Oprichting van een ernstig droog Oogmodel met volledige Dacryoadenectomie bij konijnen

Summary

Een nieuwe aanpak wordt gepresenteerd voor het opwekken van chronische droge ogen ziekte bij konijnen door chirurgisch verwijderen van alle orbitale traanklieren. Deze methode, die verschilt van de eerder gerapporteerde, produceert een stabiel, reproduceerbaar model van waterige deficiënte droge ogen dat goed geschikt is voor het bestuderen van scheur fysiologie en pathofysiologie en oculaire therapieën.

Abstract

Droge ogen ziekte (DED) is een complexe ziekte met meerdere etiologieën en variabele symptomen, met een oculaire oppervlakte ontsteking als de belangrijkste pathofysiologisch stap. Ondanks vooruitgang in ons begrip van DED, blijven er aanzienlijke kennislacunes bestaan. Voorschotten zijn deels beperkt vanwege het gebrek aan informatieve diermodellen. De auteurs onlangs gemeld op een methode van DED geïnduceerd door het injecteren van alle orbitale traanklier (LG) weefsels met de lectine concanavalin A. Hier rapporteren we een nieuw model van waterige-deficiënte DED op basis van de chirurgische resectie van alle orbitale LG (dacryoadenectomie) weefsels. Beide methoden gebruiken konijnen vanwege hun gelijkenis met menselijke ogen in termen van de grootte en structuur van het oogoppervlak. Een week na verwijdering van de nictitating membraan, de orbitale superieure LG werd chirurgisch verwijderd onder anesthesie, gevolgd door verwijdering van de ooglid superieure LG, en ten slotte verwijdering van de inferieure LG. dacryoadenectomie geïnduceerde ernstige, bewezen door een duidelijke reductie van de scheur tijd test en de scheur test van Schirmer, en significant toegenomen scheur osmolariteit en Rose Bengal kleuring. Dacryoadenectomie-geïnduceerde DED duurde ten minste acht weken. Er waren geen complicaties en dieren getolereerd de procedure goed. De techniek kan relatief gemakkelijk worden beheerst door mensen met adequate chirurgische ervaring en waardering van de relevante konijnen anatomie. Aangezien dit model de kenmerken van de menselijke waterige deficiënt samenvult, is het geschikt voor studies van oculaire oppervlakte homeostase, DED, en kandidaat-Therapeutics.

Introduction

Tranen zijn nodig voor de bescherming van het oogoppervlak en voor het onderhoud van de optische eigenschappen van het hoornvlies. Ze bestaan uit drie lagen: een binnenste mucine-coating, een middelste waterige component en een lipide-overlay¹. De mucine-laag wordt voornamelijk geproduceerd in beker cellen van het bindvlies, de waterige component voornamelijk in de traanklieren (lgs), en de lipidenlaag voornamelijk in de meibomische klieren^1,2. De orbitale LGs zijn de belangrijkste bron voor de waterige component van tranen en voor veel van de eiwitten die het oppervlak beschermen tegen bacteriële aanval³. Oculaire oppervlakte ziekten ontstaan wanneer de waterige traanproductie lager is dan een kritisch niveau, waardoor de epitheliale oppervlakken van het oog van de waterige component en cruciale scheur bestanddelen, waaronder groeifactoren, lysozym en lactoferrin, worden ontnomen. In gevallen van verminderde traanproductie door de LGs ondergaan de conjunctivale en cornea weefsels aanpassingen om de veranderde omgeving te compenseren.

Het begrijpen van de bijdrage van de scheur component afgeleid van de orbitale LGs en de compenserende mechanismen van het oogoppervlak wanneer dit ontbreekt, beïnvloedt onze waardering van de Fysiologie en pathofysiologie van het voorste segment van het oog en, meer in het algemeen, van gezondheid en ziekte in de hele wereld. De experimentele aanpak van deze kwesties vereist een informatief diermodel. Daarom hebben verschillende groepen geprobeerd om diermodellen te ontwikkelen waarin de orbitale LGs worden verwijderd, waardoor de beoordeling van de rol van tranen in de ooggezondheid wordt vergemakkelijkt. Een dergelijk model werd onlangs gerapporteerd voor de muis⁴. Het konijn biedt echter veel duidelijke voordelen ten opzichte van knaagdieren modellen, met inbegrip van soortgelijke anatomische en histologische structuren van de LG, en misschien nog belangrijker, vergelijkbare grootte en oppervlakte van het hoornvlies en conjunctivale weefsels in vergelijking met hun menselijke tegenhangers³.

Creatie van waterige deficiënte droge ogen ziekte (DED) door chirurgische resectie van LG weefsel bij konijnen is niet nieuw. Talrijke rapporten beschrijven resectie van LG weefsels met wisselend succes weerspiegeld in variabele veranderingen in de scheur productie gemeten door de schirmer's Tear test^5,6,7,8. Een grondig begrip van de relevante anatomie van het konijn en duidelijkheid over de anatomische terminologie zijn zeer nuttig bij het reproduceren van deze methode. Hieronder vindt u een grondig overzicht van beide.

Anatomie van de traanklieren

Het konijn heeft twee orbitale LGs: de grotere inferieure LG (ILG) en de kleinere superieure LG (SLG; Figuur 1). De ILG strekt zich uit langs het minderwaardige en posterieure aspect van de orbitale rand. Met uitzondering van de variabele grootte, heeft het voorste deel van de ILG een vrij uniforme bolvormige verschijning die kan worden gezien als een knobbel in de huid onder de aardbol (Figuur 2). Vanwege zijn karakteristieke verschijning ten opzichte van de rest van de klier, wordt het aangeduid als het "hoofd" van de ILG. Een deel van het hoofd wikkelt rond en ligt op het buitenoppervlak van het zygomatische bot. Dit dient als een nuttige oriëntatiepunt op ultrasone biomicroscopie om injecties in de ILG te begeleiden. De rest van het hoofd bevindt zich meer mediaal⁹ in de baan.

