Methodenartikel

Karakterisering van immuuncel-afgeleide extracellulaire vesicles en het bestuderen van functionele impact op celmilieu

DOI:

10.3791/60118

⸱

2 juni 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderhavige rapport belicht chronologische eisen voor extracellulaire vesicle (EV) isolatie van microglia of bloedmacrofagen. Microglia-afgeleide EV's werden geëvalueerd als regelgevers van de neurite uitgroei, terwijl bloed macrofaag-afgeleide EV's werden bestudeerd in de controle van C6 glioom cel invasie in in vitro testen. Het doel is om deze EV-functies als immuunbemiddelaars in specifieke micro-omgevingen beter te begrijpen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De neuro-inflammatoire toestand van het centrale zenuwstelsel (CNS) speelt een belangrijke rol in fysiologische en pathologische omstandigheden. Microglia, de inwonende immuuncellen in de hersenen, en soms de infiltrerende beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs), reguleren het ontstekingsprofiel van hun micro-omgeving in het CNS. Men aanvaardt nu dat de extracellulaire vesicle (EV) populaties uit immuuncellen fungeren als immuunbemiddelaars. Zo zijn hun verzameling en isolatie belangrijk om hun inhoud te identificeren, maar ook hun biologische effecten op ontvangende cellen te evalueren. De huidige gegevens benadrukken chronologische vereisten voor EV-isolatie van microgliacellen of bloedmacrofagen, waaronder de ultracentrifugatie en grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) stappen. Een niet-gerichte proteomische analyse liet de validatie van eiwithandtekeningen als EV-markers toe en karakteriseerde de biologisch actieve EV-inhoud. Microglia-afgeleide EV's werden ook functioneel gebruikt op de primaire cultuur van neuronen om hun belang als immuunbemiddelaars in de neurite uitgroei te beoordelen. De resultaten toonden aan dat microglia-afgeleide EV's bijdragen aan het vergemakkelijken van de neurite uitgroei in vitro. Tegelijkertijd werden bloed macrofaag-afgeleide EV's functioneel gebruikt als immuunbemiddelaars in sferoïde culturen van C6 glioomcellen, de resultaten waaruit blijkt dat deze EV's de gliomacelinvasie in vitro controleren. Dit rapport belicht de mogelijkheid om de EV-gemedieerde immuuncelfuncties te evalueren, maar ook de moleculaire basis van een dergelijke communicatie te begrijpen. Deze ontcijfering kan het gebruik van natuurlijke vikjes en/of de in vitro voorbereiding van therapeutische vikjes bevorderen om immuuneigenschappen in de micro-omgeving van CNS-pathologieën na te bootsen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel neuropathologieën zijn gerelateerd aan de neuro-inflammatoire toestand die een complex mechanisme is dat steeds meer wordt overwogen, maar nog steeds slecht begrepen omdat de immuunprocessen divers zijn en afhankelijk zijn van de celomgeving. De CNS-aandoeningen hebben immers niet systematisch dezelfde activeringssignalen en immuuncelpopulaties en dus zijn de pro- of ontstekingsremmende reacties moeilijk te beoordelen als oorzaken of gevolgen van pathologieën. De hersenen resident macrofagen genaamd "microglia" lijken te zijn op de interface tussen het zenuwstelsel en het immuunsysteem1. Microglia hebben een myeloïde oorsprong en zijn afgeleid van de dooier zak tijdens primitieve hematopoiesis om de hersenen te koloniseren, terwijl perifere macrofagen zijn afgeleid van de foetale lever tijdens definitieve hematopoiesis te worden perifere macrofagen2. De microglia cellen communiceren met neuronen en neuron-afgeleide gliacellen zoals astrocyten en oligodendrocyten3. Verschillende recente studies hebben aangetoond dat microglia betrokken zijn bij neuronale plasticiteit tijdens cns-ontwikkeling en adult tissue homeostase, en ook in de ontstekingstoestand geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten4,5. Anders kan de integriteit van de bloedhersenbarrière worden aangetast in andere CNS-pathologieën. De immuunresponsen, vooral bij de glioblastoom multiforme kanker, worden niet alleen ondersteund door microgliacellen omdat de bloedhersenbarrière wordt gereorganiseerd door angiogene processen en de aanwezigheid van lymfevaten6,7. Daarom vindt een grote beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) infiltratie plaats in de hersentumor gedurende tumorafhankelijke angiogenese mechanismen8. De kankercellen oefenen een aanzienlijke invloed uit op geïnfiltreerde BMDMs wat leidt tot immunosuppressieve eigenschappen en tumorgroei9. Zo is de communicatie tussen de immuuncellen en hun hersenen micro-omgeving is moeilijk te begrijpen als de cel oorsprong en activering signalen zijn divers10,11. Het is dus interessant om de functies van immuuncel-geassocieerde moleculaire handtekeningen in fysiologische omstandigheden te vatten. In dit verband kan de celcelcommunicatie tussen immuuncellen en celmicro-omgeving worden bestudeerd door het vrijkomen van extracellulaire adereilanden (EV's).

