Lichtgeïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten met behulp van het PRIMO-systeem voor micro patronen om Celresponsen te bestuderen op extracellulaire matrix eiwitten

Samenvatting

Ons algemene doel is om te begrijpen hoe cellen extracellulaire signalen voelen die leiden tot gerichte axonale groei. Hier beschrijven we de methodologie van licht-geïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten, gebruikt om gedefinieerde micro-patronen van extracellulaire matrix componenten te produceren om specifieke gebeurtenissen te bestuderen die axon-uitgroei en pathfinding beheersen.

Samenvatting

Cellen hebben een verscheidenheid aan extracellulaire signalen, waaronder de samenstelling en geometrie van de extracellulaire matrix, die wordt gesynthetiseerd en verbouwd door de cellen zelf. Hier presenteren we de methode van licht-geïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten (LIMAP) met behulp van het PRIMO-systeem als patroon techniek om micro-patroon extracellulaire matrix (ECM) substraten te produceren met behulp van een enkele of combinatie van eiwitten. De methode maakt het afdrukken van ECM-patronen mogelijk in micron-resolutie met uitstekende reproduceerbaarheid. Wij bieden een stap-voor-stap protocol en laten zien hoe dit kan worden toegepast om de processen van neuronale pathfinding te bestuderen. LIMAP heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van bestaande micro-print methoden in termen van het gemak van het patronen van meer dan één component en de mogelijkheid om een patroon te genereren met elke geometrie of gradiënt. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast om de bijdrage van bijna elke chemische component naar het lot van de cel en het Celgedrag te bestuderen. Tot slot bespreken we veelvoorkomende problemen die kunnen ontstaan en hoe deze kunnen worden vermeden.

Inleiding

De laatste jaren hebben de biologische wetenschappen steeds meer gebruik gemaakt van de vooruitgang van de materiële wetenschappen. Een prominent voorbeeld is de micro-patterning van substraten, die kan worden gebruikt om cellulaire reacties te bestuderen, zoals celproliferatie^1,2Differentiatie^3,4,5,6, Celmigratie^7,8,9en padvinden^10,11. Er zijn een aantal technieken beschikbaar die de micro-patterning van substraten mogelijk maken, zoals multiphoton-Fotochemie¹², AFM DIP-pen lithografie¹³, PIN en inkjet direct printen¹⁴, elektronenstraal lithografie¹⁵of microfluïdica¹⁶. Echter, twee technieken die op grote schaal worden gebruikt in het biologische veld zijn microcontact afdrukken^17,18,19of lasergestuurd patroon³(Figuur 1). Lasergeassisteerd patroon wordt beschouwd als het leveren van betrouwbaardere resultaten in termen van eiwit-en PEG-stabiliteit en celopsluiting op de patronen, vergeleken met het afdrukken van micro contact²⁰. Een meer nieuwe aanpak voor micro-patterning die hier wordt beschreven, is het gebruik van Lichtgeïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten²¹(LIMAP,Figuur 1 D) via een in de handel verkrijgbaar systeem (PRIMO,Tabel met materialen). Elk van de methoden heeft voordelen en beperkingen die hieronder kort worden beschreven. Micro contactafdrukken maakt gebruik van PDMS mallen (stempels) met de gewenste micro-functies die worden gegenereerd uit gelithografeerde meesters. De stempels worden geïnfiltreerd met een gekozen eiwit dat vervolgens wordt overgebracht (gestempeld) op het substraat van de celcultuur¹⁸(Figuur 1 A). Laser-Assisted patronen maakt gebruik van UV-licht om een anti-fouling film te klieven^22,23,24,25, gebieden bloot die vervolgens kunnen worden bekleed met het eiwit van belang (Figuur 1 B). Terwijl de resolutie bereikt met foto-patterning benaderingen is in het micron bereik^25,26, vereisen de meeste van deze technieken een foto masker, hetzij in contact met het monster, hetzij gelegen in het objectvlak van de Microscoop doelstelling^23,27,28. De vereisten voor maskers in zowel micro contactafdrukken als foto-patterning kunnen een beperking zijn; specifieke maskers zijn vereist voor elk geometrisch patroon en grootte, wat duur en tijdrovend kan zijn om te genereren. In tegenstelling tot deze technieken vereist LIMAP geen masker (Figuur 1 D). Het gebruik van het PRIMO-systeem voor LIMAP kan in het begin kostenintensief zijn omdat het aanschaf van apparatuur vereist. Open-source software wordt echter gebruikt om patronen van elke gewenste geometrie te ontwerpen, waardoor veel meer vrijheid wordt gegeven en complexere experimenten mogelijk zijn, waaronder het gebruik van eiwitconcentratie gradiënten. De Primo laser wordt aangestuurd en bestuurd door een digitaal gestuurde Digital Device (DMD) om patronen te creëren in een aantal door de gebruiker gedefinieerde geometrieën. LIMAP vereist dat het cultuur oppervlak wordt gecoat met moleculen die celhechting voorkomen. Polyethyleenglycol (PEG) wordt meestal gebruikt als zodanig een "antifouling" reagens; het vormt een dichte Anti-kleef film op het glas of plastic oppervlak²⁹. Vervolgens wordt een foto-initiator toegevoegd waarmee de PEG-film met hoge precisie kan worden verwijderd door middel van een fotoscissiemechanisme³⁰door lokale blootstelling aan UV-licht onder controle van de DMD. Deze PEG-vrije gebieden kunnen worden gecoat met eiwitten die worden geadsord aan het laser-geëtste oppervlak, waardoor een micro-patroon wordt gegenereerd. Door het variëren van de laser vermogen, kunnen verschillende hoeveelheden PEG worden verwijderd uit het oppervlak waardoor de gebruiker eiwit gradiënten genereren. PEG-verwijdering en de coating procedure kunnen worden herhaald om patronen te creëren met twee of meer verschillende eiwitten in dezelfde micro-put²¹. De gegenereerde micro-patronen bieden lijm oppervlakken voor cellen, waardoor de studie van het gedrag van de cel. In onze studies gebruiken we micropatterning om neuriet of Axon padvinden van een neuronale cellijn te bestuderen (CAD (cathecholaminerge-een gedifferentieerde) cellen³¹) of primaire ganglion (DRG) neuronen van de rat dorsal-wortel. Hier schetsen we een stap-voor-stap protocol voor LIMAP (Figuur 2) met behulp van het in de handel verkrijgbare PRIMO-systeem en de bijbehorende Leonardo-software. We laten zien hoe het kan worden gebruikt voor het genereren van patronen met gedefinieerde geometrieën en meerdere eiwitten, die we gebruiken om axonale pathfinding te bestuderen. We bespreken veelvoorkomende problemen die kunnen ontstaan en hoe deze kunnen worden vermeden.

Protocol

1. ontwerp van patroon Sjablonen

Opmerking: sjablonen voor patronen worden gegenereerd met digitale tekensoftware (tabel met materialen). Het tekenen in verschillende grijze niveaus zal de laser intensiteiten bepalen. Het gebruik van software voor het ontwerpen van patroon sjablonen maakt een snelle aanmaak van patronen mogelijk met elke gewenste geometrie en gradiënten (Figuur 3).

1. De gewenste patroon sjabloon digitaal tekenen met behulp van tekensoftware. Selecteer een afbeeldingsgrootte van 1824 pixels lengte en 1140 pixels breedte (die in deze studie overeenkomt met 415 μm lengte en 260 μm breedte). Sla de patroon sjabloon op als een 8-bits TIFF-bestand.
   Opmerking: een stapsgewijs protocol voor het genereren van templates is beschikbaar op aanvraag bij het merk die de micro-patterning apparatuur (tabel van de materialen) commercialiseert.

2. plasma reiniging

Opmerking: voor optimale resultaten is een plasma reiniging van de oppervlakken vereist voorafgaand aan het patroon, waardoor alle organische stoffen worden verwijderd en het oppervlak wordt geactiveerd. In het onderhavige geval is de omgevingslucht voldoende om de oppervlakte te activeren. Een plasma reiniger (tabel van materialen) werd gebruikt met een proces druk van 1000-1300 mTorr en een vermogen van 29,6 W voor 1-5 min.

1. Gebruik glazen bodem schotel/es met een 20 mm binnenste goed grootte en glasdikte van 0.16-0.19 mm. Voor het testen van meerdere omstandigheden, gebruik een 6-goed glazen bodem schotel. Anders, gebruik maken van een enkele goed glasbodem schotel (tabel van materialen).
   Opmerking: een stap-voor-stap protocol voor plasma reiniging is op aanvraag beschikbaar bij het merk die het plasma reinigingsmiddel commercialiseert (tafel van materialen).

3. passivering

Opmerking: deze stap genereert een antifouling film die eiwit adsorptie aan het glasoppervlak voorkomt. PEG biedt een hoge weerstand tegen eiwit adsorptie²⁹ als antifouling-middel. LIMAP maakt gebruik van een foto-initiator om lokaal te verwijderen PEG via UV photoscission. De eiwitten/s van belang zal vervolgens adsorberen aan deze PEG-vrije oppervlakken²¹, het genereren van micro-patronen.