Vanwege het karakteristieke uiterlijk van het overgebleven deel van de ILG, dat lang en dun is, wordt dit segment de "staart" genoemd. De staart loopt langs de onderste rand van de orbitale, van het hoofd van de ILG naar de orbitale rand waar het eindigt met variabele anatomie aan de inferieure en achterste orbitale rand (Figuur 3A). De staart ligt diep (mediaal) aan het zygomatisch bot, gescheiden van de orbitale inhoud door een fasciale band voor het grootste deel van zijn loop, totdat het de achterste rand van de baan bereikt, waar het zich opnieuw uitstrekt over het buitenoppervlak van het zygomatische bot. De ILG ontvangt zijn bloedtoevoer uit takken van de halsslagader.

De SLG heeft twee componenten analoog aan de mens. Een daarvan is de palpebrale superieure LG (PSLG), die zich in het bovenste posterieure ooglid mediale aan de tarsale plaat bevindt. Het lijkt bolbaar van aard en heeft talrijke punctata openingen die waterige scheur vloeistof afvoeren die gemakkelijker te zien is wanneer bedekt met 2% fluoresceïne (Figuur 3B).

De tweede is de orbitale superieure LG (OSLG), woonachtig in een mediale positie in de superieure baan (Figuur 3C). Vanwege zijn positie in de buurt van de middellijn van de schedel, is het onmogelijk geweest om het met succes te identificeren met behulp van externe chirurgische benaderingen van de temporale of inferieure baan. In verse obductie monsters of chirurgische gevallen kan deze klier worden doorgeproteseerd door de posterieure incisure gelegen in het rugoppervlak van de schedel wanneer zachte mediale druk wordt uitgeoefend op de aardbol. Verzakking van dit klierweefsel kan worden gedocumenteerd met ultrasone biomicroscopie.

De PSLG en OSLG zijn aaneengesloten structuren. De oslg is een tubuloalveolaire structuur waarvan de ductale architectuur stoffelijke in de belangrijkste excretie kanaal. Dit kanaal passeert onder de supra-orbitale Ridge en loopt in de bovenste deksel weefsels eindigend in de PSLG. Langs het uitscheidingskanaal is het klierweefsel in overeenstemming met de oorspronkelijke beschrijvingen van Davis geïdentificeerd¹⁰ (Figuur 3D).

Een opmerking over terminologie

Uitstekende en uitgebreide anatomische beschrijvingen gebruiken ook verschillende terminologie. De klassieke orbitale anatomie van Davis definieert alleen een bovenste en onderste LG¹⁰. Echter, zijn beschrijving van de bovenste LG duidelijk details van de porties meer specifiek gedefinieerd hier als de PSLG en OSLG, terwijl zijn beschrijving van de lagere LG Details van de porties gedefinieerd hier als het hoofd en de staart van de ILG. Een recentere en grondige anatomische Atlas¹¹ definieert deze weefsels als de zygomatische klier en het accessoire LG. De term "traanklier" wordt hier gebruikt om de bovengenoemde PSLG en OSLG te omvatten. Deze terminologie is beter geschikt voor het reproduceren van deze methode zonder onnodige verwarring.

Protocol

Alle studies met gewervelde dieren werden voltooid in overeenstemming met en naleving van alle relevante regelgevende en institutionele richtlijnen. Alle studies werden goedgekeurd door de institutioneel beoordelings Raad van Stony Brook University en uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van de vereniging voor onderzoek in visie en oogheelkunde (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en Vision onderzoek.

1. dieren en huisvesting

1. Gebruik Nieuw-Zeelandse witte (NZW) konijnen met een gewicht van 2 − 3 kg.
2. Huis konijnen individueel in een streng gecontroleerde omgeving: temperatuur (65 ± 5 °F), vochtigheid (45 ± 5%), en verlichting (12 h aan/uit cyclus).
   Opmerking: als gevolg van agressief gedrag dat vaak wordt tentoongesteld tussen konijnen die zijn ondergebracht in een groep, houdt u dieren in individuele kooien om onbedoelde oogletsel te voorkomen.
3. Geef konijnen onbeperkte toegang tot standaard konijn Chow en water.
4. Voorzie geen andere voedings enrichments om onbedoelde vitamine A-suppletie te voorkomen die van invloed kan zijn op het droge oog.
5. Acclimate konijnen ten minste twee weken voor de opname van de parameters.

2. verwijdering van het nictitating-membraan

Opmerking: voor de eenvoud wordt de techniek voor het rechteroog hieronder beschreven. Voltooi deze procedure op een identieke manier op het linker oog.

1. Verwijder het nictitating-membraan bilateraal tijdens de acclimatieperiode (meestal de eerste week).
2. Plaats konijn in een passend formaat fixining tas.
3. Dien een subcutane injectie van Acepromazine (1 mg/kg) over de schouders toe met behulp van een spuit van 1 CC en een naald van 26 G om het konijn te sedateren. Het eindpunt voor deze milde sedatie is wanneer het dier een ontspannen hoofdpositie behoudt zonder normale scan bewegingen en de oren zijn niet meer volledig rechtop.
4. Gebruik een micro pipet en breng 25 μL conserveringsmiddelen vrij lidocaïne (1%) naar het oog. Plaats een draaddeksel speculum tussen de oogleden.
5. Pak het nictitating membraan op zijn Apex met 0,3 Tang (of gelijkwaardig) en trek het over het hoorbare oppervlak. Injecteer 1% lidocaïne met 1:100000 epinefrine in de subconjunctivale ruimte van de nictitating membraan met behulp van een 26 G naald. Injecteer ongeveer 0,3 mL om een bescheiden-sized bleb te vormen over het nictitating membraan. Injectievolumes van meer dan 1 mL zijn goed binnen een veilig doseringsbereik voor konijnen (2 − 4 mg/kg).
6. Verwijder de draad speculum. Wacht ongeveer 5 minuten voor de lidocaïne en adrenaline te activeren. Voer gedurende deze periode dezelfde procedure uit in het collega-oog.
7. Vervang de draad deksel speculum. Pak en verleng het nictitating-membraan over het corneale oppervlak met behulp van de 0,3-Tang. Snijd het membraan op de basis met tenotomie schaar of gelijkwaardig.
   Opmerking: bloeden is meestal minimaal, maar houd een hoge temperatuur accu cauterisatie unit in de buurt en gebruik zo nodig om bloeden te minimaliseren. Directe druk over de snij basis van het nictitating-membraan kan ook worden gebruikt om kleine bloedingen te stoppen als deze zich voordoen.
8. Verwijder het draad deksel speculum. Plaats actuele antibioticum zalf (neomycine, Polymyxine, bacitracine en hydrocortison) over het corneale oppervlak.
9. Een identieke procedure uit te voeren naar het collega-oog zoals aangegeven in het protocol.
10. Plaats de dieren terug in afzonderlijke kooien en laat ze gedurende ten minste één week genezen, of totdat het conjunctivale oppervlak volledig is genezen vanuit klinisch oogpunt, voordat u verdere testen of interventies uitvoert.
    Opmerking: volledige klinische genezing wordt aangegeven door een gebrek aan zwelling, injectie of afscheiding uit de conjunctivale oppervlakken. Dieren moeten hun ogen normaal open houden, zonder de aanwezigheid van beschermende ptose.

