Methodenartikel

Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

DOI:

10.3791/60113

⸱

11 maart 2020

 , 
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol om de balans te evalueren tussen glutamaatafgifte en klaring bij enkele corticostriatale glutamatge synapsen in acute plakjes van volwassen muizen. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescerende sensor iGluu voor glutamaat detectie, een sCMOS camera voor signaal verwerving en een apparaat voor brandpuntslaser verlichting.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synapsen zijn zeer gecompartimenteerde functionele eenheden die onafhankelijk van elkaar werken. Bij de ZvH (ZvH) en andere neurodegeneratieve aandoeningen kan deze onafhankelijkheid in het gedrang komen als gevolg van onvoldoende glutamaatklaring en de daaruit voortvloeiende spill-in- en spill-out-effecten. Veranderde astrocytische dekking van de presynaptische terminals en/of dendritische stekels en een verminderde omvang glutamaattransporterclusters op glutamaatvrijgavelocaties zijn betrokken bij de pathogenese van ziekten die leiden tot symptomen van dys-/hyperkinesie. De mechanismen die leiden tot de disfunctie van glutamaterge synapsen bij de ZvH zijn echter niet goed begrepen. Verbetering en toepassing van synapsbeeldvorming hebben we gegevens verkregen die nieuw licht werpen op de mechanismen die de initiatie van bewegingen belemmeren. Hier beschrijven we de belangrijkste elementen van een relatief goedkope aanpak om enkele synapsresolutie te bereiken met behulp van de nieuwe genetisch gecodeerde ultrasnelle glutamaatsensor iGluu, wide-field optica, een wetenschappelijke CMOS (sCMOS) camera, een 473 nm laser en een laserpositioneringssysteem om de toestand van corticostriatale synapsen in acute plakjes te evalueren vanaf de leeftijd van geschikte gezonde of zieke muizen. Glutamaat transiënten werden opgebouwd uit enkele of meerdere pixels om schattingen van i) glutamaat release op basis van de maximale hoogte van de glutamaat concentratie [Glu] naast de actieve zone en ii) glutamaat opname zoals weerspiegeld in de tijd constante van verval (TauD) van de perisynaptic [Glu]. Verschillen in de grootte van de rustbouton en contrasterende patronen van plasticiteit op korte termijn dienden als criteria voor de identificatie van corticostriatale terminals als behorend tot de intratelencephalische (IT) of het piramidale kanaal (PT) pad. Met behulp van deze methoden ontdekten we dat bij symptomatische ZvH muizen ~40% van pt-type corticostriatale synapsen onvoldoende glutamaatklaring vertoonden, wat suggereert dat deze synapsen risico lopen op excitotoxische schade. De resultaten onderstrepen het nut van TauD als biomarker van disfunctionele synapsen bij ZvH muizen met een hypokintisch fenotype.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De relatieve impact van elke synaptische terminal die behoort tot een "unitaire verbinding" (d.w.z. de verbinding tussen 2 zenuwcellen) wordt meestal beoordeeld door zijn invloed op het oorspronkelijke segment van het postsynaptische neuron1,2. Somatische en/of dendritische opnames van postsynaptische neuronen vertegenwoordigen de meest voorkomende en tot nu toe ook de meest productieve middelen om informatieverwerking te verduidelijken onder een top-down of verticaal perspectief3,4,5. De aanwezigheid van astrocyten met hun discrete en (in knaagdieren) niet-overlappende gebieden kan echter een horizontaal perspectief bieden dat is gebaseerd op lokale mechanismen van signaaluitwisseling, integratie en synchronisatie op synaptische plaatsen6,7,8,9,10.

Omdat het bekend is dat astroglia in het algemeen een belangrijke rol spelen in de pathogenese van neurodegeneratieve ziekte11,12 en, in het bijzonder, een rol in het onderhoud en de plasticiteit van glutamaterende synapsen13,14,15,16, is het denkbaar dat veranderingen in synaptische prestaties evolueren in overeenstemming met de toestand van astrocyten in het gedeelde doelgebied van afferentvezels met diverse oorsprong. Om de op het doel-/astroglia-afgeleide lokale regelgevingsmechanismen op het gebied van gezondheid en ziekte verder te onderzoeken, is het noodzakelijk om individuele synapsen te evalueren. De huidige aanpak werd uitgewerkt om het bereik van functionele glutamaatafgifte- en klaringsindicatoren te schatten en criteria te definiëren die kunnen worden gebruikt om disfunctionele (of herstelde) synapsen te identificeren in hersengebieden die het meest verband houden met bewegingsinitiatie (d.w.z. in de eerste plaats in de motorische cortex en dorsale striatum).