1. Passivering met PLL-PEG
   1. Snijd onder steriele omstandigheden de PDMS stencils (Zie Figuur 4A, B en Inhoudsopgave) om ervoor te zorgen dat ze in de binnenste glazen bodem goed passen en verwijder de binnenste micro-put vullingen met steriele Tang. Plak stencils op het glas goed met behulp van de Tang.
   2. Zorg ervoor dat de stencils goed op het glas plakken, waardoor de vorming van luchtbellen die lekkages tijdens het passivering kunnen veroorzaken, wordt voorkomen.
      Opmerking: PDMS stencils kunnen ook in eigen huis worden vervaardigd met behulp van gepubliceerde protocollen^18,32.
   3. Bereid PLL-PEG-oplossing (tabel van de materialen, 0,1 mg/ml) in fosfaatgebufferde Saline (PBS). Voeg 20 μL PLL-PEG-oplossing toe aan elke micro-put en incuberen bij kamertemperatuur, gedurende 1 uur.
   4. Verwijder 15 μL PLL-PEG uit de micro putten en was ze vijf keer met 20 μL PBS (Inhoudsopgave) zonder ze te laten drogen.
      Let op: laat altijd ongeveer 5 μL PBS tussen de wast. Gezien hun geringe volume zijn de micro putten bijzonder vatbaar voor droging. Drogen zal resulteren in micro-patronen van slechte kwaliteit.
   5. Houd de kweek schaal in PBS (3 mL per put) bij 4 °C gedurende maximaal 3 dagen of ga verder met de volgende stap (stap 3.1.5).
   6. Verwijder 18 μL PBS uit een enkele micro-put (bijvoorbeeld de micro-put linksboven, Zie Figuur 4D), voeg 5 μl foto-initiator (Plpp, tabel met materialen) toe en laat 20 μl PBS in de resterende micro putten. Deze micro-put met PLPP wordt gebruikt om een referentiepatroon te creëren (Zie Figuur 4D, E) tijdens de systeemkalibratie stap (stap 4). Houd PLPP beschermd tegen licht.
2. Passivering met lange levensduur PEG-SVA
   Opmerking: voor het genereren van de anti-lijm oppervlak kan men gebruiken: 1) een PEG gekoppeld aan poly-L-lysine (PLL-PEG, stap 3,1) of 2) een PEG-succinate N-hydroxisuccinimide (PEG-SVA). De beslissing om een of andere passivering optie te kiezen, hangt af van de opslagopties (zie stap 10). Cultuur gerechten geïnfuseerd met PEG-SVA vereisen dubbele hoeveelheid passivering en foopatterning tijd.
   1. Stencils voorbereiden zoals beschreven in stap 3.1.1.
   2. Voeg 20 μL van 0,01% poly-L-lysine (PLL, tabel van de materialen) toe aan elke micro-put en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot vóór de vacht met PLL.
   3. Verwijder 15 μL PLL uit de micro putten en was deze driemaal met 20 μL HEPES-buffer van 1 M (tabel met materialen) zonder de putjes uit te laten drogen.
      Let op: laat altijd ongeveer 5 μL HEPES of PBS tussen de wast. Gezien hun geringe volume zijn de micro putten bijzonder vatbaar voor droging. Drogen zal resulteren in micro-patronen van slechte kwaliteit.
   4. Bereid PEG-SVA oplossing. PEG-SVA oplossing (50 mg/mL in HEPES buffer 1M) moet vers worden bereid elke keer onmiddellijk voor gebruik. Bereid 20 μL PEG-SVA per micro-well.
   5. HEPES-buffer moet een pH tussen 8-8,5 hebben. Test HEPES pH voorafgaand aan de bereiding van de PEG-SVA-oplossing met pH-papier. Weeg PEG-SVA in een centrifugebuis met behulp van een precisie schaal. Voeg HEPES buffer en Vortex 30 s toe tot het is opgelost. PEG-SVA is volledig opgelost wanneer de oplossing transparant is.
      Opmerking: SVA is de ester die het mogelijk maakt binding van PEG aan de eerder gecoate PLL. Zodra de HEPES buffer wordt toegevoegd aan de PEG-SVA, de SVA heeft een halfwaardetijd van 15 min en moet onmiddellijk worden gebruikt.
   6. Voeg 20 μL PEG-SVA-oplossing toe aan elke micro-put en inincuberen bij kamertemperatuur, gedurende 1 uur. Verwijder 15 μL PEG-SVA uit de micro putjes en was vijf maal met 20 μL PBS (tabel met materialen) zonder de putjes uit te laten drogen.
   7. Bereid de cultuur schotel voor lange termijn opslag (tot 1 maand, zie stap 10,2) of ga verder met de volgende stap (stap 3.2.8).
   8. Verwijder 18 μL PBS uit een enkele micro-put (bijvoorbeeld de micro-put linksboven, Zie Figuur 4D), voeg 5 μl Plpp (tabel met materialen) toe en laat 20 μl PBS in de resterende micro putten. Deze micro-well zal worden gebruikt om een referentiepatroon te creëren (Zie fi gure 4D, E). Zorg ervoor dat PLPP homogeen is op het gehele oppervlak van de micro-well. Houd PLPP beschermd tegen licht.

4. systeemkalibratie

Opmerking: in deze stappen wordt de focus van de laser aangepast aan het specifieke type kweek schotel (stap 4,1). Een referentiepatroon wordt in slechts één micro-put gegenereerd (stap 4,2), gevolgd door incubatie met een eiwit oplossing (stap 4,3) om de optimale scherpstel condities van de laser (stap 4,4) te waarborgen, die nodig zijn om scherpe en gedefinieerde patronen te verkrijgen.

1. Laser kalibratie
   Opmerking: tijdens het kalibratieproces wordt een kalibratie laserbeeld geprojecteerd op een fluorescently gemarkeerd glasoppervlak (goed kalibreren, gemarkeerd met een fluorescerende markeerstift, Figuur 4C), die moet worden Microscoop.
   1. Gebruik een fluorescerende markeerstift (tabel met materialen) om een leeg binnenglas goed te markeren.
      Opmerking: de kalibratie goed moet dezelfde glasdikte hebben (0,16-0.19 mm) als het cultuur gerecht waarop micro patronen worden gegenereerd. Als een 6-goed glasbodem schotel wordt gebruikt, kan een lege put worden gebruikt voor kalibratie en moet worden gemarkeerd met fluorescerende markeerstift onder steriele omstandigheden.
   2. Schakel de Microscoop, het podium en de computer in. Schakel de PRIMO micro-patterning-apparatuur in, open Micro-Manager en Leonardo-software. Leonardo software wordt beheerd via Micro-Manager onder plugins. Controleer de merken/catalogusnummers van de apparatuur en software in de tabel van de materialen.
   3. Selecteer kalibrerenin het eerste menu van Leonardo. Controleer of de speciale PRIMO-filter kubus zich in de juiste positie bevindt (optisch pad) in het filter torentje; Selecteer de 20X Objective (0,75 DIC S plan fluor, geen fasering) zowel op de Microscoop en op Leonardo software.
      Opmerking: dit protocol is aangepast aan Leonardo versie 4,4. Het protocol moet mogelijk worden aangepast voor andere versies.
   4. Plaats de eerder gemarkeerde kalibratie goed (Figuur 4C) boven de doelstelling. Selecteer camerapad. Pas de objectieve scherpstelling aan totdat de laser projectie van zowel het Primo -logo als de taglijn zorg dragen voor uw cellen .
   5. Laat de belichtingstijd van de standaard camera op 25 MS staan. Pas de laserintensiteit aan om de letter I van de Primo -logo projectie in grijze kleur en de rest van de letters in wit te zien.
   6. Noteer de Z-positie van het brandvlak (hoogte van de doelstelling op het monster), later aangeduid als Z-positie van kalibratie. Dit wordt een benadering van de optimale focus verkregen na het genereren van referentie patronen (zie stap 4.2-4.4).
2. Referentiepatroon
   1. Positioneer de kweek schotel met de micro-put met de foto-initiator (referentiepatroon micro-well, Figuur 4D) boven het doel en selecteer nu patroon in de Leonardo-software.
   2. Visualiseer de rand van de micro-put met verzonden licht door de camera en kies het ROI-symbool in het rechter menu. Stel de diameter van de ROI-cirkel in op 4000 μm en lijn de rand van de digitale ROI uit met de rand van de huidige micro-put.
   3. Zorg ervoor dat er een nauwkeurige overlapping is tussen de digitale ROI en de huidige micro-put door de fase rond de randen van de micro-put te verplaatsen. De ROI-positie wordt gekoppeld aan de stage-bewegingen.
   4. Selecteer vergrendelen in Leonardo-software om de ROI in de gewenste positie te vergrendelen. Het uitgezonden licht uitschakelen.
   5. Selecteer Primo om de gewenste patroon sjabloon te uploaden, die wordt geprojecteerd op de ROI als een ontwerp eenheid (Zie afbeelding 5). Patronen worden weergegeven in een vervolgkeuzelijst die acties wordt genoemd en worden weergegeven in het menu acties op de software.
      Opmerking: patroon sjablonen moeten eerder zijn ontworpen (zie stap 1) en worden opgeslagen als een 8-bits TIFF-bestand voordat de sjabloon in de software wordt geladen.
   6. Er is slechts een klein patroon nodig voor het referentiepatroon. bijvoorbeeld 3 lijnen, 1 kolom (Zie Figuur 4E en Figuur 5B). Stel in het menu replicatie het gewenste aantal kolommen en rijen in (regels in Leonardo-software). Klik op vernieuwen om een digitale voorvertoning van het patroon ontwerp te observeren.
   7. Stel de laser dosis in het menu replicatie in. De optimale Laser dosis in deze setting en het gebruik van PLL-PEG is 1390 mJ/mm².
      Opmerking: Laser vermogen kan variëren tussen 5-7,5 mW/mm². In dit geval is het 7,5 mW/mm², wat ongeveer 30 s kost om elke ontwerp eenheid te patroon, met behulp van een laser dosis van 1390 MJ/mm². Hogere Laser doses kunnen nodig zijn als de cultuur schotel oppervlak is gepassiveerde met Peg-SVA (ongeveer dubbele laser dosis in vergelijking met PLL-PEG). Dit moet vooraf worden getest.
   8. Navigeer naar een perifere regio van de micro-put, (bijvoorbeeld, bovenste deel) weg van de belangrijkste regio van belang voor patroon generatie (centrale regio) van de micro-put (Zie Figuur 4E) en selecteer vergrendelen. Wacht tot het patroon wordt weergegeven.
   9. Stel de scherpstelling in op de Z-positie van de kalibratie (zie stap 4.1.6).
      Opmerking: het wordt aanbevolen om een extra systeemkalibratie stap uit te voeren als een andere gebruiker dezelfde Microscoop gebruikt tussen de photopatterning rondes.
   10. Selecteer het afspeel symbool om patronen te starten. Zorg ervoor dat de laser is ingeschakeld in de software. Wacht tot het patroon proces is voltooid. De duur van de patronen wordt weergegeven in het geschatte tijd paneel. Op Leonardo softwareversie 4,4 patronen is voltooid wanneer alle acties blauw worden weergegeven in het menu visualisatie.
3. Eiwit incubatie op referentiepatroon
   1. Was onder steriele omstandigheden het referentiepatroon micro-well driemaal met 20 μL PBS om de PLPP te verwijderen.
   2. Voeg 20 μL fluorescently-gelabeld ECM-eiwit (10 μg/mL laminine, fibronectine of fibrinogeen in PBS, Zie tabel van materialen en stap 6) toe aan het referentiepatroon micro-well. Incuberen bij kamertemperatuur 10-20 min (afhankelijk van het eiwit) beschermd tegen licht (wikkel de schaal in aluminiumfolie).
   3. Na incubatie, 18 μL eiwit oplossing verwijderen en driemaal wassen met 20 μL PBS; Houd de micro putten die niet worden gebruikt voor het maken van een referentiepatroon (Zie Figuur 4D, E) in 20 μL PBS.
4. Visualisatie en het instellen van optimale laser focus
   1. Visualiseer het referentiepatroon met behulp van een epifluorescentie Microscoop, 20X objectief en geschikte software (Controleer de software die wordt gebruikt in deze studie in de tabel van de materialen). Het referentiepatroon moet zichtbaar zijn in de perifere regio (bijvoorbeeld top well Region), waarin het referentiepatroon is gegenereerd (Zie Figuur 4E).
   2. Pas de scherpstelling op de patroon randen aan via het camerapad. Noteer de Z-positie op basis van de beste focus op het referentiepatroon. Deze aangepaste Z-positie wordt de optimale laser focus die wordt gebruikt voor latere patronen.