De EV's worden meer en meer bestudeerd in de regulatie van immuunfuncties in gezonde en pathologische aandoeningen12,13. Er kan rekening worden gehouden met twee populaties, exosomen en microvesicles. Ze presenteren verschillende biogenese en grootte bereiken. De exosomen zijn vesicles van ~ 30-150 nm diameter en worden gegenereerd uit het endosomale systeem en uitgescheiden tijdens de fusie van multivesiculaire lichamen (MVBs) met het plasmamembraan. De microvesicles zijn ongeveer 100-1.000 nm in diameter en worden gegenereerd door een naar buiten ontluikende uit de cel plasma membraan14. Omdat de exosoom versus microvesicle discriminatie is nog steeds moeilijk te realiseren op basis van de grootte en moleculaire patronen, zullen we alleen gebruik maken van de term EV's in het huidige rapport. De ev-geassocieerde communicatie in het CNS vertegenwoordigt een voorouderlijk mechanisme sinds studies hun betrokkenheid bij ongewervelde soorten, waaronder aaltjes, insecten of annelids15,16. Bovendien tonen de resultaten waaruit blijkt dat EV's kunnen communiceren met cellen van verschillende soorten, dat dit mechanisme een sleutelslotsysteem is, dat eerst gebaseerd is op oppervlaktemolecuulherkenning tussen vesicles en ontvangende cellen en vervolgens de opname van bemiddelaars16,17. De EV's bevatten namelijk veel moleculen zoals eiwitten (bijvoorbeeld enzymen, signaaltransductie, biogenesefactor), lipiden (bijvoorbeeld ceramide, cholesterol) of nucleïnezuren (bijvoorbeeld DNA, mRNA of miRNAs) die fungeren als directe of indirecte regelgevers van de ontvangende celactiviteiten14. Daarom werden ook methodologische studies uitgevoerd op immuuncellen om EV's te isoleren en hun eiwithandtekeningen volledig te karakteriseren18,19.

De vroegste studies toonden het vrijkomen van exosomen uit primaire gekweekte rat microglia als een induceerbaar mechanisme na een Wnt3a- of serotonine-afhankelijke activering20,21. Functioneel in het CNS, microglia-afgeleide EV's reguleren de synaptische blaasjes release door presynaptische terminals in neuronen bij te dragen aan de controle van de neuronale prikkelbaarheid22,23. Microglia-afgeleide EV's kunnen ook cytokines-gemedieerde ontstekingsrespons verspreiden in grote hersengebieden24,25. Belangrijk is dat de diverse ligands voor tol-achtige receptor familie specifieke producties van EV's in de microglia26kan activeren. Bijvoorbeeld, in vitro studies tonen aan dat LPS-geactiveerde microglia BV2 cellijnen differentiële EV-inhoud produceren, waaronder pro-inflammatoire cytokines27. Daarom kan de functionele diversiteit van immuuncelsubpopulaties in de CNS, microglia en het infiltreren van BMDMs, worden geëvalueerd door middel van hun eigen EV-populaties, waaronder de EV-impact op de ontvangende cellen en de identificatie van EV-inhoud.