Het striatum mist intrinsieke glutamateren. Daarom is het relatief eenvoudig om glutamaterende afferents van extrastriatale oorsprong te identificeren. Deze laatste komen meestal voort uit de mediale thalamus en in de hersenschors (zie17,18,19,20 voor meer). Corticostriatische synapsen worden gevormd door de axonen van piramidale neuronen gelokaliseerd in corticale lagen 2/3 en 5. De respectieve axonen vormen bilaterale intra-telencephalische (IT) verbindingen of ipsilaterale verbindingen via een vezelsysteem dat meer caudally vormt de piramidale darmkanaal (PT). Voorts is gesuggereerd dat terminals van het IT- en PT-type verschillen in hun releasekenmerken en maat21,22. Gezien deze gegevens zou men ook enkele verschillen kunnen verwachten in de behandeling van glutamaat.

Het striatum is het meest aangetaste hersengebied bij de ZvH (ZvH)5. De Menselijke ZvH is een ernstige genetisch erfelijke neurodegeneratieve aandoening. Het Q175 muismodel biedt de mogelijkheid om de cellulaire basis van de hypokinetische-rigide vorm van de ZvH te onderzoeken, een toestand die veel gemeen heeft met parkinsonisme. Vanaf een leeftijd van ongeveer 1 jaar vertonen homozygote Q175 muizen (HOM) tekenen van hypokinesie, zoals blijkt uit het meten van de tijd die zonder beweging in een open veld wordt doorgebracht23. De huidige experimenten met heterozygoot Q175 muizen (HET) bevestigden de eerdere motorische tekorten waargenomen in HOM en, bovendien, bleek dat de waargenomen motortekorten gepaard gingen met een verlaagd niveau van de astrocytische excitatory aminozuur transporter 2 eiwit (EAAT2) in de onmiddellijke nabijheid van corticostriatale synaptische terminals24. Daarom is verondersteld dat een tekort aan astrocytische glutamaatopname kan leiden tot disfunctie of zelfs verlies van respectievelijk synapsen25,26.

Hier beschrijven we een nieuwe aanpak die het mogelijk maakt om enkele synapsglutamaatklaring te evalueren ten opzichte van de hoeveelheid vrijgegeven neurotransmitter. De nieuwe glutamaatsensor iGluu werd uitgedrukt in corticostriatale piramidale neuronen. Het werd ontwikkeld door Katalin Török27 en vertegenwoordigt een wijziging van de eerder geïntroduceerde hoge affiniteit, maar langzame glutamaat sensor iGluSnFR28. Beide sensoren zijn afgeleiden van het verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP). Voor spectrale en kinetische kenmerken, zie Helassa et al.27. Kortom, iGluu is een low-affinity sensor met snelle de-activering kinetiek en daarom bijzonder geschikt om glutamaat klaring te bestuderen op glutamaat-vrijgevende synaptische terminals. De dissociatietijdconstante van iGluu werd bepaald in een stilstandapparaat, dat eenTau-offwaarde van 2,1 ms bij 20 °C, maar 0,68 ms maakte wanneer geëxtrapoleerd naar een temperatuur van 34 °C27. Enkele Schaffer onderpand terminals onderzocht op 34 °C met spiraallaser scanning in de CA1 regio van organotypic hippocampal culturen onder een 2-foton microscoop vertoonde een gemiddelde tijd constante van verval van 2,7 ms.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle werkzaamheden zijn uitgevoerd overeenkomstig de EU-richtlijn 2010/63/EU voor dierproeven en zijn geregistreerd bij het Bureau voor gezondheidsbescherming en technische veiligheid in Berlijn (G0233/14 en G0218/17).

OPMERKING: Opnames van Q175 wild-type (WT) en heterozygoten (HETs) kunnen worden uitgevoerd op elke leeftijd en geslacht. Hier bestudeerden we mannen en vrouwen op een leeftijd van 51 tot 76 weken.

