Methodenartikel

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

8.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60122

⸱

8 augustus 2019

 , 
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Samenvatting

Het definiëren van het ideale model voor een in vitro studie is essentieel, vooral als het bestuderen van fysiologische processen zoals differentiatie van cellen. In de tumor stroma, gastheer fibroblasten worden gestimuleerd door kankercellen te differentiëren. Dus, ze verwerven een fenotype dat bijdraagt aan de tumor micro omgeving en ondersteunt de progressie van de tumor. Door gebruik te maken van het spheroid-model hebben we zo'n 3D in vitro modelsysteem opgezet, waarin we de rol van laminin-332 en de receptor integrine α3β1 in dit differentiatieproces analyseerden. Dit spheroid-modelsysteem reproduceert niet alleen de omstandigheden van de tumor microomgeving op een nauwkeurigere manier, maar is ook een zeer veelzijdig model, omdat het verschillende downstreamonderzoeken mogelijk maakt, zoals immunofluorescentie kleuring van zowel intra-als extracellulaire markers, evenals gedeponeerde extracellulaire matrix eiwitten. Bovendien kunnen transcriptionele analyses van qPCR, flow cytometrie en cellulaire invasie met dit model worden bestudeerd. Hier beschrijven we een protocol van een spheroid-model om de rol van CAFs ' integrine α3β1 te beoordelen en zijn ectopisch gestorte ligand, laminin-332, in differentiatie en ter ondersteuning van de invasie van pancreaskanker cellen.

Inleiding

De tumor micro Environment is een zeer complexe niche en uiterst belangrijk voor het onderhoud en de progressie van de tumorcellen1. Het wordt niet alleen gevormd door de kankercellen, maar ook door stromale fibroblasten. De tumorcellen zijn omgeven door een stroma die specifiek is en verschillend van de stroma van normale weefsels2. Laminine-332 is een extracellulair matrix eiwit ectopisch uitgedrukt in de stroma van verschillende tumoren, zoals pancreas adenocarcinoom3. Bovendien, de biochemische samenstelling van de ECM en ook haar biofysische eigenschappen, zoals stijfheid en spanning, verandering binnen de tumor bulk4. Deze tumor stroma, of "reactieve stroma", wordt veroorzaakt door een aanpassing van fibroblasten aan de naburige kankercellen en door de werving van andere zeer belangrijke spelers die een gunstige en ondersteunende omgeving voor tumorprogressie ontwikkelen. De differentiatie van stromale fibroblasten resulteert in kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF). Deze cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van verschillende markers zoals α-gladde spier actine (αsma)5 of neurale/glial antigeen 2 (ng2)6.

Het meest geschikte in vitro model om de tumor micro Environment (TME) met CAFS te recapituleren is moeilijk te selecteren. De methode voor het nabootsen van fysiologische parameters van de TME op een kostenefficiënte en reproduceerbare manier moet worden overwogen voor een dergelijk modelsysteem. Binnen de TME, verschillende processen, zoals proliferatie, differentiatie, migratie en invasie van de verschillende celtypen optreden. Deze cellulaire processen kunnen individueel worden uitgevoerd met verschillende methoden. Echter, de experimentele omstandigheden moeten rekening houden met de cellulaire interacties met de tumor stroma ECM, aangezien de stijfheid van de substratum invloed op de CAF differentiatieproces. R.G. Wells becommentarieerde de impact van matrix stijfheid op Celgedrag en benadrukte dat cytoskelet organisatie en differentiatie status waargenomen in in vitro gekweekte cellen mogelijk artefeitelijk7. Verschillende stimuli lijken te worden betrokken bij CAF differentiatie, met inbegrip van mechanische spanning5,7. Om dit te voorkomen, kunnen 2D zachte substraten mogelijk benaderingen voor differentiatie studies, als ze het probleem van de stijve cultuur schotel plastic omzeilen. Een zacht 2D-oppervlak, waarop fibroblasten kunnen worden geteeld, kan collageen-I gecoate polyacrylamidegels zijn, waarbij de gelstijfheid kan worden gemanipuleerd door de concentratie van polyacrylamide en de gel cross-linker. De hechting en vorming van αSMA-rijke stress vezels worden versterkt in fibroblasten samen met de gel stijfheid8. Deze resultaten benadrukken het belang van zachte substraat steigers voor meer fysiologische in vitro differentiatie modellen. Echter, in onze handen waren de experimentele reproduceerbaarheid en beeldvorming van deze gels uitdagend. Om deze tekortkomingen te overwinnen, veranderden we het 2D zachte substraat systeem voor een 3D-spheroid-model voor differentiatie en invasie studies. Dit model is meer klinisch relevant en, vergelijkbaar met een in vitro organoïde, aan in vivo celcelinteracties, ECM productie en depositie, evenals Celgedrag9.

