Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Summary

Dit protocol demonstreert de inductie van een hemogeen programma in menselijke dermale fibroblasten door afgedwongen expressie van de transcriptiefactoren GATA2, GFI1B en FOS om hematopoietische stam en voorlopercellen te genereren.

Abstract

Het cellulaire en moleculaire mechanismen onderliggende specificatie van menselijke hematopoietische stamcellen (HSCs) blijven ongrijpbaar. Strategieën om menselijke HSC-opkomst in vitro te recapituleren zijn nodig om beperkingen te overwinnen bij het bestuderen van dit complexe ontwikkelingsproces. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van hematopoëtische stam en voorlopercellen van menselijke dermale fibroblasten die een directe celherprogrammatie benadering hanteren. Deze cellen doorvoer door middel van een hemogenic tussenliggende cel-type, die lijkt op de endothelial-to-hematopoietische overgang (EHT) kenmerk van HSC specificatie. Fibroblasten werden geherprogrammeerd naar hemogene cellen via transductie met GATA2, GFI1B en FOS transcriptiefactoren. Deze combinatie van drie factoren geïnduceerde morfologische veranderingen, expressie van hemogene en hematopoietische markers en dynamische EHT transcriptionele Programma's. Geherprogrammeerde cellen genereren hematopoietische nakomelingen en herbevolken immunodeficiënte muizen voor drie maanden. Dit protocol kan worden aangepast aan de mechanistische dissectie van het Human EHT-proces, zoals hier geïllustreerd door het definiëren van GATA2 targets tijdens de vroege fases van herprogrammering. Dus, menselijke hemogene herprogrammering biedt een eenvoudige en Tractable aanpak voor het identificeren van nieuwe markers en regulatoren van menselijke HSC opkomst. In de toekomst, getrouwe inductie van hemogene lot in fibroblasten kan leiden tot de generatie van patiënt-specifieke HSCs voor transplantatie.

Introduction

Definitieve hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) ontstaan in de aorta-gonad-mesonephros (AGM)-regio en de placenta van endotheliale precursoren met hemogene capaciteit, via een endotheliale-naar-hematopoietische overgang (EHT)^{1, 2}. Hemogene precursoren (Hp's) Express zowel endotheliale en hematopoietische markers, maar hun precieze identificatie blijft ongrijpbaar, met name in het menselijk systeem. Ondanks het feit dat een relatief gecondengeerde proces bij zoogdieren, hematopoietische stamcel (HSC) ontwikkeling nog steeds verschilt significant tussen mens en Muismodellen^3,4. Daarom zijn in vitro benaderingen voor het recapituleren van menselijke HSC-ontwikkeling nodig.

Differentiatie van pluripotente stamcellen (PSCs) naar HSCs, hoewel veelbelovend, heeft de afgelopen 20 jaar beperkt succes behaald, voornamelijk als gevolg van de beschikbare differentiatie protocollen, die resulteren in primitieve hematopoietische voor ouders met een slechte engraftment vaardigheid^5,6,7. Als alternatief zijn direct-celherprogrammeeringsmethoden toegepast om hspc-achtige cellen te genereren uit meerdere celtypen, met behulp van transcriptiefactoren (TFs)^8,9. In het bijzonder, de overexpressie van drie TFs, Gata2, Gfi1b en cFos, omgezet muis embryonale fibroblasten in Hspc's door middel van een HP intermediair met een gedefinieerde fenotype (Prom1 + SCA-1 + CD34 + CD45-)¹⁰. Dit proces leek op de EHT die optreedt in het embryo en de placenta, tijdens de specificatie van de definitieve hematopoiese. Dit fenotype kon de identificatie en isolatie van een populatie van hp's in de placenta van de muis die na korte termijn cultuur en notch Activering gegenereerd serie transplanteer bare hscs¹¹.

Tot nu toe is er geen fenotype vastgesteld dat menselijke HSCs onderscheidt van hun precursoren, maar sommige moleculen zijn bekend dat ze worden uitgedrukt in opkomende HSCs. integrine alpha 6 (ITGA6 of CD49f) is sterk uitgedrukt in lange termijn herbevolkende HSCs, de meest onrijpe cellen in het HSC compartiment¹²en angiotensine converting ENZYM (ACE of CD143) is aanwezig in CD34 negatieve hematopoietische precursoren in embryonale bloedvormende weefsels¹³.

Onlangs hebben we aangetoond dat menselijke versies van de drie TFs, GATA2, FOS en GFI1B herprogrammeren humane dermale fibroblasten (Hdf's) in Hp's met kortdurende engraftment capaciteit¹⁴. In de beginfase van herprogrammering houdt GATA2 zich bezig met open chromatine en rekruteren GFI1B en FOS om fibroblast-genen te onderdrukken en endotheliale en hematopoietische genen te activeren. Geïnduceerde cellen sterk uitgedrukt CD49f en ACE, en bevatte een klein percentage van cellen uitdrukken van de HSPC marker CD34. Het CD9-gen, dat wordt uitgedrukt in HSCs¹⁵ en belangrijk is voor HSC homing¹⁶, bleek een direct doelwit te zijn van GATA2 en van de meest up-gereguleerde genen in geherprogrammeerde cellen¹⁴. CD9 kan daarom een extra marker vormen voor Hp's van menselijk definitief hematopoiese.

