar beweegbare oogleden en oogbol. Bovendien wordt het diepe oogcontact dat wordt gevormd door de harde schedel/orbitale botten volledig bezet door de oogbol, waardoor er weinig ruimte is voor de exploitatie van dissecties. Als gevolg daarvan, directe dissectie van de oogbol met geassocieerde OS weefsels uit de gezichts zijde zou vaak leiden tot weefselschade, vooral de palpebrale en bulbaire conjunctiva. In dit protocol hebben we een methode beschreven om de schedel en orbitale botten opeenvolgend te verwijderen van een in elkaar verteerde muis hoofd, waarbij oogleden, oogoppervlak, lens en netvlies helemaal in één stuk worden verwijderd. De integriteit van het OS-blad was goed bewaard gebleven en kon in één sectie worden onderzocht door histologie of immunokleuring.
Inleiding
Het oogoppervlak bestaat uit een continu blad van geregiinaliseerd epitheel, inclusief palpebrale conjunctiva, bulbaire conjunctiva en cornea1. Veel klierstructuren worden geassocieerd met het oculaire oppervlak epitheel en samen genereren een laag van scheur film bescherming van het oppervlak van het hoornvlies van drogen en milieu invasies2. Verstoring van OS zou leiden tot keratitis, conjunctivitis of beide (keratoconjunctivitis). Zowel genetische factoren als milieu irriterende stoffen of hun interacties dragen bij aan pathologische veranderingen van het OS3,4
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot het gebruik van muizen werden goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité, Zhongshan Ophthalmic Center, en gehecht aan de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en Vision onderzoek.
1. dissectie van de oogbol met intact oculair oppervlak en oogleden
- Ontleden het hoofd.
- Euthananisatie postnatale dag 10 (P10) en P28 muizen (Zie de tabel met materialen voor muis stammen) door cervicale dislocatie, snijd het hoofd van de nek door een paar scherpe schaar.
- Bisect hoofd met een paar rechte schaar langs de sagittale middellijn beginnend bi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De belangrijkste schedel botten bekeken vanuit verschillende perspectieven werden geïllustreerd in Figuur 1A-E, met kleuren die wijzen op verschillende botten. We gebruikten vier weken oud dier voor demonstratie van de dissectie processen. Na dissectie stappen 1.1.1-1.1.3 en een korte voor fixatie (stap 1.1.4), wordt de oogbol met bijbehorende gelaats beenderen gedemonstreerd in Figuur 1E. Verder.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een kritische herinnering voor de voorbereiding van de intacte oogbol is dat alle orbitale botten volledig moeten worden verwijderd, vooral de juga-en traan beenderen, die klein zijn en zich in de buurt van de onderkant van de oogkas bevinden. Eventuele overgebleven beenderen kunnen de daaruit voortvloeiende histologie compliceren. In het geval dat een klein stukje bot niet per ongeluk volledig uit de sectie is verwijderd, kan het worden afgehaald uit het insluitings paraffine blok met behulp van een paar sharppincet. Na.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken prof. Rong Ju voor de kritische lezing van het manuscript en alle lableden voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Peking, China), het Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation project (201707020009; Guangzhou, provincie Guangdong, China), "100 people plan" van Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, provincie Guangdong, China), en onderzoek financiering van State Key laboratorium voor oogheelkunde in Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, provincie Guangdong, China).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Kleefmicroscoopglazen | Verschillend | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Aanbevolen concentratie 1:500 - 1.000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Aanbevolen concentratie 1:500 - 1.000 |
| Anti-K12 antilichaam | Abcam | ab124975 | Aanbevolen concentratie 1:1.000 |
| Anti-K14 antilichaam | Abcam | ab7800 | Aanbevolen concentratie 1:800 |
| Citroenzuur | Verschillend | ||
| Dekglas | Verschillend | ||
| Gebogen pincet | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissectiemicroscoop. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethylalcohol | Verschillend | ||
| Fluorescente microscoop | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Montagemedium | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecteer schaar - rechte kling | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microgolfovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Muisstammen | C57/BL6 en Sv129 gemengd | ||
| Nr. 4 rechte pincet | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normaal geitenserum | Verschillend | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Verschillend | Bereid een 4% oplossing in 1× PBS en filter met 0,45 μm filtermembraan | |
| Weefselkweekschaal | Verschillend | ||
| Trisodiumcitraat | Verschillend | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
Referenties
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