We beschreven eerder methoden om de functionele eigenschappen van microglia- en BMDM-afgeleide EV's te evalueren na hun isolatie16,19. In dit rapport stellen we voor om onafhankelijk het effect van microglia-afgeleide EV's op neuritische uitgroei en het effect van macrofaag-afgeleide EV's op de controle van glioomcelaggregaten te evalueren. Deze studie stelt ook een brede proteomische analyse van de EV-breuken voor om de EV-isolatieprocedure te valideren en de biologisch actieve eiwithandtekeningen te identificeren. De gunstige effecten en het moleculair ontcijferen van EV-inhoud kunnen helpen hun mogelijke manipulatie en gebruik als therapeutische middelen in hersenaandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Primaire cultuur van Microglia/Macrofagen

  1. Primaire cultuur van microglia
    1. Kweek commerciële rat primaire microglia (2 x 106 cellen) (zie de tabel van materialen) in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% exosoomvrij serum, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycin en 9,0 g/L bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Verzamel het geconditioneerde medium na een cultuur van 48 uur en ga door naar de isolatie van EV's.
  2. Primaire cultuur van macrofagen
    1. Kweek commerciële rat primaire macrofagen (1 x 106 cellen) in het medium dat door de fabrikant (zie de tabel van materialen)bij 37 °C en 5% CO2, met exosoom-vrij serum.
    2. Verzamel het geconditioneerde medium na een cultuur van 24 uur en ga door naar het isolement van EV's.

2. Isolatie van EV's

  1. Pre-isolatie van EV's van geconditioneerd medium
    1. Breng het geconditioneerde kweekmedium van microglia- of macrofaagculturen (stap 1.1.2 of 1.2.2) over in een conische buis.
    2. Centrifuge bij 1.200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om de cellen te pelleteren.
    3. Breng de supernatant in een nieuwe conische buis. Centrifuge op 1.200 x g gedurende 20 minuten op RT om apoptotische lichamen te elimineren.
    4. Breng de supernatant over in een polycarbonaatbuis van 10,4 mL en breng de buis over in een 70.1 Ti rotor. Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 90 min bij 4 °C om de EV's te pelleteren.
    5. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet met EV's in 200 μL van 0,20 μm gefilterde fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
  2. Isolatie van EV's
    1. Voorbereiding van de zelfgemaakte grootte uitsluiting chromatografie kolom (SEC)
      1. Leeg een glazen chromatografiekolom (lengte: 26 cm; diameter: 0,6 cm) (zie de tabel met materialen),was en steriliseer deze.
      2. Plaats een filter van 60 μm onder aan de kolom.
      3. Stapel de kolom met cross-linked agarose gel filtratie base matrix om een stationaire fase van een diameter van 0,6 cm en een hoogte van 20 cm te creëren.
      4. Spoel de fase af met 50 mL van 0,20 μm gefilterde PBS. Bewaar op 4 °C om later te worden gebruikt indien nodig.
    2. Plaats de geresuspended EV pellet op de top van de stationaire fase van de SEC kolom.
    3. Verzamel 20 opeenvolgende fracties van 250 μL terwijl u 0,20 μm gefilterde PBS aan de bovenkant van de stationaire fase blijft toevoegen om het drogen van de kolom te voorkomen. Bewaar de fracties indien nodig op -20 °C.
      LET OP: Een langere opslag dan een week kan worden uitgevoerd bij -80 °C om de EV-integriteit voor moleculaire analyse te behouden.
  3. Matrix assisted laser desorption ionisatie (MALDI) massaspectrometrie analyse van de SEC fracties
    1. Ga naar de EV isolatie zoals beschreven in punt 2.2.
    2. Resuspend de EV pellet met 200 μL peptide kalibratie mix oplossing (zie de tabel van materialen).
    3. Ga naar EV collectie zoals beschreven in de punten 2.2.1 tot en met 2.2.3.
    4. Droog de fractie volledig af met een vacuümconcentrator.
    5. Reconstrueren van de fracties met 10 μL van 0,1% trifluoroacetisch zuur (TFA).
    6. Meng 1 μL gereconstitueerde fractie met 1 μL α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix op een MALDI gepolijste stalen doelplaat.
    7. Analyseer alle breuken met een MALDI massaspectrometer.
    8. Analyseer gegenereerde spectra met speciale software (zie Tabel van Materialen).