In dit protocol beschrijven we de generatie van hspc-achtige cellen van menselijke fibroblasten door middel van afgedwongen expressie van GATA2, GFI1B en Fos, evenals een aangepaste methode voor chromatische immunoprecipitatie (chip)-sequencing (SEQ)-analyse bij het begin van Herprogrammering. TFs werden gecodeerd in een doxycycline (DOX)-inducible linvirale vector (pFUW-tetO) die een tetracycline Response element (TRE) en een minimale CMV promotor bevat, en werden in samenwerking met een constitutieve vector met de omgekeerde tetracycline getransducteerd trans Activator eiwit (pFUW-M2rtTA). Wanneer DOX (analoog van tetracycline) na transductie wordt toegevoegd, bindt het aan het rtTA-eiwit dat samenwerkt met de TRE waardoor TF-transcriptie (tet-on-systeem) mogelijk is. De procedure vereist 25 dagen om te voltooien. Voor ChIP-SEQ-experimenten, HDFs werden getransduceerde met gelabelde versies van GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) en GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), plus pFUW-tetO-FOS en TF binding sites werden geanalyseerd twee dagen na DOX suppletie.

Uiteindelijk biedt hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten een in vitro Tractable systeem om de mechanismen te bestuderen die onderliggende menselijke ontwikkelings hematopoiese en een potentiële bron van patiënt-specifieke Hspc's voor toekomstige klinische toepassing.

Protocol

Dit protocol is uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Comité ethiek van de Universiteit van Lund en moet worden uitgevoerd in overeenstemming met de individuele institutionele richtlijnen.

1. bereiding van het reagens

1. Voor dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM)/20% foetaal runderserum (FBS), meng hoge glucose-DMEM met natrium pyruvaat met 20% FBS, 1% penicillaire-streptomycine (pen/STREP), 1% L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren en 10^-4-M 2- mercapto ethanol.
2. Meng voor volledige DMEM hoge glucose-DMEM met natrium pyruvaat met 10% FBS, 1% pen/STREP en 1% L-glutamine.
3. Voor hematopoietische medium, meng hematopoietische medium (tabel van de materialen) met 10^-6 M hydrocortison en 1% pen/STREP.
4. Gebruik fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium.

2. menselijke huid fibroblast-isolatie

Opmerking: HDFs kan worden aangeschaft bij gecertificeerde leveranciers (tabel met materialen). In dat geval, uit te breiden fibroblasten en gebruik ze direct in herprogrammering experimenten (sectie 4). Als alternatief kunnen Hdf's worden geïsoleerd van donoren. Als fibroblasten geïsoleerd zijn van verschillende donoren, houd dan de monsters van elkaar gescheiden in alle stappen van het protocol. Etiket platen/putten en opvang buizen met het identificatienummer van elke donor.

1. Verkrijg hdfs van 3 mm ronde huid Punch biopsieën uitgevoerd door gekwalificeerde artsen.
2. Coat drie putjes van een weefsel cultuurbehandeld 6-Wells plaat met 500 μL 0,1% gelatine en inincuberen gedurende 20 min bij 37 °C.
3. Aspireren de resterende gelatine oplossing en voeg 750 μL DMEM/20% FBS aan elk goed. Het gehele oppervlak van de put moet worden bedekt met medium.