5. software-opstelling en foto opatterning

Opmerking: zodra de kalibratie van het systeem is bereikt (stap 4), uploadt de gebruiker de gewenste patroon sjablonen (sjabloonconfiguratie, Figuur 5) voor foto opatterning, met de optie om patronen te genereren voor één of meerdere eiwitten in elke Micro-well. Het micropatterning proces omvat de stappen voor fotomopatterning en eiwit incubatie (Zie Figuur 2).

1. Verwijder onder steriele omstandigheden 18 μL PBS uit alle micro putten en voeg 5 μL PLPP aan elke micro-put toe. Zorg ervoor dat PLPP homogeen is op het gehele oppervlak van de micro putten.
2. Plaats de kweek schotel met het referentiepatroon micro-well (Figuur 4D, E) boven de doelstelling en selecteer nu patroon in de Leonardo software.
3. Visualiseer de micro-put met verzonden licht door het camerapad en kies het ROI-symbool. Stel de diameter van de ROI in op 4.000 μm en overlap de rand van de digitale ROI naar de rand van de huidige micro-well. Selecteer vergrendelen.
   Opmerking: de vorm en de diameter van de ROI zijn afhankelijk van het ontwerp en de grootte van het gebruikte PDMS-stencil. Bijvoorbeeld, als u 5.000 x 5.000 μm PDMS kwadraat stencils, gebruikt u een 5.000 x 5.000 μm vierkante ROI.
4. Herhaal de overlappende stap (stap 5,3) voor elke micro-put van het gerecht. Schakel na voltooiing het uitgezonden licht uit.
5. Navigeer naar het midden van het referentiepatroon micro-well, uit de buurt van de referentiepatroon regio, en selecteer Primo om de gewenste patroon sjabloon te uploaden, die zal worden geprojecteerd op de ROI als een ontwerp-eenheid (Zie afbeelding 5). Patronen worden weergegeven in een vervolgkeuzelijst die acties wordt genoemd en worden weergegeven in het menu acties op de software.
   Opmerking: patroon sjablonen moeten voorafgaand aan het experiment worden ontworpen en worden opgeslagen als een 8-bits TIFF-bestand voordat de sjabloon in de software wordt geladen.
6. Om een patroon over de hele micro-well te creëren, moet de ontwerp eenheid worden gerepliceerd. Een ontwerp unit beslaat ongeveer 0,1 mm² van het micro-well-gebied. Stel in het menu replicatie het gewenste aantal kolommen en rijen (lijnen in de software) in (Zie afbeelding 5).
7. Als u een doorlopend patroon wilt genereren, past u de afstand tussen kolommen en lijnen aan. in deze studie, patronen van doorlopende strepen worden verkregen met behulp van-20 tot-35 μm afstand (negatieve afstand) tussen kolommen. Deze negatieve afstand creëert een overlap tussen de ontwerp eenheden (Figuur 5B, C).
8. Stel de laser dosis in het menu replicatie in. De optimale Laser dosis in deze setting en het gebruik van PLL-PEG is 1390 mJ/mm². De patroon duur wordt weergegeven in het geschatte tijd paneel.
   Opmerking: in dit geval is laser vermogen 7,5 mW/mm², waarbij ongeveer 30 s om elk ontwerp eenheid te patroon, met een dosis van 1390 MJ/mm². Bijvoorbeeld, een ontwerp-eenheid (0,1 mm²) gerepliceerd in 4 kolommen en 4 lijnen (rond 1,6 mm²), zou 8 minuten moeten worden patroon. Hogere Laser doses kunnen nodig zijn als de cultuur schotel oppervlak is gepassiveerde met Peg-SVA (ongeveer dubbele laser dosis in vergelijking met PLL-PEG).
9. Selecteer vergrendelen en wacht tot het patroon vrijwel wordt weergegeven.
10. Om de parameters van een patroon bij te werken, klikt u op de gerelateerde actieen ontgrendelt en werkt u de parameters bij. Selecteer opnieuw vergrendelen wanneer de patroon update is voltooid.
11. Het patroon van meerdere eiwitten in dezelfde micro-well (sequentiële micro-patronen rondes) vereist een nauwkeurige uitlijning van de patronen. Om een dergelijke uitlijning te bereiken, uploadt u alle sets van de gewenste patroon Sjablonen tegelijk (patronen van eerste en tweede photopatterning rondes).
12. Stel de replicatie-en dosis parameters van de patroon sjablonen in. Nadat de parameters zijn ingesteld, worden patronen weergegeven als acties in de lijst met acties . Sla deze sjabloonconfiguratie op als een bestand in de software (Zie afbeelding 5D).
13. Selecteer in de lijst acties alleen de specifieke acties die moeten worden Gedessineerd tijdens de eerste patroon ronde en hef de selectie van de acties op die tijdens de tweede patroon ronde moeten worden Gedessineerd (Zie Figuur 5D).
14. Navigeer naar het gebied waar het referentiepatroon is geproduceerd in stap 4,2 (bijvoorbeeld de bovenste regio van het referentiepatroon micro-well, Zie Figuur 4E). Stel de scherpstelling in op de optimale Z-positie (verkregen in stap 4,4).
    Opmerking: het wordt sterk aanbevolen om een perfect focus systeem te selecteren op de gebruikte Microscoop (indien beschikbaar), wat ervoor zorgt dat de optimale Z-positie voor patronen behouden blijft gedurende het gehele fotomopatterning proces.
15. Selecteer het afspeel symbool om patronen te starten. De duur van de patronen wordt weergegeven in het geschatte tijd paneel. Op Leonardo softwareversie 4,4 patronen is voltooid wanneer alle acties blauw worden weergegeven in het menu visualisatie .

6. eiwit incubatie

Opmerking: Micro putten worden geïnfiltreerd met ECM-eiwitten (bij voorkeur fluorescendig gelabeld). Deze zullen alleen binden aan de gebieden waar PEG werd gespleten door het photopatterning-proces zoals beschreven in stap 5. Elke put bevat een PDMS stencil met 4 micro-Wells, die het mogelijk maakt het testen van 4 verschillende omstandigheden tegelijkertijd, bijvoorbeeld, incubatie van een ander eiwit in elke micro-put (Zie Figuur 4D).