3. Karakterisering van EV's

  1. Nanoparticle tracking analyse (NTA)
    OPMERKING:     De NTA-analyse wordt uitgevoerd met een nanodeeltjestrackinganalyse-instrument (zie de tabel van materialen)en een geautomatiseerde spuitpomp.
    1. Maak een verdunning (bereik van 1:50 tot 1:500) van elke SEC-fractie van stap 2.2.3 met 0,20 μm gefilterde PBS.
    2. Vortex is de oplossing om EV-aggregaten te elimineren.
    3. Doe de verdunde oplossing in een spuit van 1 mL en plaats deze in de geautomatiseerde spuitpomp.
    4. De camera-instelling aanpassen aan schermver versterkingsniveau (3) en cameraniveau (13).
    5. Klik op Uitvoeren en start het volgende script.
      1. Laad het monster in de analysekamer (infusiesnelheid: 1.000 voor 15 s).
      2. Verlaag en stabiliseer de snelheid voor video-opname (infusiesnelheid: 25 voor 15 s). Leg drie opeenvolgende 60 s video's van de deeltjesstroom vast.
      3. Pas het cameraniveau (13) en de detectiedrempel (3) aan voordat video's worden geanalyseerd. Klik op Instellingen| Ok om de analyse te starten en klik op Exporteren wanneer de analyse is gedaan.
    6. Tussen elke fractieanalyse door, was met 1 mL van 0,20 μm gefilterde PBS.
  2. Elektronenmicroscopie (EM) analyse
    1. Ev's isoleren zoals beschreven in sectie 2.
      LET OP: Steriele omstandigheden zijn niet vereist.
    2. Herhaal punt 3.1 om EV's te kwantificeren.
      LET OP: Alleen positieve breuken worden gebruikt voor EM-analyse.
    3. Gebruik een 50 kDa centrifugaalfilter (zie Tabel van materialen)om EV-bevattende SEC-fracties te concentreren.
    4. Resuspend geconcentreerde EV's in 30 μL van 2% paraformaldehyde (PFA).
    5. Laad 10 μL van het monster op een koperen raster met koolstofcoating.
    6. Incubeer gedurende 20 minuten in een natte omgeving.
    7. Herhaal stap 3.2.5 en 3.2.6 voor een goede absorptie van het monster op het rooster.
    8. Breng het rooster in een druppel van 1% glutaraldehyde in PBS gedurende 5 minuten bij RT.
    9. Was het monster meerdere malen met ultrazuiver water.
    10. Contrasteer het monster gedurende 10 minuten op ijs met een mengsel van 4% uranylacetaat en 2% methylcellulose (1:9, v/v). Verwijder overtollige van het mengsel met behulp van een filterpapier.
    11. Droog het monster en observeer het onder een transmissieelektronenmicroscoop bij 200 kV (zie de tabel van materialen).
  3. Westerse vlekanalyse
    1. Eiwitextractie
      1. Herhaal de stappen 3.2.1 tot en met 3.2.3 om EV's te isoleren en te concentreren.
      2. Meng 50 μL RIPA-buffer (150 mM natriumchloride [NaCl], 50 mM Tris, 5 m Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetisch zuur [EGTA], 2 mM Ethyleediamine-tetraatisch zuur [EDTA], 100 mM natriumfluoride [NaF], 10 mM natriumcafofosfaat, 1% Nonidet P-40, 1 mM Fenylmethanesulfonylfluoride [PMSF], 1x proteaseremmer) met het EV-monster (25 μL als gevolg van de EV-concentratie op filter) gedurende 5 min op ijs om eiwitten te extraheren.
      3. Sonicaat voor 5 s (amplitude: 500 W; frequentie: 20 kHz), 3 keer op ijs.
      4. Verwijder vesiculaire resten door centrifugatie bij 20.000 x g gedurende 10 minuten, bij 4 °C.
      5. Verzamel de supernatant en meet de eiwitconcentratie met bradford eiwittestmethode.
    2. Natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) en western blotting
      1. Meng eiwitextracten (30 μg) met 5c Laemmli monsterbuffer (v/v).
      2. Laad de eiwitmix op een 12% polyacrylamide gel.
      3. Trek de eiwitten in de gel met TGS-buffer (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM Glycine en 0,1% SDS), bij 70 V voor 15 min en 120 V gedurende 45 min.
      4. Breng de eiwitten met een halfdroog systeem met 230 V gedurende 30 minuten over op het nitrocellulosemembraan.
      5. Verzadig het membraan voor 1 uur bij RT met blokkeerbuffer (0,05% Tween 20 w/v, 5% melkpoeder w/v in 0,1 M PBS, pH 7.4).