1. Injectie van de Glutamaatsensor iGluu voor expressie in Corticostriatal Axons

  1. Gebruik de pipetpuller (one step mode) om borosilicaat glaspipetten voor te bereiden op de injectie van het virus. Na het trekken, breek de pipet handmatig om een tip diameter van 30-50 μm te verkrijgen. Autoclave de pipet en chirurgische instrumenten, met inbegrip van de boor voor het openen van de schedel.
  2. Bewaar het virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) bij -80 °C in 10 μL aliquots. Als injecties kort na de productie van het virus (binnen 6 maanden) worden uitgevoerd, bewaar dan op 5 °C. Neem voor de operatie het flesje eruit en onderhoud het op kamertemperatuur.
  3. Vul de glazen pipet en verwijder eventuele bellen.
  4. Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van een oplossing die 87,5 mg/kg ketamine en 12,5 mg/kg xylazine bevat. Onderhuids injecteren 0,25% bupivacaïne (8 mg/kg) voor extra pijnbestrijding. Controleer de diepte van anesthesie door het toezicht op de spiertonus en het observeren van de afwezigheid van pijn-geïnduceerde reflexen.
  5. Scheer de huid op het hoofd en steriliseren met 70% alcohol. Plaats de muis in het stereotaxic frame.
  6. Gebruik een scalpel om de huid te verwijderen en een hoge snelheid (38.000 rpm) boor om een 1,2 mm gat in het bot boven de motorische cortex te maken.
  7. Monteer de spuit met de bijgevoegde injectiepipet in de houder van een precisiemanipulator. Steek de verticaal georiënteerde pipet op 4 verschillende plaatsen in de cortex. De injectiecoördinaten zijn, met betrekking tot bregma (in mm): voorste 1,5, laterale 1.56, 1.8, 2.04, 2.28. De diepte met betrekking tot dura mater is (in mm): 1.5–1.7.
  8. Injecteer met behulp van het injectiesysteem 0,3 μL per plaats van de onverdunde virusoplossing met een snelheid van 0,05 μL/min. Laat de pipet na elke injectie 1 m in staan voordat u deze langzaam intrekt (1 mm/min).
  9. Werk af door de chirurgische wond te sluiten met een nylon hechting.
  10. Laat de muis 0,5 tot 1 uur op een verwarmingskussen in een schone kooi voordat u deze terugnaar de oorspronkelijke kooi.
  11. Houd de muis op een 12 uur dag-nacht cyclus gedurende 6 tot 8 weken voor de voorbereiding van acute hersenen plakjes.
    OPMERKING: Om immuunreacties te voorkomen die leiden tot celschade en synapsverlies, moet de injectie van meerdere virale constructies gelijktijdig of binnen 2-3 uur na de primaire injectie worden uitgevoerd. De coördinaten voor iGluu injectie werden geselecteerd volgens de Paxinos en Franklin29 hersenatlas. Ze komen overeen met de M1 motorische cortex. Immunostaining van geïnjecteerde hersenen gevisualiseerd talrijke, maar meestal goed geïsoleerde axonen en axon spatheden in de ipsi- en contralaterale striatum en in de contralaterale M1 en S1 cortices.