1. Gebruik fluorescently-gelabelde eiwitten (bijvoorbeeld laminine, fibronectine of fibrinogeen, geconjugeerd met rode of groene fluophores) om de micro patronen te visualiseren (zie stap 6,7 en 9,4). Als alternatief kunnen geadsorliseerde, niet-gelabelde eiwitten in latere stadia met immunofluorescentie gevisualiseerd worden.
   Opmerking: ECM-eiwitten (bijvoorbeeld fibronectine) kunnen worden gelabeld met behulp van bestaande protocollen³³ en in de handel verkrijgbare fluorescentie etikettensets (d.w.z. Alexa 488 labeling Kit), of gemakkelijk gekocht gelabeld (bijvoorbeeld geconjugeerde fibrinogeen-488 of laminin-rood fluorescerende Rhodamine, Zie tabel van materialen).
2. Bereid onder steriele omstandigheden de gewenste concentratie van ECM-eiwitten (10 μg/mL laminine, fibronectine of fibrinogeen in PBS, Zie tabel met materialen en stap 4,3).
   Opmerking: fluorescently-gelabelde ECM-eiwitten zijn lichtgevoelig en moeten worden beschermd tegen licht (wikkel schotel in aluminiumfolie) en moeten te allen tijde op ijs worden gehouden.
3. Was onder steriele omstandigheden de micro putjes driemaal met 20 μL PBS om de PLPP te verwijderen.
4. Verwijder 18 μL PBS uit alle micro putten en voeg aan elke micro putje 20 μL ECM-eiwit oplossing toe. Incuberen bij kamertemperatuur, voor 20-30 min en beschermen tegen licht.
   Opmerking: de optimale incubatietijd van de coating kan variëren afhankelijk van het type en de concentratie van eiwitten.
5. Verwijder na incubatie 15 μL ECM-eiwit oplossing en was de micro putjes driemaal met 20 μL PBS.
   Let op: laat altijd ongeveer 5 μL PBS tussen de wast.
6. Als het patroon met slechts één eiwit (een ronde van micro-patronen) is, ga dan naar de opslag van de kweek schaal (stap 10) of naar celplating (stap 11, en Zie Figuur 2). Als u een tweede ronde van micro-patronen met een ander eiwit in dezelfde micro-put uitvoert, ga dan naar de opslag van het kweek gerecht (stap 10) of om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren (stap 7, en Zie Figuur 2).
7. Optionele kwaliteitscontrole stap: Visualiseer en beeld gedrukte patronen met behulp van een epifluorescentie Microscoop vóór het plateren van cellen. Selecteer de juiste fluorescentie kanalen en pas de belichtingstijden dienovereenkomstig aan.
   Opmerking: om de intensiteit van de fluorescentie van patronen tussen experimenten te vergelijken, is het essentieel om dezelfde blootstellings tijden te gebruiken voor dezelfde eiwitten.

7. blokkeren van niet-specifieke binding sites (alleen voor meerdere eiwit patronen)

Opmerking: Micro-patronen met meerdere eiwitten in dezelfde micro-well omvat sequentiële patronen stappen (Zie Figuur 2). Een blokkerende agent (PLL-PEG of BSA) wordt toegevoegd aan de micro-Wells om Kruis binding te voorkomen, wat optreedt wanneer het tweede geïnfiltreerd eiwit (stap 9) bindt aan het eerste geïnde eiwit (stap 6), waardoor een mengsel van eiwitten in de patronen wordt vermeden.

1. Voeg onder steriele omstandigheden 20 μL PLL-PEG (0,1 mg/mL in PBS) of BSA (1% BSA in PBS) toe als blokkerende stap om Kruis binding te voorkomen.
   Opmerking: het blokkeren van de efficiëntie kan variëren afhankelijk van de aard van de eiwitten die worden gebruikt en de affiniteit onder hen. Het wordt aanbevolen om zowel PLL-PEG als BSA als blokkerende agentia te testen (Figuur 10D-I).
2. Inincuberen van de Blokkeer middel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en beschermen tegen licht. Verwijder 15 μL blokkerende stof en spoel alle micro putten driemaal met 20 μL PBS. Laat altijd ongeveer 5 μL PBS tussen de wassen.
3. Verwijder 18 μL PBS uit alle micro putten en voeg 5 μL PLPP aan elke micro putje toe, zodat PLPP op het gehele oppervlak van de micro putjes homogeen is.

8. tweede ronde van de foto opatterning (alleen voor meervoudige eiwit patronen)

NB: na de eerste ronde van de fotomopatterning en de eiwit incubatie wordt een micro patroon gegenereerd. Tijdens de tweede ronde van de photopatterning wordt het patroon voor het tweede eiwit gegenereerd in dezelfde micro-put (Zie Figuur 2C en Figuur 5D). Selecteer in de software de juiste patroon sjablonen (acties), die tijdens deze ronde worden Gedessineerd (Zie afbeelding 5D).

1. Navigeer naar de eerste Micro-put (Figuur 4D). Zorgen voor een passende overlapping tussen de digitale ROI en de micro-well.
2. Laad de sjabloonconfiguratie die eerder is opgeslagen (stap 5,12) en selecteer de acties die moeten worden Gedessineerd tijdens de tweede photopatterning Round (schakelacties uit de eerste ronde uit, Zie afbeelding 5D).
3. Selecteer het afspeel symbool om patronen te starten. Zorg ervoor dat de laser is ingeschakeld in de software.

9. tweede ronde van eiwit incubatie (alleen voor meervoudige eiwit patronen)

Opmerking: in dit deel van het protocol wordt na de tweede ronde van de fotomopatterning fluorescently-gelabelde eiwitten/s geïnfiltreerd op de kweek schaal.

1. Was de micro-put driemaal met 20 μL PBS onder steriele omstandigheden om de PLPP te verwijderen. Verwijder 18 μL PBS en voeg aan elke micro-put 20 μL ECM-eiwit oplossing toe. Incuberen bij kamertemperatuur 20-30 min en beschermen tegen licht.
   Opmerking: de optimale incubatietijd van de coating kan variëren afhankelijk van het type en de concentratie van eiwitten.
2. Verwijder na incubatie 15 μL ECM-eiwit oplossing en was de micro putjes driemaal met 20 μL PBS. Laat altijd ongeveer 5 μL PBS tussen de wassen.
3. Ga naar opslag van cultuur schotel (stap 10) of naar celplating (stap 11, en Zie Figuur 2).
4. Optionele kwaliteitscontrole stap: met behulp van een epifluorescentie Microscoop Visualiseer en beeld gedrukte patronen voor het plateren van cellen. Selecteer de juiste fluorescentie kanalen en pas de belichtingstijd aan.
   Opmerking: om de intensiteit van de fluorescentie van patronen tussen experimenten te vergelijken, is het essentieel om dezelfde blootstellings tijden te gebruiken voor dezelfde eiwitten.

10. opslag van micro patronen

Opmerking: Micro-patronen met geadsorpete eiwitten kunnen worden opgeslagen tijdens verschillende stappen van het Protocol (Zie Figuur 2). Als micro-patronen met meerdere eiwitten worden opgeslagen, kunnen er na de eerste Micro-patterning een micro patroon worden bewaard of nadat de twee opeenvolgende rondes van micro-patterning zijn voltooid (Zie Figuur 2B).

1. Bij gepassiveerde met PLL-Peg, bewaar de micro-patronen in PBS (3 ml per put) bij 4 °c gedurende maximaal 3 dagen.
2. Als de cultuur schotel werd gepassiveerde met Peg-SVA, micro-patronen kunnen worden opgeslagen voor maximaal 1 maand. Om dit te doen, spoelen micro patronen intensief af met dubbel gedestilleerd gedeïoniseerd water en drogen met een steriel luchtpistool van argon of stikstof, hoewel normale lucht ook kan worden gebruikt. Na het drogen kunnen micro patronen worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand (PRIMO systeemondersteuningsteam, persoonlijke communicatie).

11. plating cellen

Opmerking: tijdens de volgende stappen worden cellen geplateerd op de bereide micro-patroon kweek schaal/es. In deze studies wordt een neuronale cellijn (CAD-cellen) gebruikt³¹. Dit protocol kan echter worden aangepast om andere soorten cellen te bestuderen (het protocol voor celplating aanpassen zoals vereist).

1. Differentieer CAD-cellen voor 48 h met behulp van differentiatie medium (DMEM aangevuld met 1% glutamine, zonder serum, en met 1% pen/STREP, Zie tabel met materialen).
2. Plaat 1 mL medium met cellen in het binnenglas goed, bedekt alle micro-Wells en plaats de kweek schaal in een incubator van 37 °C, 5% CO₂ .

Resultaten

Naar aanleiding van het bovenstaande protocol resulteert in micro-patroon oppervlakken, bedekt met ECM eiwit/s van belang. We gebruiken deze patronen om neuronale pathfinding te volgen.

Gegenereerde patronen moeten een precieze weergave van de sjabloon. Een voorbeeld wordt weergegeven in Figuur 6 , waarbij een digitale patroon sjabloon (Figuur 6a) die één ontwerp eenheid (Figuur 5B) vertegenwoordigt, resulteerde in gedefinieerde micro patronen, variërend van 20 tot 2 μm breedte, bekleed met gelabelde Fibrinogeen (Figuur 6B). Met imagej werden fluorescentie-intensiteit metingen zowel verticaal (Figuur 6C) als horizontaal (Figuur 6E) langs de streep en vanuit een corresponderend achtergrond gebied 15 μm boven elke streep verkregen. De achtergrond metingen werden afgetrokken van de patroon metingen voor elke streep breedte.