4. Voeg 1,5 mL DMEM/20% FBS toe aan het binnenoppervlak van een steriel 100 mm Petri schaaldeksel en verdeel de druppel met behulp van een serologische Pipet van 5 mL.
5. Plaats de huid biopsie in het medium op het deksel met gesteriliseerde Tang.
6. Ontleden de huid biopsie in negen identieke delen, met behulp van één gesteriliseerde scalpel om de biopsie op zijn plaats te houden en een tweede scalpel om te snijden.
7. Plaats drie biopsie stukken per put met puntige Tang. Zorg ervoor dat de stukken aan de onderkant van de put hechten.
8. Leg een 22 mm dekslip bovenop de stukken en breng enige druk aan.
9. Incuberen de plaat bij 37 °C, 5% CO₂, voor een week. Controleer de cellen dagelijks en voeg elke 2 dagen 200 μL DMEM/20% FBS toe om het verdampte medium te vervangen.
10. Voeg na één week maximaal 2 mL DMEM/20% FBS toe en vervang medium elke 2 − 3 dagen.
11. Passage cellen bij 1:4 ratio wanneer putten zijn Confluent Health (over 4 − 8 weken).
    1. Bereiden van 0,1% gelatine gecoate weefselcultuur-behandeld 6-well platen.
    2. Aspirate medium uit Wells bij 80% confluentie en was één keer met 1 ml PBS.
    3. Verwijder het afdekplaatje met steriele Tang en plaats de afdekplaat in een nieuwe put van een 6-put, met de weefsel zijde naar boven.
       Opmerking: Cellen die bleven gehecht aan de dekslip zullen ook worden geoogst.
    4. Voeg 500 μL dissociatie oplossing (tabel met materialen) per putje (met inbegrip van putten met de dekstroken) toe en inbroed bij 37 °c, 5% Co₂ voor 5 − 10 min. Controleer wanneer cellen beginnen te stijgen vanaf de bodem van de put en deactiveer de dissociatie oplossing door toevoeging van 500 μL DMEM/20% FBS aan elk goed.
    5. Verzamel fibroblasten uit alle putjes in een conische buis van 15 mL. Voeg extra medium toe aan de putten om de resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer de buis bij 350 x g gedurende 5 minuten.
    6. Voeg intussen 500 μL DMEM/20% FBS toe aan elke put van eerder gelatine gecoate platen.
    7. Aspirate medium en respenderen fibroblasten in 6 mL DMEM/20% FBS.
    8. Voeg 500 μL fibroblast-suspensie toe aan elke put (twee 6-put-platen per monster/donor in totaal). Incuberen cellen 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂.
12. Voeg op de volgende dag 1 mL DMEM/20% FBS toe aan elk goed. Vervang medium met 2 mL DMEM/20% FBS elke 2 − 3 dagen totdat Wells 80% Confluent zijn.
13. Herhaal sectie 2,11 voor drie confluente putten totdat de derde passage is bereikt.
14. Vries fibroblasten uit de confluente putten (passages 1 en 3).
    1. Aspirate medium uit de putjes en was één keer met 1 mL PBS.
    2. Dissociëren en het verzamelen van fibroblasten zoals beschreven in de stappen 2.11.4 en 2.11.5.
    3. Tel cellen met een hemocytometer en centrifugeer de buis bij 350 x g gedurende 5 minuten.
    4. Na centrifugeren, aspiraat medium en respenderen fibroblasten in FBS met 10% DMSO bij een dichtheid van 5 x 10⁵ cellen/ml.
    5. Voeg 1 mL celsuspensie per cryovial toe en vriescellen 's nachts bij-80 °C met behulp van een Vries container. Verplaats flesjes naar-150 °C (vloeibare stikstof) voor langdurige opslag.