3. meting van droge ogen parameters en verzameling van scheurmonsters

1. Meet de volgende parameters, afhankelijk van het experimentele Protocol: scheur osmolariteit, Tear break-up tijd, Schirmer's Tear test, en Rose Bengal kleuring. Voer ze uit zoals eerder beschreven¹², met een team van ten minste twee onderzoekers.
   Opmerking: een team van ten minste twee onderzoekers zorgt voor de efficiënte meting van grotere groepen dieren (6 of meer) rond dezelfde klok tijd, waardoor mogelijke circadiane variatie geen invloed heeft op de resultaten.

4. chirurgische voorbereiding en anesthesie

1. Licht bezadigd dieren geplaatst in een fixatie zakje met subcutane Acepromazine zoals hierboven (1 mg/kg).
2. Verwijder alle vacht op het gezicht en het rugoppervlak van de schedel om de chirurgische monumenten te visualiseren.
   1. Trim vacht met snij scharen die rest fijn bont achterlaten met een lengte van ongeveer 1 mm (Figuur 4A, links).
   2. Verwijder alle overblijvende vacht met behulp van milde onthardings crème volgens de instructies van de fabrikant (Figuur 4A, rechts).
3. Markeer chirurgische incisie sites met een chirurgische pen.
   1. Identificeer de incisieplaats over de posterieure incisure door het toepassen van mediale druk op de aardbol waardoor een kleine buiging te ontwikkelen in de huid over de posterieure incisure van verzakking van de oslg.
   2. Maak een lineaire 2 cm-markering in de voorste/achterste richting op de huid over het rugoppervlak van de schedel direct over deze plaats met een chirurgische markerings stift.
   3. Bij het plannen van de incisie voor het verwijderen van de ILG, Markeer een lange, curvilinelaire lijn rond het oog (1 cm van de inferieure en temporele deksel marge) die zich uitstrekt van de achterste (temporele) baan naar de voorste (mediale) Canthus. Zorg ervoor dat de markering zich uitstrekt langs de achterste baan tot het niveau van de mediale Canthus of gewoon superieur is aan deze (Figuur 4B). In sommige dissecties, de incisies te verwijderen van de OSLG en de ILG zal worden aangesloten.
      Opmerking: Markeer beide banen op dit moment bij het uitvoeren van bilaterale chirurgie.
4. Trim een pleister van bont 2 tot 3 cm breed met scharen over het laterale oppervlak van elke dij om plaatsing van een monopolaire cauterie plaat toe te staan.
   1. Breng ultrasone gel aan om goed elektrisch contact te garanderen met de monollaire cauterie plaat.
5. Plaats een 25 G intraveneuze (IV) katheter in een van de marginale aders van het oor om zo nodig medicatie of vocht te toedienen.
6. Geef subcutaan xylazine (1 mg/kg) en I.V. ketamine (15 mg/kg) voor de initiële inductie van anesthesie (via de I.V.-toegang).
   Opmerking: als het konijn van tevoren met Acepromazine voldoende wordt verdoofd om het in stap 2,3 beschreven eindpunt te behouden, gebruik dan een gasmasker sedatie met Isofluraan als alternatief.
7. Plaats een larynxmasker luchtweg gehouden op zijn plaats met behulp van een elastische band of string te beveiligen en onderhouden van de luchtweg.
   1. Sluit het masker aan op de anesthesie machine met zuurstof stroom ingesteld op 1 L/min.
   2. Stel de Isofluraan op 5% in eerste instantie en vervolgens verminderen als getolereerd op basis van het niveau van dierlijke sedatie.
   3. Houd Isofluraan op of boven 2% tot de laatste wondsluiting.
      Opmerking: Evalueer het niveau van sedatie door monitoring van de ademhalingsfrequentie en bewegingen als reactie op chirurgische of pijnlijke stimuli. Verhoog de diepte van de anesthesie als de ademhalingsfrequentie stijgt boven 10 ademhalingen per minuut, als het konijn begint te kauwen op de luchtwegen Maintainer, of als er bewegingen in reactie op pijnlijke stimuli worden waargenomen.
8. Monitor Pulse oximetrie, capnografie, bloeddruk, rectale lichaamstemperatuur en hartslag met behulp van een Multi-parameter bewakings apparaat of andere geschikte apparaten.
   1. Bewaak Vitals continu tijdens de procedure en noteer elke 10 tot 15 minuten.
9. Plaats het konijn op de operatiekamer (of) tafel over een verwarmingspad om hypothermie te voorkomen. Kantel de tafel in een omgekeerde Trendelenburg positie bij ongeveer 30 ° om bloedingen te minimaliseren.
10. Bereid het chirurgische gebied met een Povidon-jodiumoplossing verdund tot half-sterkte met steriel water en draperen om een steriel veld te behouden.

5. volledige chirurgische dacryoadenectomie

Opmerking: de volledige chirurgische dacryoadenectomie, zoals hierin beschreven, werd gedaan met behulp van 0,3 weefsel Tang, tenotomie schaar, niet-getande weefsel Tang en schaar. Deze instrumenten kunnen worden afgewisseld met soortgelijke instrumenten die dezelfde functie vervullen op basis van de voorkeur van de chirurg.