Een beperking van het systeem is dat een randeffect kan worden waargenomen (Figuur 6B, bovenste streep) bij het afdrukken van functies ≥ 20 μm, met een hoger intensiteits signaal bij de patroon randen in vergelijking met het midden (Figuur 6D, eerste piek van fluorescerende intensiteit profiel). In onze experimenten was de resolutie limiet ongeveer 2 μm; op deze breedte hebben we een significante afname waargenomen (met ongeveer 50%) in de intensiteit van fibrinogeen fluorescentie vergeleken met de intensiteit van de bredere strepen (Figuur 6F, G). Patronen met behulp van het PRIMO-systeem en het protocol dat hier wordt geschetst produceerden reproduceerbaar patroon, met de hoogste standaarddeviatie van de gemiddelde fluorescentie intensiteit gemeten voor de 2 μm-breedte van vier afzonderlijke gerepliceerde ontwerp eenheden (Figuur 6 G). variatie binnen de patroon strepen bleek ook laag; de variatiecoëfficiënt varieerde van 3 tot 10%, met een strepen van 20 μm en 2 μm met de grootste inwendige variatie. Dit is waarschijnlijk het gevolg van het Edge-effect en de resolutie limiet van het systeem, respectievelijk. Let op: voor deze metingen hebben we alleen de intensiteit gemeten in het midden van de strepen, om de ongelijke belichting te voorkomen die het gevolg is van het doel dat wordt gebruikt om deze beelden te verwerven (vignettering, Figuur 6E).

Bepaalde experimenten kunnen vragen omvatten die gedefinieerde eiwit concentraties vereisen, die op twee manieren kunnen worden bereikt: 1) variërend van de eiwitconcentratie (Figuur 7A, B). Incubatie met verschillende concentraties van laminine resulteert in significant verschillende fluorescentie intensiteiten, die toenemen met hogere eiwit concentraties (Figuur 7B). 2) de laser dosis die wordt gebruikt voor het klieven van de anti-Kleef film (PEG) kan worden gevarieerd. Hogere Laser doses zullen de antifouling-film in grotere mate verwijderen, waardoor meer bindingsplaatsen worden gegenereerd voor de eiwitten van belang (Figuur 7C, D) resulterend in significant verschillende fluorescentie intensiteiten, met hogere Laser doses (Figuur 7D).

Het variëren van de laser dosis maakt het genereren van eiwit gradiënten binnen hetzelfde patroon mogelijk. Dit wordt weergegeven in afbeelding 8a, waar een verloop sjabloon is ontworpen met verschillende grijswaarden, van zwart (geen Laser stroom) naar wit (maximaal Laser vermogen).

De laser intensiteit is evenredig met het grijstinten-niveau van de sjabloon (variërend van 0 tot 255 in een 8-bits afbeelding), waardoor verlopen van UV-verlichting worden gegenereerd. De meting van het fluorescentie-intensiteits profiel langs de gradiënt streep is lineair in de patroon sjabloon (Figuur 8B) en in het gegenereerde verloop patroon (Figuur 8C, D). Dit is reproduceerbaar onder alle gradiënt strepen binnen dezelfde sjabloon en verloop patroon (Figuur 8B, D). Het genereren van dergelijke hellingen is zeer nuttig en helpt bij het nabootsen in vivo omgevingen waarin cellen vaak reageren op gradiënten van bioactieve eiwitten^34,35,36,37.

Cellen voelen veranderende extracellulaire omgevingen, maar assays die het mogelijk maken van de studie van het gedrag van de cel wanneer cellen dergelijke veranderingen optreden zijn beperkt. LIMAP kan worden gebruikt om micro-patroon met meerdere eiwitten in dezelfde micro-well. Voorbeelden worden weergegeven in Figuur 9 , waar Kruis patronen zijn gegenereerd met strepen van fibronectin (horizontaal) en laminine (verticaal). Bij het maken van patronen met meerdere eiwitten is het cruciaal om een blokkerende stap te gebruiken tussen de eerste en tweede eiwit incubatie, om Kruis binding van eiwitten te voorkomen (zie stap 7). De blokkerende efficiëntie kan variëren afhankelijk van de biochemische eigenschappen van de eiwitten die worden gebruikt voor coating en we adviseren verschillende blokkerende buffers te testen, waaronder PLL-PEG (0,1 mg/mL) en BSA (1%). Om dit Kruis bindende effect te evalueren, voerden we de fluorescentie-intensiteits metingen uit met ImageJ (Figuur 9) en we toonden aan dat cross-binding drastisch kan worden verlaagd, met behulp van PLL-Peg-buffer (0,1 mg/ml) voor fibronectin en laminine Kruis patronen (Figuur 9D, H).

De gegenereerde Kruis patronen werden gebruikt voor cellulaire assays met CAD-cellen (afbeelding 10A, B) of rat dorsal-wortel ganglion (DRG) neuronen (Figuur 10C). Hun neurites (CAD) en axonen (DRG) groeien langs verschillende lijnen. CAD-cellen worden gebruikt als een neuronale model, omdat ze een vergelijkbaar integrine-uitdrukkings profiel vertonen in vergelijking met primaire neuronen en ze nog steeds actin rijke groei kegels vertonen na 48 h in cultuur (Figuur 10B), waardoor ze geschikt zijn voor padvinden Studies.

Om de mogelijke cytotoxische effecten van de gegenereerde micro-patronen naar primaire neuronen te onderzoeken, werden DRG-neuronen geïsoleerd en gekweekt op micro patronen na een eerder gepubliceerd protocol³⁸. De resultaten tonen aan dat primaire neuronen de micro-patronen omgeving tolereren (Figuur 10C). We bestuderen momenteel hoe een verscheidenheid aan ECM-eiwitten axonale (neuriet) pathfinding beïnvloedt. Voorlopig bewijs van concepten gevonden in CAD-cellen zal verder worden onderzocht met behulp van DRG neuronen. Om de kwaliteit van de gegenereerde micro-patronen te valideren, is het wenselijk om beeld patronen door fluorescentiemicroscopie om ervoor te zorgen dat de patroon randen goed gedefinieerd zijn voordat u doorgaat met celplating. Tijdens het beeldvormings proces is het belangrijk om de optische afstelling tussen de Microscoop en de camera te waarborgen om het perifere donkerder effect (vignettering) te vermijden dat de posterieure analyse en interpretatie van gegevens beïnvloedt. Bovendien verkrijgt u een afbeelding van een patroon vrije regio met dezelfde belichtingstijden die worden gebruikt om de patronen te afbeelden en deze afbeelding af te trekken van de patroon afbeelding.

Samengevat, voor het genereren van goede kwaliteit micro-patroon, is het raadzaam om de eiwitconcentratie te beoordelen (Figuur 7A, B), laser doses (Figuur 7C, D), eiwit achtergrondniveaus (Figuur 6E, F, H) en een efficiënte Blokkeer stap (Figuur 9) bij gebruik van meerdere eiwitten. Overtuigend, de kwaliteit van de micro-patronen gegenereerd met LIMAP is essentieel voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbaar gegevens uit cellulaire assays.