Spheroids worden gevormd wanneer cellen een substraat missen om zich aan te houden. Wanneer de cellen worden gelaten zonder een lijm oppervlak, ze aggregeren om een meer of minder sferische structuur te vormen. Als de sferoïden zijn samengesteld uit één type cel, worden ze homo-spheroïden genoemd; Als het bestaat uit twee of meer verschillende celtypen, vormen ze heterospheroids.

Onder de verschillende methoden voor het bereiden van spheroid voeren we het protocol uit met niet-aanhandige ronde bodem 96-well Plates. Het is zeer effectief met betrekking tot de kosten. Hier produceren we zowel homospheroïden van fibroblasten, CAF of CAFs zonder de integrine α3-subeenheid om het differentiatieproces te onderzoeken en heterospheroïden van CAFs of integrine α3 KO CAFs en pancreas cellen van de alvleesklier (AsPC-I en PANC-I) om de invasie te bestuderen in de omringende matrix.

Het doel voor deze studies was het gebruik van primaire CAFs geïsoleerd van menselijke alvleesklier carcinoom biopsies. Echter, de biopsieën om de cellen te verkrijgen zijn schaars en om deze reden, de CAFs gebruikt in deze studies zijn vereeuwigd met behulp van lentivirus met HTERT. Ze heten icafs, en hun normale tegenhangers, primaire menselijke alvleesklier fibroblasten, worden genoemd INFS. De humane alvleesklier fibroblasten en de tumorcellen van de alvleesklier, AsPC-I en PANC-I, zijn in de handel verkrijgbaar.

Dit protocol werd gebruikt om het effect van de interactie laminin-332-integrin in het CAF-differentiatieproces te bestuderen. Om de specificiteit van deze interactie en zijn functie te bewijzen, werden remmer-verbindingen gebruikt: BM2, een monoklonaal antilichaam dat de integrine bindingsplaats de laminin-332 α3 keten10, of lebein 1, een slang Venom afgeleide stof blokkeert die de laminine binding Integrins α3β1, α6β1 en α7β111,12.

Voor de invasie test waren cellen met lentivirus, die cDNA-codering bevatten, ofwel mCherry (iCAFs en integrine α3 KO iCAFs) of GFP (AsPC-I en PANC-I) om de verschillende celtypen in de heterospheroïden te onderscheiden. De transductie van de cellen om ze te vereeuwigen en/of om ze te labelen met een fluorescerende proteïne (mCherry en GFP) expressie wordt beschreven in een eerdere studie13, die moet worden geraadpleegd voor meer informatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1.3D-sferoïden als een in vitro model voor fibroblast/CAF-differentiatie met behulp van verschillende TGF-β1 remmende verbindingen van celmatrix interactie