1. Verwijder eerst de OSLG.
   1. Infiltreren de incisie sites (chirurgische markering pen lijnen en bovenste posterieure deksel) met een 50:50 mengsel van 2% lidocaïne met 1:100000 epinefrine en 0,5% de met behulp van een 5 CC spuit met een 30 G naald (Figuur 5a).
      Opmerking: spuit en naald grootte zijn niet kritisch.
   2. Gebruik een Colorado naald aangesloten op een elektrochirurgische eenheid te maken van de huid incisies langs de chirurgische markeringen. De instellingen kunnen variëren afhankelijk van de klinische respons en zijn meestal tussen de 10 en 15 eenheden voor zowel knippen als coagulatie (Figuur 5B).
   3. Breng tegengestelde spanning over de huid incisie om de weefsels te scheiden en bloot de onderliggende frontoscutularis spiervezels.
   4. Breng mediale druk op de wereld om de visualisatie van de OSLG te helpen, gezien als uitpuilende weefsel gelegen net mediaal of diep naar de frontoscutularis spiervezels. Indien nodig, verplaats deze spiervezels naar de zijkant om de onderliggende incisure bloot te leggen.
   5. Met getande Tang (0,3) en capsulotomie-schaar wordt de vezelige capsule voorzichtig teruggetrokken en gesneden, boven de OSLG. De OSLG heeft meestal een bleke bruine kleur (Figuur 5C).
   6. Gebruik de getande of niet-getande Tang, pak het OSLG klierweefsel en trek het voorzichtig uit door de superieure snijkracht met behulp van een "hand-over-hand" techniek. Snijd kleine, vezelige bands met behulp van capsulotomie schaar om de klier vrij te maken van zijn positie in de baan (Figuur 5D).
      Opmerking: als de OSLG klierweefsel wordt verwijderd, het zal beginnen te Coalesce in een grote buis-achtige structuur (hoofd excretie kanaal).
   7. Wanneer de klier is verwijderd zo volledig mogelijk, gebruik royale cauterie met de Colorado naald te maken weefsel char, afkappen van de klier binnen het snijpunt zo diep mogelijk. Dit zal later dienen als een bevestigende oriëntatiepunt tijdens het verwijderen van de PSLG.
2. Verwijder de PSLG.
   1. Evert het bovenste ooglid met behulp van een met katoen getipt applicator. Het bolachtige uiteinde van de PSLG is meestal gemakkelijk zichtbaar.
      Opmerking: in sommige anatomische dissecties kan het mogelijk zijn om de belangrijkste uitscheidings buis te visualiseren als een bleke lineaire structuur van ongeveer 1 of 2 mm breed.
   2. Neem contact op met de PSLG met getande Tang (0,3) en trek het van het ooglid aan terwijl u de capsulotomie-schaar gebruikt om de basis ervan te scheiden van de onderliggende Tarsus (Figuur 6A).
   3. Regelmatige bloeding met het monopolaire cauterie.
   4. Breng continue tractie op het afgescheiden weefsel aan om een weefsel vlak voor dissectie te behouden. Hierdoor kan het hoofd uitscheidingskanaal van de SLG ook worden verwijderd (Figuur 6B).
      Opmerking: als het dissectie wordt uitgevoerd, zal het meestal doorgaan naar de superieure orbitale rand, waar het mogelijk is om de oormerken achtergelaten te zien van het verwijderen van de meer superieure en mediaal gelegen OSLG.
3. Resect de ILG.
   1. Laat minstens 5 minuten toe om de plaatselijke verdoving in werking te laten gaan.
   2. De huid, de depressieve spier van de inferieure palpebra, het zygomaticolabiale deel van de zygomatische spier en orbicularis spier met de Colorado micro dissectie naald, scheiden als voor de OSLG in punt 5,1.
   3. Onderhouden van hemostase met de monopolaire cauterie.
   4. Als de incisie dieper door de huid markering wordt gedragen, zoekt u de glans van een fasciaal vlak over het zygomatisch bot of oppervlakkige deel van de spier van de kauw. Op dit punt, handhaven van het weefsel vlak en dragen het bovenzijde naar de orbitale rand met behulp van de Colorado naald voor het snijden (Figuur 7A).
      Opmerking: voor het identificeren van de ILG is het het gemakkelijkst om dit deel van de dissectie uit te voeren over het hoofd van de ILG, dat typisch inferieur is aan de voorste limbus van het oog.
   5. Na het identificeren en gebeuren van de capsule rond de ILG, identificeren van de Tan weefsel van de ILG. Alleen het voorste gedeelte van de ILG-kop zal zichtbaar zijn (Figuur 7B). Echter, het hoofd kan worden gevolgd mediaal als het passeert onder de zygomatische boog en overgangen in de staart (Figuur 7C).
   6. Gebruik tenotomie-schaar om het orbitale septum te knippen langs de inferieure rand die het achterste deel van de ILG-staart bloot. Zodra het weefsel vlak is geïdentificeerd, verlengt u de dissectie posteriorly langs de gehele incisie lijn (Figuur 7D).
      Opmerking: het kanaal van de ILG passeert door de lagere vezelgebonden bindweefsels om de inferieure conjunctivale ruimte in het temporele aspect van het deksel in te voeren. Aan de achterste rand kan de staart van de ILG verschillende anatomische configuraties hebben. Soms eindigt het inferieur aan de achterste (laterale) Canthus, terwijl in andere dissecties het meer bovenzijde rond de stoffelijke baan uitbreidt.
   7. Gebruik uiterste zorgvuldigheid om onbedoelde schade aan de bloedtoevoer te voorkomen, die de ILG ontvangt van takken van de halsslagader. De bloedtoevoer kan worden gezien tijdens dit deel van de sectie (Figuur 7E).
   8. In gevallen waar de staart eindigt onder de achterste (laterale) Canthus, kan het nodig zijn om het temporale gedeelte van de frontoscutular spier te doorsnijdt om de staart van de ILG, die langs het zygomatische bot ligt bloot te leggen.
   9. Nadat de hele ILG is geïsoleerd en blootgesteld, verwijder deze. Door zijn grote omvang is het vaak de voorkeur om de klier in tweeën te knippen met een schaar en het hoofd los van de staart te verwijderen.
   10. Ga heel voorzichtig te werk bij het verwijderen van het hoofd van de ILG, omdat het direct grenst aan een grote veneuze sinus in de baan. Hoewel bloeden uit deze structuur tijdens chirurgische resecties is niet opgetreden, hebben voldoende hemostatische hulpmiddelen aanwezig om dit risico te beperken.
   11. Na verwijdering van alle klierweefsel, sluit het diepe bindweefsel vlak met meerdere onderbroken 5-0 ethyleen tereftalaathechtingen. Sluit de oppervlakkige spieren en de huid met een running 6-0 polyglactin 910 hechtmiddel (Figuur 7F) met behulp van 0,3 weefsel Tang en een naald bestuurder.