2. Zoek naar glutamatergic terminals uitdrukken van de Glutamaat Sensor iGluu

  1. Kalibratiemodus
    1. Bereid de sCMOS-camera en de camerabesturingssoftware voor met de volgende instellingen. Stel op de uitleespagina pixeluitlezingssnelheidin: 560 MHz (= snelste uitlezing), Gevoeligheid/Dynamisch bereik: bit, onwaar ruisfilter: Ja, Overlap Uitlezing: Ja. Selecteer Volledig scherm op de pagina Binning/ROI.
    2. Bereid een glazen schuif met een druppel van 5 mg/mL Lucifer Yellow (LY) onder een cover slip.
    3. Plaats de LY-dia onder een 63x-doelstelling, open de lasersluiter en voer een seriële acquisitie uit met behulp van de volgende instellingen: Pixel Binning: 1x1, Trigger-modus: Intern, Belichtingstijd: Minimaal (te bepalen).
    4. Pas de laserkracht aan om een fluorescentievlek met een diameter van 4 μm te produceren (de afbeelding mag geen verzadigde pixels bevatten).
    5. Als u een kalibratie van het laserpositioneringssysteem wilt uitvoeren, selecteert u de volgende instellingen in de laserpositioneringssoftware: Spot-size diameter: 10, Scansnelheid: 43.200 kHz. Klik op de knop Aankoop van afbeelding starten in het rechterdeelvenster. Stel Uitvoeringenin: 0, Vertraging uitvoeren: 0 en selecteer de optie Uitvoeren bij TTL op de pagina Reeks. Klik op de knop Kalibreren op de kalibratiepagina en kalibreer de laserbesturingssoftware volgens instructies die in de linkerbovenhoek van het acquisitiescherm worden weergegeven.
    6. Als de setup onafhankelijke software gebruikt voor camera- en laserbesturing, verwerft u schermafbeeldingen van het cameraovernamevenster en stuurt u deze naar de lasercontrolesoftware voor een herberekening van de XY-coördinaten. Als de software op verschillende computers is geïnstalleerd, gebruikt u een videogrijper om het beeld in de laserbesturingssoftware te importeren. De lasercontrolesoftware heeft de informatie over de XY-schalingsfactoren en -verschuivingen nodig. Bepaal hiervoor de coördinaten van de hoeken linksboven, linksonder en rechtsonder in het beeld in het aankoopvenster van het lasercontroleprogramma. Bereken de schalingsfactoren op basis van de volgende vergelijkingen: X-factor = (X rechtsonder – X linksonder)/2048, X offset = X linksonder, Y-factor = (Y linksboven – Y linksonder)/2048, Y offset = Y linksonder.
    7. Aan het einde van de kalibratieprocedure maakt u een rechthoekig interessegebied (ROI) van 267x460 pixels, verplaatst u deze naar het midden van het scherm en klikt u op de knop Startreeks.
    8. Terug naar de volgende instellingen voor camerabesturingssoftware: Binning: 2x2, Trigger-modus: Externe belichting, belichtingstijd: Minimaal (te bepalen).
  2. Autofluorescentiecorrectiemodus
    OPMERKING: Het rustniveau van [Glu] in de omgeving van actieve synaptische terminals ligt meestal onder de 100 nM14,30,31,32,33,34. Dienovereenkomstig zal elke sensor van glutamaat, vooral een lage affiniteitssensor zoals iGluu, nogal zwak zijn bij afwezigheid van synaptische glutamaatrelease. Niettemin, sommige iGluu fluorescentie kan zelfs worden gedetecteerd in rust, maar moet worden onderscheiden van het weefsel autofluorescentie. De 473 nm verlichting ontlokt zowel iGluu fluorescentie als autofluorescentie(figuur 1A–C). De laatste neemt een breed scala van golflengten, terwijl iGluu fluorescentie is beperkt tot 480-580 nm (met een maximum van 510 nm). De correctie voor autofluorescentie is gebaseerd op de verwerving van twee beelden met verschillende high-pass filters.
    1. Bereid hersenen plakjes op voorhand zoals elders beschreven35. Houd zemelen plakjes klaar.
    2. Breng de plakjes over in de opnamekamer en dompel ze onder in zuurstofhoudende kunstmatige hersenvocht (ACSF) met 125 mM NaCl; 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glucose (pH 7.3, 303 mOsm/L), aangevuld met 0,5 mM natriumpyruvaat, 2,8 mM natriumascorbaat en 0,005 mM glutathion. Gebruik een stroomsnelheid van 1-2 mL/min. Houd de badtemperatuur op 28-30 °C.
    3. Zoek het rugstriatum onder een 20x wateronderdompelingsdoelstelling. Bevestig de plakjes met een nylon raster op een platina harp om de weefselbeweging te minimaliseren. Schakel over op de doelstelling van 63x /NA 1.0 wateronderdompeling. Selecteer filters die licht reflecteren op 473 nm (dichroïsche spiegel) en licht doorgeven met golflengten >510 nm (emissiefilter).