  1. Meng 1 deel van 6 mg/mL methylcellulose-oplossing en 3 delen celkweek media, MEM aangevuld met 1% van het warmtegeïnactiveerde foetale runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine om de spheroid-formatie oplossing te verkrijgen.
  2. Resubreng vers ontdooide vereeuwigd normale fibroblasten (iNFs), vereeuwigd CAF (iCAFs) of integrine α3β1 KO iCAF (passage tot 25) in de spheroid-formatie oplossing. Bij de bereiding van 1 96 goed plaat, bereid een overmaat van spheroid formatie oplossing, 10 mL en voeg 75.000 cellen, rekening houdend met het bestaan van elke spheroid is samengesteld door 750 cellen, en dat 100 μL worden verdeeld per put van de plaat.
  3. Als cytokines of integrineremmers in de studie zijn opgenomen, voeg deze verbindingen toe aan de celsuspensie om ze tijdens hun vorming in de spheroïden te verankeren. Merk op dat iNFs worden gestimuleerd met 10 ng/mL TGF-β1 om differentiatie te triggeren. Voeg in voorkomend geval remmer-verbindingen toe samen met TGF-β1, zoals 20 μg/mL BM2 of 10 μg/mL lebein 1.
  4. Bereid CAF homospheroids op dezelfde manier, maar zonder de TGF-β1 stimulus, omdat ze zijn al gedifferentieerd. Bereid de integrine α3 KO CAF homospheroids zonder toevoeging van een compound.
  5. Verdeel de spheroid-formatie oplossing op een ronde bodem 96 multi-well plaat door 100 μL van de oplossing in elke put toe te voegen. Elke keer dat de spheroid-oplossing in de putjes wordt verdeeld, meng je goed door meerdere malen op en neer te pipetteren.
  6. Plaats de plaat in de celkweek incubator voor 24 uur zodat één spheroid in elke put kan worden gevormd.
  7. Verzamel de spheroïden na ongeveer 24 uur en gebruik ze voor verschillende downstream-doeleinden: immunofluorescentie kleuring, real-time (RT) q-PCR en flow cytometrie. Om de expressie van intra-en extracellulaire antigenen te detecteren, met inbegrip van de afzetting van ECM-eiwitten binnen de spheroid, gebruikt u immunofluorescentie kleuring. Na desintegratie van sferoïden in afzonderlijke cellen, kwantificeren membraan-verankerde receptor doorstroming cytometrie. Om genactivatie en transcriptionele veranderingen te detecteren, gebruikt u RT q-PCR van mRNA geïsoleerd uit de spheroid-cellen.

2. immunofluorescentie kleuring van sferoïden

  1. Verzamel de spheroïden na ongeveer 24 uur in één 1,5 mL-reactie buis per experimentele aandoening of per te analyseren eiwit. Bijvoorbeeld, plaats de sferoïden van INFS gestimuleerd met TGF-β1 in een buis verschillend van de controle-INFS, die niet werden behandeld. Snijd het uiteinde van de pipetpunt om de opening te vergroten om te voorkomen dat de spheroïden scheuren vanwege te sterke afschuifkrachten. Omvatten ten minste 5-10 sferoïden in één reactie buis, om replicaten toe te staan en rekening te houden met de mogelijke verliezen tijdens de wasstappen.
  2. Centrifugeer de sferoïden met een bench top centrifuge voor ongeveer 30-60 s bij 1.000 x g. Verwijder voorzichtig de methylcellulose-bevattende supernatant door pipetteren, zonder de gepileerde spheroids te verstoren.
  3. Wassen met 50 μL 1x PBS. Herhaal de Centrifugeer stap en verwijder de PBS voorzichtig door pipetteren, zoals beschreven in 2,2.
  4. Afhankelijk van het te bevlekt eiwit, fixeert u met 50 μL van 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (voor αSMA, NG2 en integrine α3β1) of met 50 μL methanol gedurende 10 min bij-20 °C (voor laminine-332 subeenheden).
  5. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3.
  6. Permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton-X in PBS gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.
  8. Inbroed de spheroïden in PBS met 5% FBS en 2% BSA, gedurende 1 uur bij RT om niet-specifieke proteïne-interactie sites te blokkeren.
  9. Incuberen de spheroïden met 30 μL primaire antilichamen in PBS, 2,5% FBS en 1% BSA bij 4 °C 's nachts. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: anti-αSMA CY-3 geconjugeerd en anti-NG2 bij 5 μg/mL; BM2 anti-laminin α3, 6F12 anti-laminin β3 en anti-laminin γ 2 20 μg/mL.
  10. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.
  11. Inbroed de spheroïden met 30 μL secundaire antilichamen in PBS, 2,5% FBS en 1% BSA bij RT gedurende 90 min. De volgende secundaire antilichamen werden gebruikt: Alexa 488 anti-Rabbit en anti-Mouse (5 μg/mL).
  12. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.
  13. Incuberen de cellen met 30 μL DAPI-kleurings oplossing gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
  14. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3.
  15. Plaats de sferoïden op een glazen glijbaan, in een druppel PBS, met een glazen Pasteur pipet.
  16. Beeld de sferoïden door fluorescentiemicroscopie in een laser scanning microscoop met een vergroting van 10x. Neem verschillende optische dwarsdoorsnede van de spheroid op verschillende optische vlakken van een z-stack (15-20 stapel vlakken). Om de laser instellingen in de Microscoop vast te stellen, gebruikt u een spheroid die bestaat uit cellen die negatief zijn voor het antigeen of een spheroid die alleen met het secundaire antilichaam wordt gebeitst. Hergebruik dezelfde instellingen voor alle samples die worden vergeleken.
  17. Analyseer de microscopische beelden met ImageJ-software zoals eerder gepubliceerd14. De stappen worden samengevat in aanvullend figuur 1. Bepaal als achtergrond de geïntegreerde signaal dichtheid van een cel-vrije regio van belang (ROI). Bereken de totale gecorrigeerde celfluorescentie (TCCF) als:
    figure-protocol-1
  18. Bepaal de totale gecorrigeerde fluorescentie (TCF) van de spheroïden als de TCCF genormaliseerd naar het gebied van de spheroid en het aantal stapels.
    figure-protocol-2