      6. Incubeer het membraan 's nachts bij 4 °C met muis monoklonale anti-menselijke warmteschok eiwit 90 (HSP90) antilichaam verdund in blokkeerbuffer (1:100).
      7. Was het membraan drie keer met PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) gedurende 15 minuten.
      8. Het membraan 1 uur bij RT incuren met geit mierikswortel peroxidase-gevoegde antimuisig IgG secundair antilichaam verdund in blokkeringsbuffer (1:10.000).
        LET OP: Een negatieve controle wordt uitgevoerd met behulp van secundaire antilichaam alleen.
      9. Herhaal de wasstap (stap 3.3.2.7).
      10. Onthul het membraan met verbeterde chemiluminescentie (ECL) westelijke blotting substraat kit (zie Tabel van materialen).
  4. Proteomische analyse
    1. Eiwitextractie en in-gel spijsvertering
      1. Herhaal de stappen 3.2.1 tot en met 3.2.3 om de EV's te isoleren en te concentreren. Herhaal stap 3.3.1 voor EV-eiwitextractie.
      2. Voer eiwitmigratie uit in de stapelgel van een 12% polyacrylamidegel.
      3. Bevestig de eiwitten in de gel met coomassie blauw gedurende 20 minuten op RT.
      4. Snijd elk gekleurd gelstuk weg en snijd het in kleine stukjes van 1 mm3.
      5. Was de gelstukken achtereenvolgens met 300 μL van elke oplossing: ultrazuiver water gedurende 15 minuten, 100% acetonitril (ACN) gedurende 15 min, 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3) gedurende 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) gedurende 15 min en 100% ACN gedurende 5 min met roer continuering.
      6. Droog volledig gel stukken met vacuüm concentrator.
      7. Voer eiwitreductie uit met 100 μL van 100 mM NH4HCO3 met 10 mM dithiothreitol gedurende 1 uur bij 56°C.
      8. Voer eiwitalkylering uit met 100 μL van 100 mM NH4HCO3 met 50 mM iodoacetamide gedurende 45 minuten in het donker bij RT.
      9. Was de gelstukken achtereenvolgens met 300 μL van elke oplossing: 100 mM NH4HCO3 gedurende 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) gedurende 15 min en 100% ACN gedurende 5 minuten met continu roeren.
      10. Droog de gelstukken volledig af met een vacuümconcentrator.
      11. Voer eiwitvertering uit met 50 μL trypsine (12,5 μg/mL) in 20 mM NH4HCO3 's nachts bij 37 °C.
      12. Haal de verteerde eiwitten uit de gel met 50 μL van 100% ACN gedurende 30 minuten bij 37 °C en vervolgens 15 minuten bij RT met continu roeren.
      13. Herhaal de volgende extractieprocedures tweemaal: 50 μL van 5% TFA in 20 mM NH4HCO3-oplossing voor 20 minuten met continu roeren.
      14. Voeg 100 μL van 100% ACN toe gedurende 10 minuten met continu roeren.
      15. Droge verteerde eiwitten met een vacuümconcentrator en opnieuw te besteden in 20 μL van 0,1% TFA.
      16. Desalt het monster met behulp van een 10 μL pipettip met C18 reverse phase media voor het ontzalteren en concentreren van peptiden (zie de tabel van materialen)en elute peptiden met ACN:0,1% mierenzuur (FA) (80:20, v/v).
      17. Droog het monster volledig met een vacuümconcentrator en opnieuw op te hangen in 20 μL ACN:0,1% FA (2:98, v/v) voor vloeibare chromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).
    2. LC-MS/MS-analyse
      1. Laad het verteerde peptide in het LC-MS/MS-instrument en voer monster- en data-analyse uit volgens parameters die elders in detail zijn beschreven42.
    3. Ruwe gegevensanalyse
      1. Verwerk massaspectrometriegegevens om eiwitten te identificeren en identificeerde eiwitten van elk monster te vergelijken met een kwantitatief proteomics-softwarepakket met behulp van standaardparameters.
      2. Exporteer, met behulp van standaardparameters, de lijst van exclusieve en oververtegenwoordigde eiwitten uit EV-positieve monsters in een software die eiwitnetwerken en biologische processen voorspelt.
      3. Vergelijk de lijst van geïdentificeerde eiwitten in de breuken met de top 100 EV markers uit de Exocarta open access database (zie de tabel van materialen).