    4. Synchroniseer verlichting, stimulatie en beeldverwerving met behulp van een AD/DA-bord met de desbetreffende besturingssoftware. Stel het triggerprogramma in om acquisitie te controleren met een laserbelichtingstijd van 180 ms en een beeldopnametijd van 160 ms. Gebruik het laserpositioneringsapparaat om de laserstraal naar een vooraf bepaald aantal punten te sturen en de instellingen voor scansnelheid en spotgroottete definiëren.
    5. Verwerf een beeld van zowel autofluorescentie als iGluu-positievestructuren met behulp van een high pass filter op 510 nm ("geel beeld").
    6. Verwerf een afbeelding met alleen autofluorescentie met behulp van een high-pass filter op 600 nm ("rode afbeelding").
    7. Schaal de rode en gele afbeeldingen, met behulp van de gemiddelde intensiteiten van de 10 helderste en de 10 donkerste pixels om het bereik te definiëren. Voer een aftrekking "geel min rood beeld" en herschaal de afgetrokken afbeelding om een standaard 8-bits tif-bestand te genereren voor handige visualisatie van de bouton van belang(figuur 1D). Het bevat de heldere pixels van de iGluu-positievestructuren, grijze pixels van de achtergrond en donkere pixels van structuren met autofluorescentie.
      LET OP: Met de gegeven apparatuur zal de gemiddelde rustfluorescentie (F) lager zijn dan 700 na de A.U.
  3. Bouton zoekmodus
    OPMERKING: iGluu-positievepixels kunnen behoren tot functioneel verschillende elementen van de axonale boom, zoals axon takken van verschillende orde, sites van bifurcatie, spataderen na blaasuitputting of volledig actieve spataderen. Het is echter bijna onmogelijk om functionele synaptische terminals te identificeren alleen door visuele inspectie. Daarom moet elke glutamaterge synaptische terminal worden geïdentificeerd door zijn reactievermogen op elektrische depolarisatie. Sites die niet reageren op stimulatie moeten worden weggegooid. De fysiologische middelen om glutamaat release te induceren van corticostriatale axonen is om een actiepotentieel uit te lokken. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van een kanaal rododenine van de juiste spectrale kenmerken of door elektrische stimulatie van een axon gevisualiseerd door iGluu zelf. Om onbedoelde opsinactivering te voorkomen, gaven we de voorkeur aan de laatste approastep
    1. Gebruik de micropipette trekker (in een vier-staps modus) om stimulatie pipetten te produceren van borosilicaat glas haarvaten. De interne tipdiameter moet ongeveer 1 μm zijn. Wanneer gevuld met ACSF, moet de elektrodeweerstand ongeveer 10 MΩ zijn.
    2. Om de actie potentieel afhankelijke afgifte van glutamaat te induceren uit een set van synaptische boutons verbonden aan dezelfde axon, gebruik 63x vergroting, de 510 nm emissiefilter en de afgetrokken afbeelding om een glas stimulatie elektrode naast een fluorescerende spatafsom . Vermijd de nabijheid van extra axonen.
    3. Zet de stimulator aan om depolariserende stroompulsen aan de stimulatiepipet te leveren. Gebruik de huidige intensiteiten rond 2 μA (niet meer dan 10 μA).
    4. Schakel het meerkanaals badapplicatiesysteem in waarbij het ene kanaal de standaard badoplossing levert en de andere kanalen de nodige blokkers van ionenkanalen, transporters of membraanreceptoren leveren. Bedien de stroom op de plaats van opname en schakel vervolgens over naar het tetrodotoxinekanaal (TTX) kanaal (badoplossing plus 1 μM TTX). Na 2-3 min, het stimuleren van de bouton van belang weer, maar nu in de afwezigheid van actie potentiële generatie. De afgifte is direct te wijten aan calcium instroom via voltage-afhankelijke calciumkanalen.
    5. Door de intensiteitssleutel op de stimulator te draaien, past u de stimulatiestroom aan om reacties te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met die welke via actiemogelijkheden worden opgeroepen. Typisch, de stimulatie stroom zou ongeveer 6 μA voor een 0,5 ms depolarisatie.
    6. Voor basistests van het preparaat u 0,5 mM CdCl2toepassen. De aanwezigheid van deze calciumkanaalblokker glutamaat afgifte voorkomt volledig dat de synaptische glutamaat release waardoor de calciumafhankelijkheid van de direct opgeroepen glutamaat signaal.
      OPMERKING: De volgende algemene aanbeveling kan helpen om het slagingspercentage van enkele synapsexperimenten in het striatum te verhogen. Om glutamaterende synaptische terminals met intacte afgiftemachines te selecteren, moet een spatafsmeting: (i) een gladde spindelachtige vorm hebben; ii) niet in verband worden gebracht met een axonsplitsing; iii) helderder zijn dan andere structuren op het "gele beeld"; (iv) Verblijf in de striatale neuropil in plaats van in de vezeltracten; v) verblijf op een zeer dun axontak; vi) Niet in de diepere delen van het segment verblijven.