3. RT q-PCR van homospheroïden

  1. Om Rt-qPCR uit te voeren, verzamelt u ten minste 288 sferoïden (overeenkomend met 3 96-well-platen) in een reactie buis van 50 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 x g en verwijder voorzichtig de methylcellulose bevattende supernatant door pipetteren zonder de gepileerde spheroids te verstoren.
  2. Was met 1 mL 1x PBS en breng de sferioïden over naar een reactie buis van 1,5 mL. Centrifugeer de sferoïden met een bench top centrifuge voor ongeveer 30-60 s bij 1.000 x g. Verwijder de PBS voorzichtig met pipetteren, zonder de gepileerde-spheroids te storen.
  3. Dissociate de sferoïden met 250 μL van 4 mg/ml Collagenase B, 50 μg/ml DNase I, 2% BSA, 1 mm CACL2 in PBS bij 37 °c gedurende ongeveer 30-45 min door het zachtjes vortexen en pulseren met tussenpozen gedurende een paar seconden elke 5 min.
  4. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 3,2.
  5. Isoleer het totale RNA van de cellen van uiteenvallen sferoïden met behulp van een commerciële RNA Isolation Kit, volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Reverse transcriberen de geïsoleerde mRNA in cDNA met een commerciële Kit, volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Kwantificeer de transcriptie niveaus in replicaten door real-time PCR. De gebruikte primers waren: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, Rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′15; Laminin α3 keten: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 keten: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ Rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2-keten: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ Rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ Rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; integrine α3 subeenheid: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' Rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ Rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
  8. Corrigeer de CT-waarden voor de CT-waarde van een endogeen referentie-gen zoals TOP-1 met behulp van de vergelijking: 2-δδct. ΔΔCt = ΔCt (doel monster) – ΔCt (referentiemonster) en ΔCt = CT van het doel gen of referentie-gen – TOP-I.