6. postprocedurele zorg

1. Undrape de dieren en reinig de chirurgische plaatsen met steriel water.
2. Pas actueel oftalmisch antibioticum en steroïde zalf (neomycine, Polymyxine, bacitracine, en hydrocortison) aan de incisies. Doorgaan met deze toepassing twee keer per dag voor 2 dagen.
3. Geef een subcutane injectie van 20 mL normale zoutoplossing over de schouderbladen met een 26 G naald.
4. Geef subcutane buprenorfine 0,01 mg/kg of ketoprofen 3 mg/kg voor pijnbestrijding met behulp van een 1 cc spuit en 30 G naald.
   Opmerking: dieren moeten terugkeren naar hun normale inname en activiteiten binnen 1 − 2 dagen. Konijnen moeten ten minste wekelijks worden geëvalueerd op klinische verschijnselen van infectie, zoals blijkt uit progressieve zwelling, pijn, erytheem, calor of etterende afscheiding over de incisie-sites. Dieren moeten ook worden nageleefd om ervoor te zorgen dat ze niet beginnen te krabben de incisie plaatsen/hecht lijnen. Het trimmen van alle klauwen voorafgaand aan dacryoadenectomie kan in dit verband nuttig zijn. Als krassen op de incisie lijnen wordt waargenomen, kunnen standaard beschermende halsbanden worden gebruikt om zelfverwonding te voorkomen.
5. Omgekeerde de anesthesie.
   1. Verwijder de luchtwegen onderhouder nadat het dier reageert op stimuli en begint te spontaan kauwen weergeven, maar voordat de luchtvracht schip kan worden beschadigd.
   2. Bewaak dieren gedurende ongeveer 1 − 2 uur of totdat ze volledig zijn hersteld van anesthesie, zoals blijkt uit spontane bewegingen in hun kooien.
   3. Beoordeel dieren op pijn en behandel ze op gepaste wijze.
6. Laat dieren gedurende ten minste 1 week na de operatie herstellen voordat er klinische maatregelen van DED worden gedaan.

Results

De volledige dacryoadenectomie-methode die hier wordt beschreven, werd uitgevoerd op 8 dieren. Het vereist een gematigde graad van chirurgische vaardigheid. Chirurgische tijd gemiddeld ongeveer 2,2 h voor bilaterale chirurgie, met uitzondering van de verwijdering van de nictitating membraan, die afzonderlijk werd gedaan en vereist < 10 minuten. Er waren geen dodelijke ongelukken of intraoperatieve complicaties en geen konijn vereiste hemostatische hulp anders dan bescheiden cauterie.

Onze chirurgische aanpak heeft met succes het droge oog in alle ogen geïnduceerd. Dit werd bevestigd door een panel van klinische en laboratorium markers van DED (tabel 1). Tijdens de 8 weken van observatie, de gemiddelde TBUT werd onderdrukt door meer dan 75% van de preoperatieve niveaus (p < 0,0001 voor alle tijdspunten). Evenzo daalde de scheur test van de Schirmer met ongeveer 50%, nog in de 8 weken van observatie; het toonde geen trend voor herstel tijdens de follow-up periode. Postoperatief toonde scheur osmolariteit een stijging van 10% consistent met DED, gedurende ten minste 8 weken na de operatief. Rose Bengal kleuring van het hoornvlies ook verhoogd en niet tekenen van herstel vertonen tijdens de 8 weken van follow-up (Figuur 8). Alle ogen die een volledige dacryoadenectomie ondergaan toonden een duidelijke afname van de celaantallen van de Goblet en epitheliale veranderingen consistent met droge ogen (conjunctivale impression cytologie).