3. Visualisatie van glutamaat release en klaring

  1. Opnamemodus
    OPMERKING: Na het aftrekken van de autofluorescentie (stap 2.2) en een paar eerste tests voor responsiviteit van de aanval van belang (Stap 2.3), kan data-acquisitie beginnen. De reacties op elektrische activering van glutamaatafgifte van enkele axonterminals kunnen direct in het beeld worden waargenomen(figuur 2),zonder verdere analysetools toe te passen. Het bleek echter erg handig om onmiddellijk enkele basisindicatoren van synapsprestaties te extraheren(figuur 3). Deze informatie is nodig om beslissingen te nemen over het verdere verloop van het experiment, zoals de selectie van bepaalde terminaltypen, een snelle beoordeling van ZvH-gerelateerde wijzigingen, het aantal en de frequentie van proeven of geneesmiddelen die met het superfusiesysteem moeten worden toegepast. Het kan ook nodig zijn om te gaan met uiteindelijk verschijnen artefacten. Ten eerste worden de standaardinstellingen voor gegevensregistratie beschreven.
    1. Met behulp van de microscoop XY drives, plaats de geteste iGluu-positievebouton dicht bij het viewfield centrum. Stop de aankoop van de afbeelding met de knop Overname afbreken. Bepaal op de laatst verworven afbeelding de XY-positie van het rustbouton-centrum door erop te klikken met de linkermuisknop. De XY-coördinaten van de ingestelde cursor worden weergegeven in het onderste statuspaneel van het aankoopvenster.
    2. Bereken met behulp van de kalibratiegegevens (stap 2.1.6) de coördinaten van de plaats waar de laserstraal moet worden verzonden voor de excitatie van de iGluu fluorescentie. Gebruik de volgende vergelijkingen: X laser = X camera * X factor + X offset, Y laser = Y offset – Y camera * Y factor. Let tijdens het uitvoeren van deze herberekening op de verticale of horizontale flip-instellingen van de camera.
    3. Maak een éénpuntssequentie in de laserbesturingssoftware met behulp van de berekende coördinaten. Selecteer hiervoor Punt in het vak Toevoegen aan volgorde op de pagina Reeks van de laserbesturingssoftware. Selecteer 10 μs om de vertraging te activeren en 180 ms voor de laserpulstijd. Verplaats de muis naar de berekende coördinaten en klik op de knop Links.
    4. Selecteer de volgende instellingen in de laserbesturingssoftware: Loopt: 0, Vertraging uitvoeren: 0, Reeks: Uitvoeren bij TTL. Klik vervolgens op Reeks starten.
    5. Selecteer in de camerabesturingssoftware de volgende instellingen: Selecteer op de pagina Binning/ROI Afbeeldingsgebied: Custom, Pixel Binning: 2x2, Hoogte: 20, Breedte: 20, Links: X-coördinaat van de rustende iGluu-positieve vlek minus 10 px, Onder: Y-coördinaat van de rustende iGluu-positieve vlek minus 10 px, Acquisitiemodus: Kinetic Series, Kinetic Series Length: 400, Belichtingstijd: 0,0003744s (minimale waarde). Bij dergelijke instellingen bedraagt de aanschafsnelheid 2,48 kHz.
    6. Selecteer Triggermodus:Extern. Klik op Signaal opnemen in de camerabesturingssoftware. Start het experimentele protocol dat voor het triggerapparaat is vastgesteld.
    7. Implementeer het experimentele protocol Proef met de volgende tijdslijn: 0 ms – start trial, 1 ms – start laserverlichting, 20 ms – start beeldverwerving met camera, 70 ms – start elektrische stimulatie 1, 120 – start elektrische stimulatie 2, 181 ms – eindproef (laser en camera uit). Zo verwerft de camera tijdens één proef 400 frames met een frequentie van 2,48 kHz. Zie de stappen 2.3.3 en 2.3.5. voor meer informatie over elektrische stimulatie.
    8. Om voldoende herstel van presynaptische blaasspoelen mogelijk te maken, past u het protocol trial met een herhalingsfrequentie van 0,1 Hz of lager toe.
  2. Off-line constructie van de glutamaat voorbijgaande en snelle beoordeling van glutamaat release en klaring voor de identificatie van pathologische synapsen
    1. Zet de evaluatieroutines aan. Hier gebruiken we een in-house geschreven software SynBout v. 3.2. (auteur: Anton Dvorzhak). De volgende stappen zijn nodig om een ΔF/F-transiënt te construeren van de pixels met verhoogde iGluu fluorescentie zoals in de video van figuur 2.