4. Flowcytometrie analyse van integrine expressie

  1. Voor Flow cytometrische analyse, verzamelen ten minste 288 sferoïden (overeenkomend met 3 96-well platen) in een 50 ml reactie buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 x g en verwijder de supernatant van methylcellulose met pipetteren voorzichtig.
  2. Was met 1 mL 1x PBS en breng de sferioïden over naar een reactie buis van 1,5 mL. Herhaal de Centrifugeer stap en verwijder de PBS voorzichtig door pipetteren.
  3. Dissociëren van de sferoïden zoals beschreven in stap 3,3.
  4. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 4,2.
  5. Om niet-specifieke binding sites te blokkeren en te voorkomen dat detectie-relevante antilichamen tegen Fcγ-receptoren (CD16, CD32 en CD64) worden gebonden, inbroed de cellen in 100 μL PBS met 2% paarden serum (of serum van een andere diersoort, waarvan de antilichamen niet zullen worden gebruikt in het experiment) en 0,1% BSA gedurende 20 minuten bij 4 °C met rotatie.
  6. In geval van kleuring intracellulaire markers, Fix/permeabilize de cellen zoals beschreven in stap 2.2-2.5.
  7. Inincuberen de cellen met de primaire antilichamen in 100 μL PBS met 2% paarden serum en 0,1% BSA gedurende 30 minuten bij 4 °C met rotatie. Verdun het primaire antilichaam tot 10 μg/mL.
  8. Wassen met 100 μL PBS + 0,1% BSA driemaal, met centrifugeren stappen in de bovenste bank centrifuge bij 1.000 x g daartussenin.
  9. Inincuberen de cellen met de secundaire antilichamen in 100 μL PBS met 2% paarden serum en 0,1% BSA gedurende 30 minuten bij 4 °C met rotatie. Verdun secundair antilichaam tot 10 μg/mL.
  10. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 4,7.
  11. Analyseer 2,0 x 104 bevlekt cellen in een flow cytometer. Poort voor enkele levende cellen via de FSC-SSC dot plot en analyseer de fluorescentie van de gated cellen op het kanaal dat geschikt is voor de geselecteerde fluorophore.

5. invasie test met heterospheroids

  1. Bereid de spheroid-formatie oplossing voor heterospheroïden, die de verschillende celtypen en bijbehorende mediums bevat, zoals samengevat in tabel 1. De cellen waren eerder met lentivirus met vectoren voor mCherry of GFP expressie.
  2. Vul 100 μL van de spheroid-formatie oplossing in elke put van de plaat en bebroed de plaat in de celkweek incubator voor 24 uur, zodat één spheroid in elke put kan worden gevormd.
  3. Bereid 60 μL gelatineuze matrix mengsel met 2 mg/mL rat tail collageen I, 30% van de commerciële gelifying matrix en 2,5 μg/mL laminin-332 in een 1,5 mL reactie buis. Verdeel 15 μL snel in 3 putjes van de μ-Slide angiogenese kamer. Sluit één spheroid in elke put die al de gel bevat.
  4. Pas indien nodig de locatie van de spheroid snel aan het midden van de put aan met een pipet onder de Microscoop.
  5. Herhaal stap 5.2-5.3 voor de volgende heterospheroids en herhaal opnieuw voor de homospheroïden.
  6. Inculeer de gels in de incubator voor 1 uur om te stollen en de gels vervolgens zachtjes met celkweekmedium te bedekken.
  7. Beeld de sferoïden door fluorescentiemicroscopie in een laser scanning microscoop. Neem verschillende optische dwarsdoorsnede van de spheroid op verschillende optische vlakken van een z-stack en op verschillende tijdstippen van invasie (bijvoorbeeld 0 h, 24 h, 48 h en 72 h).
  8. Analyseer de beelden door het aantal binnenvallende kankercellen te tellen. Binnenvallende cellen zijn degene die de spheroid hebben verlaten en het invasieve gebied binnenkwamen. Het invasieve gebied wordt gedefinieerd als het ring gebied tussen de buitenste en binnenste perimeters die worden gegeven door de verste binnenvallende cel en door de spheroid-grens van de spheroid aan het begin van de invasie-experimenten, respectievelijk, zoals uiteengezet in aanvullende figuur 2 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten van dit experimentele ontwerp worden gepubliceerd in Martins Cavaco et al.13, die wordt aanbevolen voor verdere lezing van de conclusies die werden getrokken uit deze experimenten.