3. linvirale productie

1. Kweek HEK293T cellen in een weefsel cultuurbehandelde schaal van 100 mm met 10 mL complete DMEM, bij 37 °C, 5% CO₂, totdat de confluentie is bereikt.
2. Op de dag voorafgaand aan de transfectie, aspiraat medium en was het gerecht zorgvuldig met 5 ml PBS.
3. Voeg na het verwijderen van PBS 1,5 mL dissociatie oplossing toe en inbroed bij 37 °C, 5% CO₂ voor 5 − 10 min om cellen uit de schaal te ontkoppelen.
   Opmerking: Het wordt aanbevolen om zowel PBS als dissociatie oplossing te verwarmen voordat u ze gebruikt, zodat cellen geen thermische schok ondervinden.
4. Inactiveer dissociatie oplossing met 3 mL complete DMEM en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 mL. Was de schaal met 5 mL complete DMEM om overgebleven bijgevoegde cellen te verwijderen en breng dit volume over naar de 15 mL conische buis.
5. Centrifuge celsuspensie bij 350 x g gedurende 5 min.
6. Aspirate supernatant en Splits de celpellet gelijkmatig tussen 6 100 mm weefsel cultuurbehandelde gerechten in een eindvolume van 10 mL volledige DMEM per gerecht. Cellen moeten ongeveer 60% Confluent Health zijn tegen de tijd van transfectie.
7. Op de volgende dag worden cellen met het plasmide mixen als volgt:
   Opmerking: dit deel van het protocol beschrijft de productie van lentivirussen in 1 100 mm weefsel cultuurbehandeld gerecht per plasmide mix. Om hogere volumes linviraal supernatant te verkrijgen voor concentratie, gebruik ten minste 4 100 mm HEK293T celkweek gerechten per mix.
   1. Voeg in een conische buis van 15 mL 10 μg van de drie transferplasmiden samen: 3,33 μg pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plasmide #125028)¹⁴, 3,33 μg Pfuw-TETO-GFI1B (addgene #125597)¹⁴ en 3,33 μg Pfuw-Teto-FOS (addgene #125598)¹⁴, plus 10 μg van de 2^ND generatie psPAX2 verpakking vector coderen de gag, Pol, Tat en rev genen (addgene #12260) en 5 μg PMD2. G envelop vector codering van het VSV-G- gen (addgene #12259). Voeg water toe tot 500 μL.
   2. Voeg in twee nieuwe conische buizen van 15 mL 10 μg FUW-M2rtTA plasmide (Addgene #20342)¹⁷, 10 μg psPAX2 verpakkings vector en 5 μg PMD2. G envelop vector toe aan elke buis. Voeg water toe tot 500 μL. Een buis zal worden gebruikt als een controle.
   3. Voeg aan elke buis 62,5 μL van 2 M CaCl₂toe. Laat vervolgens de bubbels in elk mengsel los met behulp van een Pasteur-pipet dat in een pipet controller wordt gestoken. Pipetteer, terwijl er bellen worden gevormd, 500 μL van n, n-bis(2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfoninezuur (BES) gebufferde zoutoplossing (pH 7,1, 25 °c), met een P1000 Pipet, druppel-Wise tegen het Pasteur-pipet en op het mengsel.
   4. Inbroed buisjes gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur. De mengsels zullen na enige tijd licht bewolkt lijken.
8. Ondertussen, aspiraat medium uit HEK293T celgerechten (doorgangen de dag voordien) en voeg 10 ml volledige DMEM zonder antibiotica. Wees voorzichtig en voeg gemiddeld langzaam toe omdat HEK293T cellen semi-aanhandig zijn.
9. Verdeel elk afzonderlijk mengsel (ongeveer 1 mL) gelijkmatig en drop-wise in afzonderlijke gerechten en inincuberen 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂.
10. Vervang medium door 4 mL complete DMEM, 24 uur na incubatie. Incubate 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂. Indien beschikbaar, inincuberen in plaats van 32 °C, 5% CO₂, omdat de gereduceerde temperatuur de halfwaardetijd van de linvirale deeltjes zal verhogen.
11. Verzamel supernatant met linvirale deeltjes drie keer tot een conische buis van 50 mL. Meng op dit moment niet verschillende linvirale deeltjes. Elk gerecht zal resulteren in 12 mL linviraal supernatant. Vier gerechten van dezelfde virale voorbereiding passen in 1 50 mL conische buis.
    Let op: het uitvoeren van lentivirale inzameling in een bioveiligheid niveau-2 laboratorium in een laminaire stroom afzuigkap gewijd aan linviraal werk en plaats virus verontreinigd afval (tubes, tips, gerechten) in een geschikte container voor biogevaarlijke materialen.
    1. Doe de eerste collectie 16 h na de laatste incubatie en voeg 4 mL complete DMEM toe. Incuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
    2. Doe de tweede verzameling 8 h na de eerste tot dezelfde buis, Voeg 4 mL complete DMEM toe en inincuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
    3. Doe de derde collectie 16 h na de tweede naar dezelfde buis en gooi de gerechten weg.
       Opmerking: Bewaar linviraal supernatanten na elke verzameling bij 4 °c.
12. Filtreer elke linvirale supernatant met behulp van een laag-proteïne binding filter van 0,45 μm met een cellulose acetaat membraan (tafel van de materialen) op een schone buis.
13. Voeg maximaal 15 mL gefilterde supernatant toe aan een centrifugale filtereenheid met een geregenereerd cellulose membraan (tabel met materialen) en spin bij 4.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °c. Doorstroom verwijderen. Een visceuze vloeistof met lentivirussen zal in de filter unit blijven.
14. Herhaal stap 3,13 door 15 mL supernatant bovenop de filtereenheid toe te voegen, totdat er geen lentivirale supernatant meer overblijft.
    Opmerking: Wanneer er slechts een paar milliliter van supernatant te concentreren, de spin tijd te verlagen tot 10 min. Als er nog steeds extra vloeistof (niet-visceus) op het filter zit, centrifugeer dan nog 10 min.
15. Maak aliquots (50 − 200 μL afhankelijk van het initiële supernatans volume) van elk type geconcentreerd linvirussen en bewaar bij-80 °C voor langdurige opslag (1 − 2 jaar) of bij 4 °C voor kortdurende opslag (1 − 2 weken).
    Opmerking: Geconcentreerde of niet-geconcentreerde linvirussen kunnen ook vers worden gebruikt. Niet opnieuw bevriezen en ontdooien omdat dit resulteert in een gereduceerde titer.

4. hemogene herprogrammering

Opmerking: Gebruik HDFs met een passage nummer van drie (P3) of hoger (tot P10) om opnieuw te programmeren experimenten uit te voeren.