4. Functionele EV's Effecten Test

  1. Neurite uitgroei test op PC-12 cel lijn
    1. Kweek PC12-cellijn in volledig DMEM-medium (2 mM L-glutamine, 10% foetale paardenserum (FHS), 5% foetale runderserum (FBS), 100 UI/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine).
      LET OP: De sera zijn exosoom vrij in de hele procedure.
    2. Voeg een afdekglas (alle putten) toe aan een 24-put plaat; bestrijk de plaat met poly-D-lysine (0,1 mg/mL) en zaad 260.000 cellen/put.
    3. Incubeer de cellen bij 37 °C onder 5% CO2.
    4. Na 24 uur incubatie, verander het medium naar DMEM differentiatiemedium (DMEM met 2 mM L-glutamine, 0,1% FHS, 100 UI/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine) met 1 x 106 microglia EV's (vanaf stap 1.1.2).
      LET OP: Controle voorwaarde wordt uitgevoerd zonder microglia EV's in de differentiatie medium.
    5. Laad op dag 4 na het zaaien alle putten met 100 μL van volledig DMEM-medium.
    6. Bevestig op dag 7 na het zaaien de cellen met 4% PFA gedurende 20 minuten bij RT en spoel drie keer (10 min per stuk) met PBS.
    7. Bevlek de cellen met rhodamine-geconjugeerde phalloïden gedurende 30 minuten bij 4 °C en spoel 3 keer (10 min per stuk) met PBS.
    8. Vlek de cellen met verdunde Hoechst 33342 (1:10.000) gedurende 30 minuten bij RT en spoel 3 keer (10 min per stuk) met PBS.
    9. Monteer het afdekglas op een glijbaan met tl-montagemedium (zie Tabel van Materialen).
    10. Analyseer de dia met een confocale microscoop, neem 5 willekeurige beelden van elke dia.
    11. Meet neurite outgrowth met behulp van een geautomatiseerde kwantificeringssoftware (totale neurietlengte) zoals beschreven in detail elders43.
  2. Neurite uitgroei op rat primaire neuronen
    1. Bekleed een 8-well glazen schuif met poly-D-lysine (0,1 mg/mL) en laminine (20 μg/mL).
    2. Kweekrat commerciële primaire neuronen in geschikte kweekmedium (zie Tabel van Materialen)door 50.000 cellen per put te platgeneren en de cellen bij 37 °C onder 5% CO2 voor 48 h te verminderen.
      LET OP: De sera zijn exosoomvrij in de hele procedure.
    3. Voeg 1 x 106 microglia EV's toe aan neuron kweekmedium en incubaal bij 37 °C onder 5% CO2 voor 48 uur meer.
      LET OP: Controle voorwaarde wordt uitgevoerd zonder microglia EV's in neuron cultuur medium.
    4. Volg de stappen 4.1.6 tot en met 4.1.9 om de cellen op te lossen en te bevlekken.
    5. Volg de stappen 4.1.10 en 4.1.11 om de dia te analyseren.
  3. Glioma celinvasie
    1. Resuspend C6 rat glioma cellen in complete DMEM medium (DMEM met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1x antibiotica) met 5% collageen bij een uiteindelijke concentratie van 8.000 cellen in 20 μL.
      LET OP: De sera zijn exosoomvrij in de hele procedure.
    2. Plaats 5 mL PBS AAN de onderkant van een 60 mm weefselkweekschotel. Omkeert het deksel en deponeert druppels van 20 μL (8.000 cellen) van celsuspensie op de bodem van het deksel.
    3. Keer het deksel om op de met PBS gevulde bodemkamer en ontcubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 72 uur totdat celsferoïden zijn gevormd.
    4. Voeg 1 x 108 macrofaag-EV's (van stap 1.2.2) toe aan een 2,2 mg/mL collageenmengsel (2 mL van de oplossing van rundercollageen type I [3 mg/mL] met 250 μL van 10x minimaal essentieel medium (MEM) en 500 μL natriumhydroxide).
      LET OP: Controle voorwaarde wordt uitgevoerd zonder macrofaag EV's in het collageen mengsel.
    5. Verdeel het collageenmengsel met EV's in een 24-putplaat voor het inbedden van celsferoïden.
    6. Implanteren de nieuw gevormde celferoïden in het midden van elke put.
    7. Broed de plaat 30 min bij 37°C en 5% CO2 om de gel te stollen.
    8. Daarna, overlay 400 μL van volledige DMEM medium op de collageen matrix in elke put.
    9. Het volledige systeem incubeer maken gedurende in totaal 6 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
      LET OP: Celinvasie uit de sferoïde wordt gecontroleerd door digitale fotografie met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop met behulp van een 4x/0.10 N.A. doelstelling.
    10. Elke dag beelden van elke put verwerven.
    11. Verwerkt afbeeldingen en kwantificeer invasie van celsferoïde gebieden met behulp van de software zoals eerder beschreven in detail42.