Figuur 1, een representatief beeld van een immunofluorescentie-spheroid, toont de immunokleuring van de integrine α3-subeenheid van beide vereeuwigd normale fibroblasten en vereeuwigd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het ontwikkelen van een geschikt in vitro model om CAF-differentiatie te bestuderen is een uitdagende taak. Na het gebruik van verschillende benaderingen concludeerden we dat een 3D-spheroid-model het praktischer, fysiologisch en klinisch relevant model is, waarin het samenspel tussen pancreas carcinoom cellen met vereeuwigd CAFs kan worden bestudeerd. Dit model voorkwam spontane differentiatie van fibroblasten, als gevolg van artefeitelijke stressoren zoals de stijfheid van de celcultuur kunststof, althans in korte-term...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict. Dit materiaal weerspiegelt alleen de standpunten van de auteur en de Europese Unie is niet aansprakelijk voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de daarin vervatte informatie.

Dankbetuigingen

We erkennen de hulp van Barbara Schedding bij het voorbereiden van de BM2 en lebein-1. We erkennen Àgnes Noel voor het delen van haar expertise in spheroid-assays. We danken Sonja Schelhaas en Michael Schäfers voor hun hulp bij het hanteren van linvirale transfectie onder S2-condities. We erkennen Sabine von Rüden's assistentie in het bereiden van CAFs van pancreaskanker weefsel.

Het onderzoek dat tot deze resultaten leidt, heeft financiering ontvangen van het people-programma (Marie Curie-acties) van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie KP7/2007-2013/onder de REA subsidieovereenkomst n ◦ (316610) tot en met J.A.E. Bovendien werd J.A.E. en A.C.M.C. financieel gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen de cellen-in-Motion cluster of Excellence (EXC 1003-CiM). Dit project werd ook gesteund door Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)SIGMA-ALDRICHD9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal)Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal)Vriendelijk verstrekt door Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
AcetonSIGMA-ALDRICH32201
Albumine Fraction V - BSAAppliChemA1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-MouseInvitrogenA11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) RabbitInvitrogenA11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal)Santa Cruzsc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320MilliporeAB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)SIGMA-ALDRICHC6198
AsPC-1 cel lijnATCCVriendelijk gegeven door prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifugeFisher Scientific50-589-620Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal)Vriendelijk verstrekt door Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2)Fluka21074
CentrifugeThermo ScientificMultifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mLCorning430290
Collagenase BRoche11088831001
Collagen-I, rat tailGibcoA10483-01
Confocal microscopeZeissLSM 700 and 800
DMEM (Hoge glucose 4,5 g/L)LonzaBE12-604F
Dnase IRoche10104159001
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburTM
Geleefde matrixThermoFisher ScientificA1413202Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotypeDAKOX 0907
Paarden serumSIGMA-ALDRICH12449-C
Human Primary Pancreatic FibroblastsPELOBiotechPB-H-6201
IncubatorHeraeusB6060
Laminine-332BiolaminaLN332
MEMSIGMA-ALDRICHM4655
Microplate, 96 wells, U-bottomGreiner Bio-One650101
Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Mouse IgG, isotypeSIGMA-ALDRICHI8765
Multi as draaiende mixerCATRM5 80V
PANC-IATCCVriendelijk gegeven door Prof. Jorg Haier's Lab
ParaformaldehydeRiedel-de Haën16005
Penicilline/streptomycineGibco15140-122
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205310
Rat IgG, isotypeInvitrogen10700
Reactiebuisjes, 1,5 mLGreiner Bio-One616201
Real-time PCR cyclerQiagenRotor-Gene Q
RNeasy Mini KitQiagen74104
Rotor Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074
RPMILonzaBE12-702FVoeg glucose toe aan 4,5 g (0,2 um filter) en 1% natriumpyruvaat
TritonX-100SIGMA-ALDRICHX100RS
VórtexScientific IndustriesVortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, ongecoatIbidi81501

Referenties

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355(2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14(2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D sfero demodelIntegrine Alpha3 Beta1Laminine 332sfero devormingimmunofluorescentiekleuringqPCR analyseflowcytometriecellulaire invasieparaformaldehyde fixatie

Gerelateerde artikelen