1. Mantel een 100 mm weefsel cultuurbehandeld gerecht met 5 mL 0,1% gelatine en inincuberen bij 37 °C gedurende 20 min. aspireren de resterende gelatine oplossing.
2. Ontdooien een fibroblast-injectieflacon en plaat cellen in de 0,1% gelatine gecoate schaal. Incubate 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂. Indien nodig, uit te breiden fibroblasten voor een langere periode van tijd totdat de gewenste passage en confluentie zijn bereikt.
3. Mantel een 6-goed weefselcultuur behandelde plaat met 500 μL van 0,1% gelatine oplossing en inincuberen bij 37 °C gedurende 20 min. Verwijder extra gelatine.
4. Plaat HDFs met een dichtheid van 150.000 cellen per plaat (25.000 cellen per put) in 2 mL van volledige DMEM per put. Incuberen 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂, om celbevestiging toe te staan.
5. Vervang medium door 2 mL complete DMEM plus 8 μg/mL polybrene. Bereid een 1:1 ratio mix van in het zwembad geproduceerde TF lentivirussen en M2rtTA in een nieuwe microcentrifuge buis.
   Opmerking: In dit protocol, pool-productie van lentivirussen voor de drie TFs wordt uitgevoerd, die, in de handen van de auteurs, resulteert in een hogere herprogrammering efficiëntie. Als alternatief wordt voorgesteld om een titratie van de afzonderlijke linvirale deeltjes door qPCR¹⁸uit te voeren op een standaard cellijn. Dit zal worden gebruikt voor het definiëren van het volume van de afzonderlijke virussen die nodig zijn om te voldoen aan een veelheid van infectie (MOI) optimaal voor co-transductie en hemogene herprogrammering.
6. Verdeel 10 tot 100 μL linviraal mengsel per put, om hdfs te bezorgd. Dit is dag-2 van herprogrammering.
   Opmerking: Het bepalen van het optimale volume van lentivirale mix voor efficiënte herprogrammering, zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van de cel, vereist optimalisatie (Zie aanvullende figuur 1 voor meer details). Hdf's met meer dan 7 passages kunnen hogere volumes van virussen vereisen dan cellen met lagere passages.
7. Verwijder na 16 uur incubatie virussen en voeg complete DMEM toe. Laat cellen herstellen voor 6 − 8 uur.
8. Na herstel, aspiraat medium en voeg 2 ml volledige DMEM met 8 μg/ml polybrene.
9. Doe een tweede transductie zoals beschreven in stap 4,6 en incuberen bij 37 °C, 5% CO₂ voor 16 uur. Dit is dag-1 van herprogrammering. De linvirale mix kan op dag 2 worden bereid voor beide transducties en bewaard bij 4 °C.
10. De volgende dag, verwijder de virussen en voeg complete DMEM aangevuld met 1 μg/mL DOX. Dit is dag 0 van herprogrammering. Incuberen bij 37 °C, 5% CO₂ voor 48 h.
11. Op dag 2 van herprogrammering, splitsen elk goed bij 1:2 ratio.
    1. Aspirate medium en Wash cellen met 1 mL PBS.
    2. Laat PBS en dissociëren cellen met 500 μL dissociatie oplossing. Incuberen 5 − 10 min bij 37 °C, 5% CO₂.
    3. Inactiveer de dissociatie oplossing met 1 mL complete DMEM en verzamel cellen in een conische buis. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min.
    4. Resubreng de pellet in hematopoietische medium (zie stap 1,3), aangevuld met 1 μg/mL DOX, en plaat cellen in nieuwe weefselcultuur behandeld 6-well platen gecoat met 0,1% gelatine tot een eindvolume van 2 mL per put.
12. Verander medium (hematopoietische medium plus DOX) tweemaal per week voor de duur van de herprogrammeer culturen (25 dagen).
13. Analyseer resulterende geherprogrammeerde cellen op verschillende tijdstippen door brightfield of fluorescentiemicroscopie (Zie aanvullende figuur 2), Flowcytometrie, bulk-en eencellige RNA-sequencing, en transplantatie-assays voor de verwerving van hematopoietische morfologie, aanwezigheid van endotheliale en hematopoietische markers, overname van endotheliale/hematopoietische genexpressie profiel en regeneratiecapaciteit¹⁴.

5. optimalisatie van fibroblast-expansie voor ChIP-SEQ-analyse bij het begin van Hemogene herprogrammering

1. Plaat 300.000 HDFs (< P8) in 0,1% gelatine gecoate weefselcultuur-behandelde 6-well platen met volledige DMEM tot een laatste volume van 2 mL per put. Incubate 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂.
2. Op de volgende dag, vervang medium met volledige DMEM aangevuld met 8 μg/mL polybrene.
3. Cellen met individuele factoren: pFUW-tetO-FOS¹⁴, PLV-TETO-ha-GFI1B (addgene #125599)¹⁴ en pfuw-Teto-3xflag-GATA2 (addgene #125600)¹⁴ of met een pool van de drie factoren, plus fuw-M2rtTA bij 1:1 ratio. Gebruik 10 − 20 μL totaal virus (individuele TF + M2rtTA of drie TFs + M2rtTA). Incuberen cellen 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂.
   Opmerking: Het wordt aanbevolen om te gebruiken twaalf 6-goed platen per staat (voor elke individuele TF en de drie TFs gecombineerd).
4. Verwijder linvirussen en voeg complete DMEM 16 h toe na de eerste transductie. Laat de cellen herstellen voor 6 − 8 uur.
5. Cellen een tweede keer met dezelfde hoeveelheid virus per aandoening en incuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
6. Op de volgende dag verwijderen virussen en voeg complete DMEM. Incuberen bij 37 °C, 5% CO₂ voor 24 uur.
7. Re-Plate elk goed in een 0,1% gelatine gecoate weefselcultuur behandeld 100 mm schotel met volledige DMEM tot een eindvolume van 10 mL per schotel. Dit vertegenwoordigt ongeveer een 1:6 passage.
8. Laat cellen groeien voor 6 dagen bij 37 °C, 5% CO₂.
9. Op dag 6 na re-plating, aspiraat medium en voeg volledige DMEM met 1 μg/ml Dox. Incuberen cellen bij 37 °C, 5% CO₂ voor 2 dagen.
10. Verzamel fibroblasten en analyseer genomische bindingsplaatsen van de drie TFs getransduceerde afzonderlijk of in combinatie, door ChIP-SEQ 2 dagen na DOX suppletie¹⁴.
    Opmerking: De laatste 72 100 mm-gerechten zullen tussen 20 − 50 x 10⁶ cellen bevatten, voldoende om chip-SEQ-experimenten en-replicaten uit te voeren.