Figuur 1: schema van micropatterning technieken: afdrukken met micro contact en lasergeassisteerd patroon. A) afdrukken met micro contact maakt gebruik van een lithografische Master met gedefinieerde micro functies om een PDMS-stempel te genereren die wordt geïnineerd met het eiwit van belang. Dit eiwit wordt vervolgens overgebracht (gestempeld) op een glazen oppervlak, het genereren van eiwit micro-patronen. B) technieken voor laser-geassisteerde patronen zijn onder andere foto opatterning en direct laserpatterning. C) de meeste photopatterning-benaderingen gebruiken een UV-lichtbron en een photomask (hetzij in aanraking met het substraat oppervlak of in het brandvlak van de doelstelling) met de gewenste geometrieën om het Peg-antifouling-oppervlak in specifieke posities te klieven, een gedefinieerd patroon maken. Een daaropvolgende eiwit incubatie stap resulteert in eiwit adsorptie alleen voor de lasergecleaved gebieden. D) limap is een photopatterning-techniek waarvoor geen photomask in contact met het substraat nodig is (d.w.z. een maskless en contactloze benadering). Limap maakt gebruik van een foto-initiator, die wordt geactiveerd door lage doses van een laser, klieft licht blootgestelde gebieden van PEG. Dit creëert bevestigings plaatsen voor sequentiële eiwit adsorptie. (E) direct laserpatterning maakt gebruik van een hoog energie licht om de Peg-film direct te etsen, waardoor eiwitbinding in die geëtste gebieden mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: schema met een samenvatting van de stappen in het micropatterning protocol. A) micro-patronen met één eiwit zijn slechts één ronde micropatterning (foopatterning en eiwit incubatie) en kunnen worden uitgevoerd in minder dan 8 uur.B) micro-patronen met meervoudige eiwitten vereist twee opeenvolgende ronden van Micro-patterning en kan worden voltooid in 1-2 dagen, afhankelijk van het aantal micro-patronen wordt voorbereid. Het is mogelijk om de B-versie van het protocol te doorlopen in 1 dag van het werk. Doorlopende pijlen geven een directe stroom van stappen in het protocol aan. Onderbroken pijlen geven aan dat er een aanzienlijk tijdsverschil is tussen één stap en de andere (zie stap 6,6 en 9,3). C) Schematische weergave van voorbeeldpatronen die zijn verkregen na één ronde van micro patronen (rode strepen) of twee opeenvolgende rondes van micro patronen (rode en groene strepen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: patroon sjabloon generatie is veelzijdig met LIMAP. (a, B) Voorbeelden van patroon sjablonen die zijn ontworpen met ImageJ (een kruisbogen, B-letters). De in het wit getekende vormen werden geprojecteerd op maximaal Laser vermogen en er werden geen vormen getekend in het zwart geprojecteerd. (C, D) Micro-patronen verkregen met LIMAP van sjablonen na incubatie met 10 μg/mL fibrinogeen (groen). (C) kruisbogen zijn 50 μm breedte en 50 μm hoogte, verdeeld door 75 μm horizontaal en 50 μm verticaal. D) de Letters zijn 80 μm breed en 85 μm hoog. Schaal staven in C en D vertegenwoordigt 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: essentiële materialen voor het LIMAP-protocol. A) stencils die worden gebruikt in dit protocol zijn 20 mm diameter, dunne CIRKELVORMIGE PDMS stukken (250 μm dikte) met 4 micro-Wells (elk 4 mm diameter). De in de micro putten gebruikte volumes variëren van 5 tot 20 μL, waardoor de hoeveelheid reagentia en eiwitten die nodig zijn voor elk experiment aanzienlijk wordt verminderd. (B) 6 goed glasbodem schotel waar stencils al in elk goed zijn geplaatst. Micro putten bevatten 20 μL PBS om ze zichtbaar te maken. C) kalibratie schotel waarbij het binnenste glas goed is gemarkeerd met een groene markeerstift, die zal worden gebruikt om de laser focus te kalibreren. (D) Schematische weergave van linksboven goed uit de 6-goed glazen bodem schotel in B (geschetst met onderbroken rode cirkel). De binnenste glazen bodem goed wordt weergegeven in het wit en het stencil wordt weergegeven in het grijs. Het stencil bevat 4 micro-Wells (genummerd 1-4), voor het testen van 4 verschillende experimentele omstandigheden (bv. verschillende eiwit concentraties, patroon geometrieën, combinaties van eiwitten, enz.). Het sterretje vertegenwoordigt de micro-put met het referentiepatroon. E) Schematische weergave van micro-well waar in het bovenste deel een referentiepatroon is gegenereerd (pijl met gevulde pijlpunt). Dit referentiepatroon is vereist om de optimale laser focus voor patronen te verkrijgen (zie stap 4). Pijl met lege pijlpunt geeft het centrale gedeelte van de micro-put aan, dat wordt gebruikt voor latere patronen na systeemkalibratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Afbeelding 5: software-opstelling voor micropatterning. (A) patroon sjabloon met parallelle strepen ontworpen met imagej en opgeslagen als een 8-bits TIFF-bestand. (B-D) Schematische weergave van digitale ROIs (interessegebieden) die zal overlappen met de huidige micro-Wells waar micro-patronen zullen worden gegenereerd. B) de te gebruiken patroon sjabloon (lengte 1824 pixel = 415 μm, breedte 1140 pixel = 260 μm) is geselecteerd op Leonardo en wordt geprojecteerd op de ROI als een ontwerp eenheid (rode strepen in de zwarte onderbroken rechthoek), die ongeveer 0,1 mm² van de Micro-well gebied. De ontwerp eenheid wordt gerepliceerd in 4 kolommen en 4 regels in het menu replicatie (sjabloonconfiguratie), waardoor een patroon ontstaat in de micro-well. Noteer de ruimte tussen de kolommen. C) om doorlopende strepen te patroon, moet de afstand tussen de kolommen worden aangepast. Als u in dit geval een overlapping tussen ontwerp eenheden wilt bereiken, wordt de afstand tussen kolommen ingesteld in het menu replicatie als negatieve afstand,-20 μm.D) om meerdere eiwitten in dezelfde micro-put te verstellen, is een nauwkeurige uitlijning van de patronen Vereist. Upload tijdens de set-up stap van de software (stap 5) alle gewenste patroon Sjablonen tegelijk. Selecteer in de lijst acties alleen de specifieke acties die moeten worden Gedessineerd tijdens elke patroon ronde en hef de selectie van de rest van de acties op (stap 5,12, 5,13 en 8,2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: analyse van patroon variabiliteit met behulp van LIMAP. (A) patroon sjabloon ontworpen met imagej gebruikt om micro-patroon vier strepen van verschillende breedte (20, 10, 5, 2 μm, van boven naar beneden). B) micro patroon verkregen na incubatie met 10 μg/ml fluorescently-gelabeld fibrinogeen (groen). C) intensiteit metingen langs een verticale lijn die de strepen van het micro-patroon overschrijdt. D) het profiel voor de intensiteit van de verticale fluorescentie, verkregen bij meting onder C). Merk op dat bij grotere breedtes (20 μm) er een variatie is in het verticale profiel, veroorzaakt door de accumulatie van eiwitten aan de randen van de streep, wat resulteert in twee verschillende intensiteit pieken in fluorescentie (randeffect). Dit effect is alleen te zien in streep breedtes ≥ 20 μm. (E) intensiteit metingen langs de afgebeelde horizontale lijnen (fluorescentie en achtergrond). F) horizontale fluorescentie profielen, verkregen uit metingen onder E). G) grafiek met de gemiddelde intensiteit voor elke streep breedte, gemeten vanaf vier afzonderlijke gerepliceerde ontwerp eenheden (inter-pattern variatie). Let op de gereduceerde eiwit adsorptie aan patronen met een streep breedte van 2 μm. H) de variatie binnen de patroon strepen (variatiecoëfficiënt) was laag voor alle stripebreedten, variërend van 3 tot 10%. De gegevens in G en H worden weergegeven als gemiddelde ± SD. statistische analyse in G en H werd uitgevoerd met behulp van One-way ANOVA (Kruskal-Wallis) niet-parametrische test met meervoudige vergelijkingen. P waarde is < 0,001 voor * * significantie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: het effect van variaties in laser vermogen en eiwitconcentratie voor de efficiëntie van eiwit adsorptie. A) het oppervlak van de PLL-Peg was lasercleaved met een constante Laser dosis (1390 MJ/mm²) en geïnineerd met de aangegeven concentraties van fluorescently-gelabelde laminine (magenta). B) kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie van de laminine Stripes (a). C) de verschillende aangegeven Laser doses werden toegepast gevolgd door incubatie met dezelfde concentratie (10 μg/ml) fluorescently-gelabelde fibronectine (groen). D) kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie van de fibronectine strepen in (C) waaruit blijkt dat hogere Laser doseringen verband houden met hogere concentraties geadsorbeerde eiwitten. Alle metingen worden op de achtergrond afgetrokken. De voorbeeld nummers worden onder aan de kolommen aangegeven. gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van niet-parametrische Mann-Whitney-test met tweezijdige berekening. P-waarde is < 0,0001 voor * * * * significantie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: genereren van een eiwitconcentratie gradiënt binnen een micro patroon. (A) sjabloon voor verloop patronen in grijstinten. B) het intensiteit Profiel van de fluorescentie, gemeten vanaf a). C) patroon verkregen met limap uit patroon sjabloon in (a) na incubatie met 10 μg/ml fluorescently-gelabelde fibronectine (groen). D) fluorescentie-intensiteit Profiel van n = 3 strepen en achtergrond, weergegeven als gemiddelde ± SEM, met de lineaire toename van de intensiteit van de eiwit gradiënt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 9: het Kruis bindende effect wanneer meerdere eiwitten opeenvolgend worden patronen. (a-C, E-G) Kruis patronen met 10 μm strepen van fluorescently-gelabelde fibronectine (cyaan, horizontaal) en fluorescently-gelabeld laminine (magenta, verticaal). (a-C) Met BSA-blokkerende buffer behandelde monsters. (E-F) Met PLL-PEG behandelde monsters voor het blokkeren van niet-specifieke bindingsplaatsen (stap 7). (A, E) Samengevoegde fluorescentie kanalen die zowel fibronectin als laminine tonen. (B, F) Afbeelding die alleen fibronectin weergeeft. (C, G) Afbeelding die alleen laminine weergeeft. Voor C, Let op de aanwezigheid van laminine ook op horizontale fibronectin positieve strepen die te wijten is aan de ineffectieve blokkering van onbezette binding sites met BSA. Voor G, merk op dat blokkering met PLL-PEG voorkomt efficiënte binding van laminine aan de fibronectin strepen. (D, H) Fluorescentie-intensiteit profielen verkregen uit aangegeven metingen (diagonale gele lijn) in respectievelijk A en E. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 10: Kruis patronen om te onderzoeken van neuriet/axon pathfinding. (a-C) Kruis patronen met 10 μm strepen van fluorescently-gelabelde fibronectine (cyaan, horizontaal) en fluorescently-gelabeld laminine (magenta, verticaal). (a, B) Fluorescerende beelden van CAD-cellen met neurites groeien langs de micro-patronen. Om neurites te visualiseren, cellen werden gekweekt voor 48 h, vastgesteld met 4% PFA en gekleurd voor tubuline (A) of tubuline en actine (B). (C) Rat dorsal-wortel ganglion (DRG) neuronen met axonen groeien langs de micro-patronen. Om axonen te visualiseren, DRG neuronen werden gekweekt voor 72 h, vast met 4% PFA en gekleurd voor tubulin. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 11: voorbeelden van gemeenschappelijke negatieve resultaten bij het genereren van micro patronen met LIMAP. (a-C) Sub-optimale patroon strepen van 10 μg/mL fluorescently-gelabeld fibrinogeen (groen) verkregen onder verschillende omstandigheden. A) de micro-put gedroogd tijdens het genereren van het patroon. Let op de hoge fluorescentie niveaus op de achtergrond (pijl) en de aanwezigheid van PBS-kristallen (asterisken). B) het stiksel tussen de strepen werd tijdens de opzet van de software niet goed afgesteld, wat resulteerde in discontinu strepen met openingen (pijl) tussen ontwerp eenheden (zie stap 3.4.7). (C) de laser focus was suboptimaal waardoor diffuus strepen (pijlen) die niet de werkelijke streep breedten van de patroon sjabloon vertegenwoordigen, die 20, 10, 5, 2 μm van boven naar beneden moeten zijn, zoals in (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