      LET OP: Invasie en sferoïde gebieden werden genormaliseerd voor elke dag aan de invasie en sferoïde gebieden gemeten op dag 0.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste uitdagingen voor het toeschrijven van biologische effecten aan extracellulaire vesicles (EV's) is de mogelijkheid om de EV's te isoleren van het hele cultuurmedium. In dit rapport presenteren we een methode met behulp van ultracentrifugatie (UC) en size-exclusion chromatografie (SEC) die is gekoppeld aan de grootschalige analyse van eiwithandtekeningen om EV-markers te valideren en bioactieve verbindingen te identificeren. De macrofaag- of microglia-afgeleide EV's werden geïsoleerd van het gecond...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het centrale zenuwstelsel (CNS) is een complex weefsel waarin cel-naar-cel communicatie normale neuronale functies reguleert die nodig zijn voor homeostase30. EV's worden nu op grote schaal bestudeerd en beschreven als belangrijke moleculaire ladingen voor cel-naar-cel communicatie31. Ze leveren specifiek een cocktail van bemiddelaars aan ontvangende cellen waardoor hun functies in gezonde en pathologische omstandighedenbeïnvloeden 32. Recente studie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde werk werd ondersteund door de Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche en INSERM. We erkennen dankbaar de BICeL- Campus Scientific City Facility voor toegang tot instrumenten en technische adviezen. Wij erkennen jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard en Isabelle Fournier dankbaar voor de mass spectrometrie hulp. Wij erkennen met dank aan Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli en Pierre-Eric Sautière voor hun sterke bijdrage aan de wetenschappelijke en technische ontwikkelingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-rad4561045EDU 
AcetonitrileFisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa centrifugal filterMerckUFC505024 
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus supplementGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
C6 rat glioma cellATCCATCC CCL-107 
Canonical tubesSarstedt62.554.002 
CentrifugeEppendorf5804000010 
CO2 IncubatorThermoFisher  
Confocal microscope LSM880Carl ZeissLSM880 
Cover glassMarienfeld111580 
Culture Dish (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 Liquid ChromatographThermoFisher  
Electron microscope JEM-2100JEOL  
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich03777-10G 
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)  http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine SerumGibco16140071 
Fetal Horse SerumBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand Q500 Sonicator with ProbeFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescence mounting mediumAgilentS3023 
Formic AcidSigma-Aldrich695076 
Formvar-carbon coated copper gridsAgar scientific LtdAGS162-3 
GlucoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehydeSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamideSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Invert light microscope CKX53Olympus  
L-glutamineGibco25030-024 
LabTek II 8 wells Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
MaxQuant software (proteins identification software)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stellBrucker8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
MethylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ waterMerck Millipore  
MilkRegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC columnGE Healthcare no longer available
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
NanoSight NTA software v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight syringe pumpMalvern Panalytical  
NeurobasalGibco21103-049 
Nitrocellulose membraneGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multidish 24 wellsThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydeElectro microscopy Science15713 
PC-12 cell lineATCCATCC CRL-1721 
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122 
Peptide calibration mixLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus software (Processing of identified proteins)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830 
Phosphate Buffer SalineInvitrogen14190094no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µmpluriSelect43-50060 
Poly-D-lysine

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28(2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68(2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124(2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048(2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144(2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182(2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168(2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immune CellsUltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyNanoparticle Tracking AnalysisWestern BlotProteomics AnalysisNeurite OutgrowthGlioma Cell InvasionMicroglia derived EVs

Gerelateerde artikelen