    2. Om de bouton grootte te bepalen, bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) van de ROI fluorescentieintensiteit in rust (F), vóór het begin van stimulatie. Bepaal en box het gebied bezet door pixels met F>mean + 3 SD(figuur 3A). Bepaal een virtuele diameter (in μm) uitgaande van een cirkelvormige vorm van het supradrempelgebied.
    3. Bepaal ΔF als het verschil tussen de piekintensiteitswaarde en F. Plot de stimulerende stroom en ΔF/F tegen de tijd (figuur 3B). Bereken de SD van ΔF/F in rust (vóór het begin van de stimulatie) en de "Piekamplitude". Gebruik pixel met piekamplitude meer dan 3 SD van ΔF/F om monoexponentiële montage voor het bederf van piek uit te voeren. Bepaal de tijdconstante van verval TauD van ΔF/F.
    4. Als u de "Maximale amplitude" bij een bepaalde synaps wilt schatten, selecteert u de pixel met de hoogste ΔF/F-waarde. Het is meestal gelegen binnen of naast de grenzen van de rust bouton iGluu fluorescentie. De "Maximale amplitude" zou de beste indicator zijn van de glutamaatbelasting die aan de klaringsmachines van een enkele synaps wordt gepresenteerd.
    5. Om de ruimtelijke uitbreiding van het iGluu-signaal te schatten, bepaalt u de diameter van het gebied van alle supradrempelpixels gecombineerd om een virtuele cirkel te vormen. De respectievelijke diameter wordt "Spread" genoemd. De term "Piekspreiding" verwijst dan naar de piekwaarde van de gemiddelde spread transient(figuur 3C, verschil tussen gestippelde rode lijnen).
  3. Correcties voor mogelijke artefacten
    OPMERKING: Elektrische depolarisatie wordt geassocieerd met een uitgaande stroom van de intrapipetoplossing. Dit kan leiden tot een kleine weefselverplaatsing. Om onderscheid te maken tussen door stimulatie geïnduceerde veranderingen van iGluu en out-of-focus verschuivingen van het beeld, kan men de volgende benadering gebruiken om verplaatsingartefacten te identificeren en te elimineren(figuur 4).
    1. Analyseer de ruimtelijke kenmerken van de supradrempelpixels die zijn afgeleid van een ROI met tekenen van verplaatsing(figuur 4F–H).
    2. Zoek pixels buiten de aanvankelijk bepaalde grenzen van de bouton in rust(figuur 4F-H, in het rood).
    3. Uiteindelijk bestaande negatieve pixelintensiteitswaarden identificeren(figuur 4I, J). Elke ΔF/F in de negatieve richting met een amplitude groter dan het pre-stimulatiegemiddelde ± 3 SD moet als artefact worden beschouwd en het record moet worden weggegooid.
    4. Om out-of-focus artefacten te voorkomen, plaats de stimulatie-elektrode op de antero-laterale kant van de synaptische bouton, gebruik bifasische elektrische stimulatie en minimaliseer de stimulatieintensiteit / duur.
      OPMERKING: Out-of-focus artefacten kunnen ook worden afgeleid van de camera. Als deze laatste niet optimaal aan de microscoop is bevestigd, kan het trillingen veroorzaken, waarschijnlijk als gevolg van kleine trillingen van het camerakoelsysteem. Dergelijke trillingen creëren een "yin en yang" patroon in de ΔF / F beelden draaien met een frequentie van 50 Hz. De trillingen kunnen mathematisch worden afgetrokken van het fluorescentiesignaal, maar de uiteindelijke kwaliteit van de metingen zou dan kritisch afhangen van de opnametijd.
    5. Bevestig de camera aan de microscoop zodat trillingen afwezig zijn. Als deze laatste blijft, plaats dan een rubberen pakking tussen de camera en de microscoopadapter.
      OPMERKING: Men kan niet voorbijgaan aan de mogelijkheid dat de striatale neuropil rond de synaps van belang glutamaterende spataderen bevat die iGluu niet uitdrukken en daarom onzichtbaar blijven. In het geval van hun co-activering (waarschijnlijker bij afwezigheid van TTX) kunnen de vergankelijke stoffen die zijn verkregen uit de aanvallen van belang worden beïnvloed door spill-over. Hetzelfde geldt voor iGluu-uitdrukkenterminals die onscherp waren. Een kenmerkend fenomeen zou in dit geval zijn dat fluorescentietransiën uit een veel groter gebied komen. Aangezien deze reactie wordt geëlimineerd door TTX, kan men interpreteren als een niet-specifieke reactie veroorzaakt door ongerechtvaardigde multi-fiber activering.