Figuur 1: konijn lacrimale klier anatomie (rechter oog). De orbitale superieure traanklier (OSLG) bestaat uit een groter orbitaal deel en een kleinere palpebrale component. De grotere inferieure traanklier (ILG) bestaat uit de voorste/hoofd en posterieure/staart porties. Coördinaat assen tonen de terminologie die wordt gebruikt voor alle beschrijvingen van de oriëntatie die in de tekst wordt gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: plaats van het hoofd van de ILG. De laterale weergave van het rechter gezicht na verwijdering van de vacht. Een buiging in de huid contour (aangegeven door dikke pijlen) inferieur aan de voorste baan geeft de locatie aan van het hoofd van de ILG dat op het buitenoppervlak van het zygomatische bot op deze plaats ligt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: de orbitale traanklieren. A) de rechter inferieure traanklier (ILG) na kleuring met Evans Blue Dye toont de nabijheid van de staart van de ILG (rode pijl) gewoon mediaal naar het zygomatische bot (zwarte pijl) en inferieur aan de aardbol. B) de productie van scheuren uit de palpebrale superieure traanklier (PSLG). Timelapse-Foto's genomen na topische toepassing van 2% fluorescein. Waterige vloeistof afkomstig van de pslg verdunt de aanvankelijk donker blauwe of zwarte fluoresceïne kleurstof draaien het fel geel groen (vergelijkbaar met Seidel testen). C) positie van de ORBITALE SLG (oslg) in de schedel van het konijn, gelegen dicht bij de middellijn van de schedel (gestippelde lijn) binnen de posterieure incisure (pijl). Evans Blue Dye werd geïnjecteerd in de OSLG en palpebrale superieure traanklier. D) histologie sectie door het hoofd uitscheidingskanaal van de OSLG omgeven door een kleine hoeveelheid klierweefsel (Arrow) wordt gezien in deze histopathologische dwarsdoorsnede gekleurd met HEMA oxylin en eosine kleurstoffen genomen door het achterste (temporele) aspect van het bovenste rechter ooglid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: voorbereiding van de chirurgische plaats. (A) linker paneel: verwijdering van lange vacht met scharen. Alle resterende fijne vacht wordt vervolgens verwijderd met een milde onthardings crème. Bovenste rechter paneel: laatste verschijning na volledige vacht verwijdering die het mogelijk maakt voor chirurgische markering en hoge kwaliteit echografie van de ILG worden uitgevoerd. B) er worden geschikte chirurgische markeringen van de rechter periorbitale regio getoond; in dit voorbeeld, de incisies te verwijderen van de oslg en ILG zijn verbonden aan een lange kromlijnige incisie te maken. De locatie van de posterieure incisure wordt aangegeven door een kleine hash-markering op de curvilinelaire incisie site markering (pijl). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: verwijdering van de OSLG. (A) chirurgische sites worden geïnfiltreerd met verdoving met behulp van een 50:50-combinatie van 2% lidocaïne met 1:100000 epinefrine en 0,5% bupivacaine, die in de bovenste deksel en langs de incisie lijnen wordt geïnjecteerd om ongemak tijdens de procedure te minimaliseren. B) een Colorado-micro dissectie naald wordt gebruikt om de huid en oppervlakkige spier lagen langs de vooraf gemarkeerde locaties van de chirurgische incisie te verdrijven. Zachte tractie over de wond wordt toegepast om het dissectie vlak te helpen creëren. De kleine lokaliseren brandwonden (pijl) werden gemaakt met de Colorado naald op gelijke afstand punten langs de incisie lijn om optimaal te helpen de weefsels tijdens de wondsluiting. C) de OSLG wordt blootgesteld nadat de weefsels zijn gemobiliseerd (Arrow). De capsule van de klier is ingesneden. De oslg kan worden verzakte door het toepassen van mediale druk op de aardbol vergemakkelijken van de verwijdering ervan. D) de Tang wordt gebruikt om de OSLG in te schakelen en voorzichtig uit zijn diepere positie in de baan te verwijderen door de posterieure incisure. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: verwijdering van de palpebrale superieure traanklier (PSLG) en excretie kanaal. A) na de eversie van het bovenste ooglid wordt het bolachtige deel van het PSLG met een tang verteerd en met een schaar uit de Tarsus gedissneden. De tractie op de PSLG met een tang is cruciaal voor het behoud van het chirurgische vlak. B) de dissectie van het PSLG en het hoofd traan kanaal worden overheerst naar de orbitale rand met behulp van scherpe dissectie en continue tractie op de klier en duct weefsels om het juiste chirurgische vlak te behouden. Het dissectie moet overgaan tot het punt waar de OSLG werd verwijderd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: verwijdering van de ILG. A) de huid en de oppervlakkige spier massa worden ingesneden totdat het fasciale vlak boven het zygomatische bot of het oppervlakkige deel van de spier van de kauw is bereikt. Het hoofd van de ILG is meestal duidelijk zichtbaar als een kleine bobbel onder de voorste limbus. B) de vezelloze capsule van de ILG wordt ingesneden met een schaar die de ILG bloot maakt. Zodra de capsule is ingesneden, kunnen de diepere delen van de klier gemakkelijk worden verwijderd. C) het meest externe gedeelte van de ILG-kop dat op het zygomatische bot ligt, is blootgesteld en weerspiegeld in anterieure waaruit het onderliggende zygomatische bot blijkt. D) insnijding van het orbitale septum langs de onderste rand onthult de staart van de ILG. E) een tak van de uitwendige halsslagader voedt de staart van de ILG (pijl). F) uiterlijk na de afsluiting van huid incisies na volledige dacryoadenectomie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: Rose-Bengaalse kleuring van het corneale oppervlak. Externe foto met prominente kleuring, meest opvallende op het nasale Kwadrant. Alle ogen ondergaan volledige dacryoadenectomie ontwikkelde soortgelijke veranderingen die duidelijk waren door 1 week na de operatie en persistent gemaakt voor ten minste 6 weken. De lichtreflex van de ring flits toont vervorming van een droog oculair oppervlak waaruit blijkt hoe droog oog een negatief effect kan hebben op het zicht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

	Dacryoadenectomie
	gemiddelde ± SEM; n = 16 ogen
	Basislijn	Week 2
Break-up tijd scheur, s	60,0 ± 0,0	4,5 ± 1,2
		p < 0,0001
Scheur osmolariteit, mOsm	291,2 ± 3,7	315,3 ± 5,5
		p = 0,001
Schirmer scheur test, mm	18,3 ± 1,3	10,5 ± 1,6
		p = 0,0006
Rose Bengal, gemodificeerde NEI-Score	0,0 ± 0,0	4,28 ± 0,6
		p < 0,0001
Bediend VS. Baseline: Dacryoadenectomie: tbut, p < 0,0001; scheur osmolariteit, p < 0,001; Schirmer-scheur test, p < 0,0006); en Rose Bengal.

Tabel 1: droge ogen parameters op postoperatieve week 2.

Discussion

DED is ingedeeld in twee belangrijke groepen op basis van het effect op de stabiliteit van de scheur film: waterige deficiënte (verminderde productie van de waterige component van de traanfilm; ~ 20% van de DED) en verdampings (verhoogde verdamping van de traanfilm; ~ 50% van DED). Ongeveer 30% van de patiënten vertonen een bewijs van beide (gemengd). Ontsteking is het kern mechanisme van DED waaraan de diverse etiologieën^13,14convergeren. Onze methode modellen waterige-deficiënte.