Results

Een schematische weergave van de herprogrammatie benadering met behulp van Hdf's wordt geïllustreerd in Figuur 1A. Fibroblasten worden verworven uit commerciële bronnen of verzameld van menselijke donoren en uitgebreid in vitro voorafgaand aan herprogrammering. Na het beplating worden de cellen tweemaal door elkaar geplaatst met GATA2, GFI1B en FOS (en M2rtTA) linvirussen, en doxycycline wordt toegevoegd op dag 0 van herprogrammering. Op dag 2, cellen worden gesplitst en verguld in hematopoietische medium tot dag 25 van de cultuur. Herprogrammeerde cellen kunnen op verschillende tijdstippen worden gegenereerd voor meerdere toepassingen, waaronder transplantatie in immuungecompromitteerde muizen, eencellige RNA-sequencing (scRNA-SEQ) van gezuiverde celpopulaties (dag 2 ongesorteerd, dag 15 CD49f⁺ CD34 en dag 25 CD49f⁺CD34⁺ cellen), evenals een microscopie en Flowcytometrie analyse voor de celoppervlak markeringen CD49F, CD34, CD9 en CD143. Representatieve cytometrie plots tonen ~ 17% van de geherprogrammeerde cellen die zowel CD49f als CD9 uitdrukken (Figuur 1B, linker paneel), na 25 dagen herprogrammering. De meerderheid van de dubbele positieve cellen Express CD143 (~ 86%), en een kleine populatie Express CD34 (0,9%), suggereren een dynamische hemogene Fate inductie. Deze markers zijn niet geactiveerd in M2rtTA getransduceerde hdfs gekweekt voor 25 dagen (afbeelding 1B, rechter paneel). Immunofluorescentie beelden bevestigen de uitdrukking van CD9 en CD143 in aanhandige en ronde cellen, morfologisch verschillend van fibroblasten die negatief zijn voor deze markers (Figuur 1C). Menselijke hemogene kolonies uiten ook CD49f en CD34¹⁴. ScRNA-SEQ analyse van HDFs, dag 2 ongesorteerde cellen, en gezuiverde geherprogrammeerde cellen op dag 15 (CD49f⁺CD34^-) en dag 25 (CD49f⁺CD34⁺) tonen een stapsgewijze toename van CD49f, CD9 en CD143 expressie van dag 2 tot dag 25. CD49f en CD9 positieve cellen verschijnen eerst tijdens het herprogrammeerproces, tussen dag 2 en 15, wat aangeeft dat deze moleculen markers van vroege menselijke hemogenese kunnen vertegenwoordigen. CD143 expressie begint te worden gedetecteerd op dag 15 en CD34 uitdrukken cellen worden alleen op latere tijdstippen (dag 25) gedetecteerd. CD34⁺ navelstreng bloed (UCB) cellen werden gebruikt als referentie (Figuur 1D).

Figuur 2a beschrijft een gewijzigd protocol voor het genereren van voldoende aantal cellen voor chip-SEQ-analyse in de eerste stadia van hemogene herprogrammering (dag 2). Ten eerste, HDFs worden verguld met een dichtheid twee keer hoger dan in het standaardprotocol (300.000 cellen versus 150.000 cellen per plaat). Na transductie wordt elk goed opnieuw verguld in een 100 mm-schotel waardoor cellen 6 dagen kunnen worden uitgebreid voordat het medium wordt aangevuld met DOX. Cellen worden 2 dagen na het toevoegen van DOX en daaruit voortvloeiende TF-expressie geanalyseerd. Figuur 2B toont GENOOM browser profielen van GATA2 binding aan genomische regelgevende regio's van ITGA6 en ACE wanneer cellen zijn co-Transduced met de drie factoren (3tfs) of GATA2 afzonderlijk. GATA2 bindt ook aan open chromatine gebieden van CD9 en CD34 genen¹⁴.