    6. Als u deze niet-specifieke multivezelrespons wilt corrigeren, volgt u de procedure die in figuur 5 isbeschreven . Gebruik het fluorescentiesignaal van pixels op de grenzen van het gezichtsveld. Om de reactie op de achtergrond te minimaliseren, minimaliseert u de stimulatieintensiteit en de duur of gebruikt u TTX.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificatie van twee soorten corticostriatale glutamaterende spataderen
IT- en PT-afferents komen respectievelijk voort uit laag 2/3 en 5 en vertonen differentiële vertakking- en beëindigingspatronen in het ipsilaterale en contralaterale (alleen IT-terminals) striatum. Er is nog weinig bekend over de eigenschappen van glutamaatafgifte en -klaring onder herhaalde activeringsomstandigheden, zoals waargenomen tijdens de initiatie van bewegingen, maar het is goed gedocumenteerd dat de respectieve glutam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De experimenten hebben betrekking op een kwestie van algemeen belang — synapsonafhankelijkheid en het mogelijke verlies ervan in de loop van neurodegeneratie, en we beschrijven een nieuwe aanpak om aangetaste synapsen te identificeren in acute hersenschijfjes van oude (>1 jaar) muizen. Profiterend van de verbeterde kinetische kenmerken van de onlangs geïntroduceerde glutamaatsensor iGluu verlichten de experimenten de relatie tussen synaptische glutamaatafgifte en opname op een manier die voorheen niet mogelijk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door CHDI (A-12467), de German Research Foundation (Exc 257/1 en DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) en intramurale Onderzoeksfondsen van de Charité. Wij danken K. Török, St. George's, Universiteit van Londen, en N. Helassa, Universiteit van Liverpool, voor de iGluu plasmid en vele nuttige discussies. D. Betances en A. Schönherr zorgden voor uitstekende technische assistentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Stereo microsopeWPIPZMIIIPrecision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frameStoelting51500DDigital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipmentStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Injection systemStoelting53311Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µlHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning systemRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Blue laser for iGluu excitationRapp OptoElectronicDL-473-020-S473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroic
1P upright microscopeCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x objectiveCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluuOmega opticalXF2030
Emission filter for iGluuOmega opticalXF3086
Dichroic mirrorOmega opticalQMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr.Omega opticalQMAX EM600-650
sCMOS cameraAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition softwareAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA converterHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Aquisition softwareHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Electrode positioning systemSutter InstrumentMPC-200Micromanipulator
Electrical stimulatorCharite workshopsSTIM-26
SlicerLeicaVT1200 SVibrotome
Brown/Flaming-type pullerSutter InstrSU-P1000P-1000
Glass tubes for injection pipettesWPI1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettesWPIR100-F3
TetrodotoxinAbcamab120054TTX
iGluu plasmidAddgene106122pCI-syn-iGluu
Q175 miceJackson Lab27410Z-Q175-KI

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56(2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554(2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239(2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451(2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142(2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154(2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19(2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634(2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414(2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Glutamaatopnamebeeldvorming van een enkele synapscorticostriatale synapseniGlu sensorTauD metingsCMOS cameralaserpositioneringcorrectie voor autofluorescentie

Gerelateerde artikelen