Zoals eerder vermeld, zijn belangrijke eerste stappen bij het reproduceren van onze methode een waardering van de fijne punten van de anatomie van de orbitale traanklieren (LGs) van het konijn en het vermijden van verwarring door gevarieerde en soms conflicterende anatomische terminologie. De anatomische Atlas van Popesko et al.¹¹ is zeer grondig. Voor degenen die minder comfortabel zijn met de anatomie van het konijn, biedt een dissectie van de obductie monsters een gemakkelijke vertrouwdheid met deze structuren en helpt ze hun chirurgische verwijdering in levende specimens.

Een kritisch advies over huisvesting en acclimatiëring is gegeven in onze begeleidende publicatie¹². Hetzelfde artikel presenteert ook nuttige opmerkingen voor het aszeggen van de parameters van DED gebruikt in beide methoden.

In tegenstelling tot de vorige methode¹², vereist deze een hoger niveau van chirurgische vaardigheid vanwege de mate en meer invasieve aard van de technieken die nodig zijn om de lgs te verwijderen. Het grootste risico tijdens deze resecties is een catastrofale bloeding veroorzaakt door het inwonden van grote bloedvaten die zich in de nabijheid van de LGs bevinden, zoals takken van de halsslagader. Dit wordt vermeden door elke LG en zijn marges binnen het chirurgische veld adequaat te visualiseren. Tot slot, overijverige verwijdering van het nictitating membraan kan leiden tot de verzakking van de Harderian klier, die scheuren film beoordeling kan verstoren.

Zorg moet worden genomen om de hoeveelheid conjunctivale verstoring te minimaliseren met de verwijdering van de PSLG, een nieuw aspect van onze methode dat de reproduceerbaarheid verbetert en de ernst van de DED verbetert. Het is verrassend eenvoudig om het dissectie vlak te vestigen en het terug te voeren naar de superieure orbitale richel, zolang de tractie op de weefsels wordt uitgeoefend. Het is geruststellend om de oormerken van de afkapping van de OSLG te kunnen zien; ze bevestigen de volledige verwijdering van de belangrijkste excretie kanaal van de klier.

Het verwijderen van de ILG in zijn geheel presenteert ook uitdagingen. Isoleer eerst het hoofd van de klier, want dit is het eenvoudigste deel om te visualiseren. Het hele hoofd van het klierweefsel scheidt gemakkelijk van de omringende weefsels; echter, enige zorg moet worden gebruikt om schade aan de grote veneuze sinus, die mediaal aan het hoofd van de ILG ligt te voorkomen. De staart van de ILG kan vervolgens worden opgevolgd als het onder het zygomatische bot passeert. De meerderheid van de staart is gemakkelijk te isoleren. Het meest posterieure aspect van de staart kan echter een grotere uitdaging blijken te zijn vanwege de variabele anatomie en de nabijheid van een middelgrote tak van de carotis. Zorgvuldige dissectie moet toelaten dat alle marges van de ILG duidelijk worden gezien, waardoor de volledige verwijdering ervan wordt vergemakkelijkt. De onderzoeker moet bereid zijn om de dissectie meer superieur te dragen in gevallen waar de staart van de klier eindigt onder de laterale Canthus, zoals uitgelegd in de eerdere bespreking van de anatomie van de traanklieren. Van de nota, de auteurs hebben nooit in staat geweest om een deel van de OSLG te identificeren bij het ontleden van de ILG door een kromlijnige incisie langs de stoffelijke en inferieure wereldbol. Hoewel dit technisch mogelijk kan zijn, draagt die chirurgische aanpak een te hoog risico voor ernstige bloedingen. Het naderen van de OSLG door de posterieure incisure blijkt veel veiliger.

Het uitscheidingskanaal van de ILG kan door middel van het inferieure fasciale vlak worden gezien als het in de onderste conjunctivale fornix overgaat. Af en toe worden hier ook kleine door van klierweefsel gezien en kunnen ze zorgvuldig worden verwijderd.

Het is zeer nuttig om de volgorde van LG resectie zoals hier gepresenteerd. Als de ILG eerst wordt verwijderd, wordt de isolatie van de OSLG technisch veel moeilijker. De belangrijkste reden is dat, na verwijdering van de ILG, de OSLG niet gemakkelijk kan worden verzakte en daardoor geïdentificeerd.

Een belangrijk voordeel van ons model is dat het "modulair" kan zijn. Met andere woorden, de mate van DED geïnduceerd door dacryoadenectomie kan worden gekalibreerd om experimentele behoeften te serveren. Bijvoorbeeld, resectie van alle LGs zou leiden tot maximale DED, maar resectie van alleen de SLG zou veroorzaken de mildste vorm van DED en resectie van alleen de ILG zou genereren ziekte van intermediaire ernst.

Onze aanpak, die het verschillende pathofysiologisch voorval van verminderde scheur productie samengeeft, biedt extra voordelen ten opzichte van reeds gerapporteerde methoden. Kort, geen andere chirurgische model geëlimineerd scheur productie door alle orbitale lgs^5,6,7,15,16; waaronder parasympathische denervatie van de lgs¹⁷, en farmacologische onderdrukking van scheur productie^18,19, met de laatste twee hebben hun afwijkend effecten als belangrijke medeoprichters. Ten slotte minimaliseert dit model de belangrijkste onderzoeker afhankelijke bias, namelijk de onvolledige resectie van de LGs, omdat de chirurgische techniek hun volledige visualisatie biedt; Dit wordt geholpen door het feit dat er geen hemostase, anders dan cauterie, vereist is.

De onderzoeker moet Cognizant zijn dat volledige resectie van alle orbitale LGs geen volledige afwezigheid van tranen genereert en, bijvoorbeeld, de Tear testwaarden van Schirmer die bij nul naderen, mogen niet worden verwacht. Dit is te wijten aan het feit dat er altijd andere bronnen van scheur vloeistof zoals de accessoirelgs van wolfring en Krause en plasma lekkage van conjunctivale vaten^20,21,22. Vanuit een experimenteel oogpunt moet dit gezien worden als een positief aspect van de methode omdat het het oogoppervlak handhaaft; complete xeroftalmie zou volledig vernietigen het hoornvlies ontkende het nut van het model. Daarnaast biedt dit model in zijn huidige uitvoeringsvorm een uitstekende gelegenheid om dergelijke compenserende mechanismen en vloeistoftransport over deze kleinere compartimenten te bestuderen.