Figuur 1: inductie van hemogeen lot in menselijke dermale fibroblasten. (A) experimentele strategie voor hemogene herprogrammering van humane dermale fibroblasten (hdf's). Fibroblasten uit huid Punch biopsieën worden verzameld van donoren, uitgebreid en getransduceerde met GATA2, GFI1B, Fos en M2rtTA lentivirussen. Doxycycline (DOX) wordt toegevoegd aan de cultuur op dag 0 van herprogrammering en cellen worden op verschillende tijdstippen tot dag 25 geanalyseerd. scRNA-seq, single cell RNA-sequencing. FACS, fluorescentie-geactiveerde celsortering. B) strategie voor het evalueren van de expressie van hemogene/hematopoietische markers door Flowcytometrie op dag 25 na transductie met de drie transcriptiefactoren (3tfs). Cytometrie plots tonen percentage van dubbele positieve cellen voor CD49f en CD9, afgesloten in de Live-cel populatie (DAPI-negatief). Binnen de dubbele positieve populatie wordt de uitdrukking van CD143 en CD34 getoond. HDFs getransduceerde alleen met M2rtTA virus onder dezelfde cultuur voorwaarden worden gebruikt als controle. C) immunofluorescentie beelden van dag 25 geherprogrammeerde kolonies die de uitdrukking van CD9 (bovenste paneel) en CD143 (onderste paneel) bevestigen. Cellen werden bevlekt met antilichamen (tabel van de materialen) verdund 1:100 in PBS/2% FBS met muis serum, geïnventariseerd 20 min bij 37 °c, 5% Co₂, drie keer gewassen en afbeelding gemaakt in PBS/2% FBS. Fase-gradiënt contrast. Schaal staven = 50 μm. (D) scrna-SEQ analyse van 253 cellen op verschillende tijdstippen. Expressie van ITGA6, CD9, ACE en CD34 wordt geactiveerd tijdens het herprogrammeren. Cellen worden verzameld op dag 2 (ongesorteerd), dag 15 (CD49f⁺CD34^-) en dag 25 (CD49f⁺CD34⁺). HDFs en CD34⁺ navelstreng bloed (34 + UCB) cellen worden gebruikt als verwijzingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: uitbreiding van menselijke dermale fibroblasten voor chip-SEQ-analyse. A) experimentele strategie met een gewijzigd protocol voor het genereren van hoge aantallen getransduceerde humane dermale fibroblasten (hdf's) voor chip-SEQ op dag 2 van herprogrammering. 300.000 cellen worden geplateerd in 6-well platen en tweemaal met individuele factoren (pFUW-tetO-FOS, pLV-tetO-HA-GFI1B of pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) of een combinatie van de drie factoren (plus M2rtTA). Na het verwijderen van virussen, worden fibroblasten gedurende zes dagen uitgebreid in gerechten van 100 mm. Doxycycline (DOX) wordt toegevoegd op dag 0 en cellen worden verzameld twee dagen na DOX toevoeging. (B) genoom browser profielen die GATA2-binding sites (grijze dozen) markeren op ITGA6 en ACE loci twee dagen na transductie met de drie transcriptiefactoren (3tfs) of met GATA2 alleen. Het totale aantal toegewezen leesbewerkingen wordt weergegeven op de y-as. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend figuur 1: het definiëren van een geoptimaliseerd linviraal volume voor efficiënte hemogene herprogrammering. Toenemende hoeveelheden geconcentreerde (10 tot 100 μL) in het zwembad geproduceerde linvirale deeltjes (3TFs: GATA2, GFI1B en FOS) worden gebruikt voor de productie van humane dermale fibroblasten (Hdf's), samen met M2rtTA in een verhouding van 1:1, na stappen 4.5 − 4.12 van het protocol. Geherprogrammeerde cellen worden op dag 25 geanalyseerd om een optimaal volume van transductie voor hemogene herprogrammering te definiëren, gegeven door het percentage van CD49f⁺CD9⁺ cellen die in levende cellen zijn afgesloten (DAPI-negatief). De levensvatbaarheid van de cel kan worden beoordeeld door het absolute aantal levende cellen op dag 25 te kwantificeren. HDFs met M2rtTA (100 μL) worden gebruikt als negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend figuur 2: morfologie veranderingen tijdens hemogene herprogrammering van humane dermale fibroblasten. Humane huid fibroblast (HDF) culturen worden afgebeeld op de dag van de eerste transductie (dag-2), wanneer DOX wordt toegevoegd aan de culturen (dag 0), twee dagen (dag 2) en vijftien dagen (dag 15) na DOX suppletie, en aan het eindpunt van het experiment (dag 25). Hemogene kolonies op dag 15 en 25 worden gemarkeerd. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

In dit artikel wordt een methode beschreven om hematopoietische voorlopercellen rechtstreeks van menselijke fibroblasten te genereren, die door een HP cel intermediair gaan, vergelijkbaar met de definitieve HSCs¹⁴.

Pool-productie van linvirale deeltjes encoding GATA2, GFI1B en FOS had de voorkeur boven individuele productie, omdat het in onze handen resulteert in hogere herprogrammering efficiëntie (niet-gepubliceerde gegevens). Lentivirussen, als leden van de familie Retroviridae , bevatten normaalgesproken twee kopieën van positief enkelvoudig-streng RNA¹⁹. De toegenomen herprogrammering efficiëntie kan te wijten zijn aan de verpakking van twee verschillende transgenen in hetzelfde linvirale deeltje, wat resulteert in een toename van het aantal cellen co-transduced met de drie transcriptiefactoren. Om het succes van dit protocol te garanderen, is het noodzakelijk om Hdf's met een adequate hoeveelheid virus te transteren, afhankelijk van de celpassage, om een optimaal evenwicht te verkrijgen tussen herprogrammering van de efficiëntie en de levensvatbaarheid van de cellen, zoals aanbevolen in stap 4,6. Bovendien kunnen verse, niet-geconcentreerde virussen worden gebruikt. Het wordt aanbevolen om cellen te leiden met 0,5-3 mL 3TFs pool en M2rtTA. Ook moet de celdichtheid worden aangepast volgens de toepassing. 150 000 HDFs per 6-well plaat (stap 4,4) voorzag in de optimale dichtheid voor het uitvoeren van FACS, transplantatie en Flowcytometrie analyse van geherprogrammeerde cellen. Voor ChIP-SEQ-experimenten waren er vanaf het begin meer cellen nodig (stap 5,1). Het is belangrijk om cellen regelmatig te controleren op morfologische veranderingen en hematopoietische medium twee keer per week te vervangen ter ondersteuning van de opkomst van geïnduceerde hematopoietische cellen. Toevoeging van hematopoietische cytokines of co-cultuur in feeder lagen kan herprogrammering efficiëntie verhogen.