LIMAP (PRIMO) voordelen voor micro patronen en vergelijking met micro contactafdrukken
Terwijl microcontact afdrukken misschien wel de meest gebruikte micro-patterning techniek is in het biologische veld³⁹, lijkt er een toenemend aantal onderzoekers te zijn met behulp van limap Technology^{40,41,42 ,43,44}. Hier presenteerden we een protocol met behulp van PRIMO, een commercieel beschikbaar systeem voor LIMAP. Hieronder bespreken we kort mogelijke voordelen en beperkingen van microcontact afdrukken en LIMAP foto-patterning.

Micro contactafdrukken vereist lithografische meesters geproduceerd door spin-coating een foto-masker (over het algemeen SU-8) op een glas of silicium wafer, die vervolgens Laser-geëtst met de gewenste micro-functies. Deze Masters worden gebruikt als sjablonen voor het maken van een PDMS stempel⁴⁵. Het stempel wordt geïnfiltreerd met een gekozen eiwit dat er aan adsorbeerd, en vervolgens wordt overgebracht (gestempeld) op de celkweek schaal. Het adsorptieproces van het eiwit aan de PDMS-stempel is afhankelijk van de eiwitconcentratie, de buffer en de incubatietijd. Deze parameters moeten vooraf worden getest voor optimale resultaten⁴⁶.

Masters kunnen worden gebruikt in een aanzienlijk aantal experimenten, die maanden of zelfs jarenlang duren, indien correct bewaard. Een beperkende factor van deze technologie is echter de noodzaak om nieuwe gelithografeerde Masters opnieuw te ontwerpen voor elke gewenste modificatie. Veranderingen in experimentele ontwerpen kunnen resulteren in een tijdrovende productie van nieuwe meesters (tot enkele weken), waardoor experimenten worden vertraagd. Ter vergelijking, LIMAP photopatterning vereist geen fysieke meester; het maakt gebruik van softwaregegenereerde patroon sjablonen die kunnen worden gebruikt om de gewenste geometrieën van micro patronen flexibel aan te passen aan veranderende onderzoeksvragen. LIMAP kan ook worden gebruikt voor het genereren van eiwit gradiënten binnen hetzelfde micro patroon (Figuur 8), wat moeilijker te verkrijgen is op een reproduceerbare manier met behulp van micro contactafdrukken⁴⁷.

Bovendien is de micro-patroon resolutie bereikt met LIMAP, in ons geval, 2 μm (Figuur 6B).

Het naderen van deze resolutie verhoogde intra-en inter-patroon variabiliteit. Het genereren van patronen rond of boven 10 μm breedte was zeer reproduceerbaar (Figuur 6G, H). Integendeel, met micro contactafdrukken is het moeilijk om consequent resoluties onder 10 μm te verkrijgen en het is gebruikelijk om artefacten te vinden bij het stampen van kleine functies (gegevens worden niet weergegeven).

We hebben aangetoond dat LIMAP kan worden gebruikt om micro-patroon meerdere eiwitten (Figuur 9) binnen dezelfde micro-put, waardoor verdere niveaus van complexiteit toe te voegen aan experimenten. Hoewel dit kan worden bereikt met het afdrukken van micro contact, kan het uitlijnen van verschillende eiwitten met een hoge mate van precisie technisch nogal veeleisend zijn. Terwijl het patroon van meerdere eiwitten met LIMAP ongecompliceerd lijkt, is het belangrijk om te vermelden dat cross-binding van eiwitten via sequentiële coating procedures kan worden verminderd door het blokkeren van reagentia, maar niet volledig geëlimineerd (Figuur 9).

Met betrekking tot de kosten van een of andere techniek vereist LIMAP zoals hier beschreven de aanschaf van micro-patterning Equipment (PRIMO) die op verschillende fluorescentie microscopen kan worden geïnstalleerd en een gemotoriseerde fase vereist. Hoewel deze investering in eerste instantie kostenintensief is, zijn er geen extra aankopen anders dan verbruiksartikelen (stencils, PEG en PLPP) op de lange termijn die is gekoppeld aan LIMAP. Als alternatief kunnen de PDMS stencils ook worden geproduceerd in het lab door de eigen experiteerder na gepubliceerde protocollen^18,32. De grootste kosten voor het afdrukken van micro contact kunnen worden geassocieerd met de productie van nieuwe meesters, die aanzienlijk kunnen worden als experimenten nieuwe patronen vereisen.

Een nadeel van LIMAP is de relatief lage doorvoer benadering van deze techniek. Micro contactafdrukken kan snel en efficiënt een groot aantal micro patronen produceren in een gelijktijdige stempelen stap, in vergelijking met de vereiste sequentiële Laser micro-patterning met LIMAP. Bijvoorbeeld, het is mogelijk om te produceren 6 gestempelde glazen dekstroken in ongeveer 2 h met micro contactafdrukken met behulp van PDMS stempels (met uitzondering van stempel voorbereiding); het patroon van een soortgelijk gebied (6-well Dish) met LIMAP zou ongeveer 4 uur duren, met uitzondering van de procedure van de oppervlakte passivering (gezien de template configuratie beschreven in stap 5,12 en Zie Figuur 5B).

Een andere snelheids beperkende factor van LIMAP-technologie is de lange verlichtingstijd die nodig is voor het patroon van grote gebieden (30 s per ontwerp eenheid met een 7,5 mW/mm² -laser). In deze gevallen kan het afdrukken van micro contact een voorkeursoptie zijn. Een nieuw beschikbare foto-initiator (PLPP-gel, tabel van materialen) moet de tijd voor het patroon aanzienlijk verkorten, waardoor het genereren van honderden micro-patronen in grote gebieden (tot 8 mm²) in slechts een paar minuten.

Een andere belangrijke factor waarmee rekening moet worden gehouden wanneer micro patronen voor celkweek worden gereproduceerd, is de reproduceerbaarheid van het micro-patroon tussen verschillende experimentele herhalingen, in vergelijking met de variabiliteit die wordt verkregen bij het afdrukken van micro contact. De grafieken in Figuur 7B, D zijn bijvoorbeeld representatieve gegevens van drie onafhankelijke experimentele herhalingen met zeer vergelijkbare resultaten (gegevens worden niet weergegeven). Op basis van onze ervaring en eerdere publicaties is dit niveau van reproduceerbaarheid moeilijk te bereiken met micro contactafdrukken^{48,49,50,51,52}.

In tegenstelling tot andere foto-patterning technieken die een speciale chemie nodig hebben om fotogevoelige materialen te engineeren of het gebruik van foto-sensibilisatoren, die over het algemeen niet erg biocompatibel³zijn, is de lichtgevoelige component van limap (plpp ) is biocompatibel en goed verdragen door de cellen²¹; in onze handen hebben we geen cytotoxiciteit ervaren in een verscheidenheid van cellen, waaronder CAD, DRG neuronen (Figuur 10), fibroblasten, epitheliale cellen en melanoom cellen (gegevens niet weergegeven). Een ander voordeel van LIMAP met behulp van PRIMO in vergelijking met andere foto-patterning technieken is dat er geen photomask vereist is. Net als bij het afdrukken van micro contact, moet nieuwe photomvragen worden ontworpen en gegenereerd voor elk gewenst patroon.

Alle bovengenoemde beperkingen voor het afdrukken van micro contact, verwijzen naar de handmatige aanpak van de techniek. Het is echter mogelijk om de doorvoer en de reproduceerbaarheid van micro contactafdrukken te verbeteren met behulp van een geautomatiseerd apparaat met stempel belasting en drukregeling⁵³.

Belangrijke stappen van het protocol en problemen oplossen voor LIMAP met behulp van PRIMO
Een van de meest voorkomende problemen tijdens dit protocol is het hebben van hoge niveaus van achtergrond fluorescentie binnen de micro-patronen. Dit kan te wijten zijn aan het drogen van micro-Wells die vaak optreedt als gevolg van hun kleine volume. Als dit gebeurt, verschijnen er vaak PBS-kristallen rond de ECM-patronen (Figuur 11A).

Onvoldoende of inefficiënte wasstappen na eiwit incubatie kunnen ook resulteren in een hoge mate van achtergrond fluorescentie. Dit kan met name worden waargenomen bij het gebruik van eiwit concentraties van 10 μg/mL (Figuur 11B) of hoger. Het teveel aan eiwitten op de achtergrond kan worden verminderd door extra wasstappen met PBS.