Tot slot, hier gepresenteerd zijn de bijzonderheden van een roman en veelzijdige methode van het induceren van waterige-deficiënte die zich leent voor de studie van scheur fysiologie, de pathogenese van DED en de studie van therapeutische middelen wordt ontwikkeld voor deze indicatie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
acepromazine, Aceproinj	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	NDC11695-0079-8	0.1ml/kg subcutaan injectie voor sedatie bij konijnen
anesthesie verdamper	VetEquip, Pleasanton, CA	Item # 911103	Protocol 4.8
dier vasthoudzak	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	Jorvet J0170	Gebruik een geschikt formaat zak.
bupivacaïne, 0,5%	Hospira Inc, Lake Forest IL	NDC: 0409-1162-02	Gemengd 50:50 met 2% lidocaïne met 1:100.000 epinefrine voor infiltratie van incisieplaatsen, protocol 5.1
buprenorfine	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH		0,01 mg/kg, voor post-procedurele zorg, 6.1.4
cauterisatie-unit, hoge temperatuur, op batterijen	Medline Industries Inc, Northfield, IL	REF ESCT001	Houd bij de hand voor bloedingen, protocol 2.7
clippers, Wahl Mini Arco	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	No. 022573	Draadloze schaar voor haarverwijdering, protocol 4.2
Colorado-naald	Stryker Craniomaxillofacial, Kalamazoo, MI	N103A	Gebruik met elektrochirurgische unit om incisies te maken, protocol 5.1 & 5.3
elektrochirurgische unit met monopolaire cauterplaat	Valleylab, Boulder, CO	Force FXc	Gebruik met elektrochirurgische unit om incisies te maken, protocol 5.1 & 5.3
fluoresceine, Ak-Fluor 10%	AKRON, Lake Forest, IL	NDC17478-253	Verdun tot 0,2% met PBS om TBUT te meten, meting van droge oog parameters, protocol 3.1
tang, gebogen dresseertang	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	Storz E1406	Fijn gekartelde dresseertang
tang, 0,3	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	ET6319	Voor verwijdering van membraan nictitans, protocol 2.5
tang, Bishop Harmon	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E1500-C	Gebittang voor dacryoadenectomie, protocol 5.1 & 5.2
haarverwijderingslotion, Nair	Wijdst beschikbaar	Verzachtende babyolie	Ontharingscreme voor gevoelige huid, protocol 4.2
isofluraan	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	29405	Mogelijk alternatieve sedatie, protocol 4.7
IV-katheter, Terumo Surflo ETFE 24-gauge	Terumo, Tokyo, Japan; verkrijgbaar bij Fisher Sci., VWR, McKesson, etc.	SR-OX2419CA	25-gauge voor kleinere konijnen; protocol 4.6
ketamine	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	NDC 11695-0701-1; NADA 200-055	15 mg/kg, protocol 4.7
ketoprofen	Hospira, Inc., Lake Forest, IL		3 mg/kg, voor post-procedurele zorg, 6.1.4
laryngeale maskerluchtweg	Docsinnovent Ltd, London, UK	Vgel R3	Protocol 4.8
ooglidsluittang, draad	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	Barraquer SUH01	Voor verwijdering van membraan nictitans, protocol 2.4
lidocaïne 2% met epinefrine 1:100.000; 50:50 mengsel	Hospira Inc, Lake Forest IL	NDC 0409-3182-02	Voorbereiding vóór verwijdering van membranen nictitans, protocol 2.4
lidocaïne, conserveringsmiddel-vrij	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	L5647	1% in PBS voor anesthesiemiddel, voor aanbrenging op oog, protocol 2.4
micropipet	Eppendorf	Research Plus 100 uL	Voor aanbrenging van conserveringsmiddel-vrij lidocaïne op oog, protocol 2.4
micropipet-tips	World Wide Medical Products	41071052	Voor aanbrenging van conserveringsmiddel-vrij lidocaïne op oog, protocol 2.4
bewakingsapparaat, multi-parameter	SurgiVet, Waukesha, WI	V9201	Voor bewaking van vitale functies, protocol 4.9
naald, 26-gauge	BD, Franklin Lakes, NJ	REF 305115	Voor injectie van lidocaïne/epinefrine, protocol 2.3 & 2.5
naald, 30-gauge	BD, Franklin Lakes, NJ	REF 305106	Voor infiltratie van incisieplaatsen; spuit- en naaldgrootte zijn niet kritiek, protocol 5.1
osmolariteit-tips	TearLab Corp., San Diego, CA	#100003 REV R	Meet de osmolariteit van tranen, meting van droge oog parameters, protocol 3.1
osmometer, TearLab	TearLab Corp., San Diego, CA	Model#200000W REV A	Meet de osmolariteit van tranen, meting van droge oog parameters, protocol 3.1
povidon-jodiumoplossing	Medline Industries Inc, Northfield, IL	PVP Prep Solution, NDC: 53329-939-04, REF MDS 093944	Om een steriele omgeving te behouden, protocol 4.11
konijn, Nieuw-Zeelands Wit	Charles River Labs, Waltham, MA (NZW)	2-3 kg	Onderzoeksdieren
Rose bengal-kleuring	Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO	NDC51801-004-40	1% in PBS, voor kleuring van het oculaire oppervlak, meting van droge oog parameters, protocol 3.1
zoutoplossing, normaal	B. Braun Medical, Irvine, CA	REF R5200-01	Voor post-procedurele zorg, protocol 6.1.3
Schirmer Tear Test strips	Eaglevision, Katena products. Denville, NJ	AX13613	Meet de traanproductie, meting van droge oog parameters, protocol 3.1
schaar, Vannas	McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA	Miltex 2-130	Capsulotomisch schaar voor dacryoadenectomie, protocol 5.1 & 5.2