Met deze methode kunnen we nieuwe hematopoietische markers identificeren die dynamisch worden uitgedrukt tijdens hemogene herprogrammering. CD9, waarvan werd aangetoond dat het up-gereguleerd is in geherprogrammeerde cellen op het transcriptionele niveau¹⁴, wordt snel uitgedrukt in het celoppervlak in de beginfase van herprogrammering samen met CD49F en CD143, als een nieuwe marker van menselijke HSC-precursoren. We laten ook zien dat ITGA6 en ACE zijn directe targets van GATA2 tijdens de eerste stadia van de hemogene herprogrammering, in aanvulling op CD9 en CD34¹⁴, het verstrekken van een directe mechanistische verbinding tussen menselijke hemogene precursor fenotype en GATA2.

Een voordeel van dit systeem schuilt in het gebruik van relatief homogene fibroblast culturen. Terwijl pscs gemakkelijk worden uitgebreid en in vitrogehandhaafd, differentiatie protocollen genereren heterogene populaties waaronder hematopoietische voorlopercellen, die slecht graveren^5,6,7. Bovendien bestaat er een risico op tumorigenese bij de transplantatie van met PSC afgeleide Hspc's, aangezien ongedifferentieerde Psc's nog steeds in cultuur kunnen blijven, zelfs na gebruik van differentiatie protocollen. Als alternatief voor fibroblasten is directe herprogrammering naar HSCs toegepast op bloed gepleegde voorlopercellen²⁰ en endotheliale cel²¹. Echter, te beginnen met bloed-beperkte progenitorcellen belemmert therapeutische toepassing van de resulterende HSCs als de patiënt mutaties die invloed hebben op de stam/voorloperitor hematopoietische populatie²². In het geval van endotheelcellen zijn deze moeilijker te verkrijgen in vergelijking met fibroblasten en vormen zij een zeer heterogene celpopulatie in termen van fenotype, functie en structuur, die orgaan-afhankelijke²³zijn. Andere studies zijn erin geslaagd om te herprogrammeren muis fibroblasten in engraftable hematopoietische voor ouders^24,25 nog, tot nu toe, geen ander protocol beschrijft de generatie van hspc-achtige cellen van menselijke fibroblasten.

Deze aanpak, in combinatie met farmacologische remming, genknock-out, of knock-down vergunningen voor het definiëren van individuele of combinatie van factoren die nodig zijn voor het rechtstreeks induceren van menselijke HSCs. het toepassen van hoogwaardige screeningsmethoden op basis van recente CRISPR Cas9 technologieën in HDFs voorafgaand aan herprogrammering, vertegenwoordigt een spannend streven naar het definiëren van nieuwe regulatoren van menselijke definitieve hematopoiese. In de toekomst, herprogrammering van niet-bloed gerelateerde menselijke celtypen zoals fibroblasten zal dienen als een platform voor het genereren van gezonde patiënt op maat hematopoietische voorlopercellen voor klinische toepassingen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter	Corning	#430625
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	#M6250
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581	BioLegend	#343518
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9	BD Biosciences	#557929
BES buffered saline	Sigma-Aldrich	#14280
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	#449709
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Sigma-Aldrich	#UFC903096
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1x) no phenol red	Gibco	#12604-021
Doxycycline hyclate (DOX)	Sigma-Aldrich	#D9891
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7	Invitrogen	#25-0495-82
FUW-M2rtTA	Addgene	#20342
Gelatin from Porcine Skin Type A	Sigma-Aldrich	#G1890
Gibco L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	#25030-024
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	ThermoFisher Scientific	#11140-035
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100	STEMCELL Technologies	#05150
Hexadimethrine bromide (polybrene)	Sigma-Aldrich	#H9268
Human Dermal Fibroblasts (HDFs)	ScienCell	#2320
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	GE Healthcare	#SH30243.01
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)	GE Healthcare	#SV30160.03
HyClone Penicillin Streptomycin 100x Solution (Pen/Strep)	GE Healthcare	#SV30010
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS)	GE Healthcare	#SH30256.01
Hydrocortisone	STEMCELL Technologies	#7904
Mouse serum	Sigma-Aldrich	#M5905
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a	BioLegend	#312105
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2	Addgene	#125600
pFUW-tetO-FOS	Addgene	#125598
pFUW-tetO-GATA2	Addgene	#125028
pFUW-tetO-GFI1B	Addgene	#125597
pLV-tetO-HA-GFI1B	Addgene	#125599
pMD2.G	Addgene	#12259
psPAX2	Addgene	#12260