De aanwezigheid van een eiwit achtergrond moet in elk experiment worden gemeten en gekarakteriseerd, waarbij de intensiteit van de achtergrond fluorescentie (Figuur 6E) wordt berekend en afgetrokken van de intensiteit van de micro-patronen (Figuur 6F-H en Figuur 7B, D). Hoge eiwit achtergrond kan een impact hebben in de gehechtheid en ontkiemen van CAD-cellen, afbreuk te doen aan de interpretatie van de resultaten.

Het hebben van gaten tussen ontwerp eenheden is een veelvoorkomend probleem wanneer gebruikers beperkte ervaring hebben (Figuur 11B), wat optreedt als gevolg van onvoldoende overlap tussen patronen. Twee parameters in de Leonardo software kunnen worden aangepast om dit te overwinnen: 1) een negatieve afstand tussen kolommen kan nodig zijn, afhankelijk van het ontwerp van het patroon (stap 5,7 en Zie afbeelding 5B, C). Als alternatief 2) gebruik de optie verloop in het menu expert om de kolommen te steken. Een snelle test om de optimale afstand parameters te bepalen kan worden uitgevoerd met UV-lijm (tafel van materialen). Een kleine druppel van deze lijm wordt aangebracht op een glazen glijbaan, die vervolgens wordt bedekt met een glazen dekglaasje, maken van een film. De ingesloten UV-lijm is photopatterned met de patroon sjabloon van belang met behulp van een lage Laser dosis (30 mJ/mm²). De UV-blootgestelde gebieden van de ingebedde lijm zullen worden genezen, zichtbaar onder helder-veld microscopie. De testresultaten worden gevisualiseerd om de verkregen afstand binnen het patroon te evalueren. In onze neuronale experimenten, een gat tussen strepen kan nadelige invloed hebben op het gedrag van de cel, produceren variaties in de groeidynamiek (hetzij verminderde snelheid of het verlaten van het pad).

In de nieuwste update van Leonardo-software (op het moment van publicatie, Leonardo 4,11), is het mogelijk om eerder ontworpen grotere patroon sjablonen te uploaden die een veel groter gebied beslaan (tot 8 mm² met behulp van de 20x-doelstelling) van het micro-well-oppervlak vergeleken met de huidige 0,1 mm² per ontwerp unit, waardoor de kleinere ontwerp units niet meer hoeven te worden samengevoegd. Ongedefinieerde randen kunnen het gevolg zijn van een gebrek aan aanpassing van de laser focus tijdens het genereren van patronen (Figuur 11C). Het is daarom van cruciaal belang om de laser te kalibreren en referentiepatroon stappen uit te voeren (zie stap 4) voorafgaand aan patterning. Slecht gedefinieerde strepen resulteren in variaties in streep breedte, waardoor de correlatie tussen axon groeidynamiek en streep breedte moeilijk. Axonen hebben ook de neiging om strepen te verlaten die verstrooit randen hebben. Bovendien kan variabiliteit in randen ook worden gevonden bij het afdrukken van strepen van 10-20 μm breedte of hoger, resulterend in een hoger eiwitgehalte aan de randen in vergelijking met de centrale gebieden van het patroon (Figuur 6B, D). Dit randeffect wordt geproduceerd door een niet-homogene diffusie van de foto-initiator tijdens het photopatterning-proces. De fotoscissie-reactie is zuurstof afhankelijk, die meer aan de randen verspreidt. Dit randeffect kan worden geminimaliseerd door de foto-initiator te homogeniseren met een pipet in de micro-put tijdens het photopatterning-proces. Bovendien, een nieuwe gecommercialiseerde foto-initiator (PLPP gel), kan ook het effect van de rand te verminderen (PRIMO System Support team, persoonlijke communicatie).

Micro-Printing van meer dan één eiwit kan leiden tot kruis binding (Figuur 9A-D). Dit kan worden geminimaliseerd door de blokkerende efficiëntie te verhogen die wordt gebruikt om niet-specifieke bindings locaties te bezetten tussen de incubatie stappen voor de twee verschillende eiwitten. Cross-binding van eiwitten kan de reproduceerbaarheid van experimentele uitkomsten perturb en kan leiden tot een verkeerde interpretatie van gegevens, omdat het moeilijk is om de bijdrage van elk eiwit aan axon groeidynamiek en andere celgedragingen te bepalen.

Conclusie
We hopen dat het meegeleverde protocol met behulp van LIMAP het genereren van eiwit micro-patronen vergemakkelijkt door het gebruik van het PRIMO-systeem. Hoewel ons Protocol zich richt op het betrouwbaar produceren van micro patronen in 2D-glasoppervlakken, hebben anderen aangetoond dat het mogelijk is om LIMAP te gebruiken voor micro-patterning van zachte ondergronden⁵⁴en micro gestructureerde oppervlakken voor 3D-culturen⁴². Deze micro patronen kunnen een veelzijdig hulpmiddel zijn om cellulaire reacties te bestuderen op veranderingen in hun micro-omgeving.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alexa 488 protein labeling kit	Invitrogen	A10235	Werkconcentratie: N.V.T.
Alexa 647 protein labeling kit	Invitrogen	A20173	Werkconcentratie: N.V.T.
CAD cellen	ECACC	8100805	Werkconcentratie: N.V.T.
Geconjugeerd fibrinogeen-488	Molecular Probes	F13191	Werkconcentratie: 10 μg/ml
DMEM kweekmedium	Gibco	11320033	Werkconcentratie: N.V.T.
Epifluorescente microscoop**	Nikon	Eclipse Ti inverted	Werkconcentratie: N.V.T.
Fibronectine	Sigma	F4759	Werkconcentratie: 10 μg/ml (na labelen met Alexa 488 protein labeling kit, zie hierboven) (verdund in PBS)
Fiji-Image J	www.imagej.nih.gov	Versie 2.0.0-rc-54/1.51f	Werkconcentratie: N.V.T.
Fluorescente marker	Stabilo	Stabilo Boss Original	Werkconcentratie: N.V.T.
HEPES	Gibco	15630080	Werkconcentratie: 1M
Inkscape software	Inkscape	Controleer laatste update	Werkconcentratie: N.V.T.
Laminine-rode fluorescente rhodamine	Cytoskeleton, Inc.	LMN01	Werkconcentratie: 10 μg/ml (verdund in PBS)
Leonardo software	Alvéole	versie 4.11	Werkconcentratie: N.V.T.
L-Glutamine	Sigma	G7513	Werkconcentratie: 1%
Micro-manager software	Open imaging	Controleer laatste update	Werkconcentratie: N.V.T.
Gemotoriseerde x/y stage	PRIOR Scientific	Proscan II	Werkconcentratie: N.V.T.
NIS Elements Software	Nikon	NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (Met Nikon jobs)	Werkconcentratie: N.V.T.
PBS (zonder Ca2+, Mg2+)	Sigma	D8537	Werkconcentratie: 1X
PDMS stencils	Alvéole	bezoek www.alveolelab.com	Werkconcentratie: N.V.T.
PEG-SVA	Laysan bio, Inc.	MPEG-SVA-5000-1g	Werkconcentratie: 50 mg/ml
Phalloidin 405	Abcam	ab176752	Werkconcentratie: 1:1000
Foto-initiator (PLPP)	Alvéole	Classic PLPP	Werkconcentratie: 14.5 mg/ml
Foto-initiator (PLPP gel)	Alvéole	PLPP gel	Werkconcentratie: 4.76% verdund in ethanol
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)	Werkconcentratie: N.V.T.
PLL-PEG	SuSoS (ook gedistribueerd door Alvéole)	www.alveolelab.com	Werkconcentratie: 0.1 mg/ml (verdund in PBS)
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	Werkconcentratie: 0.01%
Primo apparatuur	Alvéole	www.alveolelab.com	Werkconcentratie: N.V.T.
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Werkconcentratie: 1%
Tubuline anti-alpha antilichaam	Abcam	DM1A	Werkconcentratie: 1:1000 CAD cellen
Tubuline anti-beta 3 antilichaam	Sigma	T8660	Werkconcentratie: 1:500 DRG neuronen
UV lijm	Norland Products	NOA81	Werkconcentratie: N.V.T.
1 well glazen bodem schaal	Cellvis	D35-20-1.5-N	Werkconcentratie: N.V.T.
6 well glazen bodem schaal	Cellvis	P06-20-1.5-N	Werkconcentratie: N.V.T.
20x objectief**	Nikon	geen fase ring (controleer bijgewerkte catalogus)	Werkconcentratie: N.V.T. **Epifluorescente microscoop: beelden werden verkregen en patronen werden gegenereerd op een Eclipse Ti inverted microscoop (Nikon), gekoppeld aan PRIMO micro-patterning apparatuur (Alvéole), met behulp van een 20x objectief (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon-specifieke filtersets voor GFP, mCherry en Cy5 werden gebruikt en de fluorescente lichtbron was LED (Lumencor) hoewel andere fluoresceringsbronnen en filtersets kunnen worden gebruikt. De microscoop heeft een geautomatiseerde x/y stage (PRIOR Scientific) voor het afdrukken van multi-veld patroonvorming en Nikon Perfect Focus om focusdrift te voorkomen. De beelden werden verzameld met behulp van een Retiga R6 (Q-Imaging) camera.