Dit protocol beschrijft een nieuwe colorimetrische methode voor Antimalarial Quine (PMQ) detectie in synthetische urinen en menselijke serums.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geoptimaliseerde Griess reactie voor UV-VIS en Naked-Eye bepaling van anti-malaria Primaquine
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Primaquine (PMQ), een belangrijke anti-malaria drug, is aanbevolen door de World Health Organization (WHO) voor de behandeling van levensbedreigende infecties veroorzaakt door P. vivax en ovale. Echter, PMQ heeft ongewenste bijwerkingen die leiden tot acute hemolyse bij patiënten met glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) deficiëntie. Er is behoefte aan het ontwikkelen van eenvoudige en betrouwbare methoden voor PMQ bepaling met het oog op de controle van de dosering. In het begin van 2019 hebben we een UV-VIS-en op blote ogen gebaseerde benadering gerapporteerd voor PMQ-colorimetrische kwantificering. De detectie was gebaseerd op een Griess-achtige reactie tussen PMQ en anilines, die gekleurde azo-producten kan genereren. De detectiegrens voor directe meting van PMQ in synthetische urine is in het nanomolair-bereik. Bovendien heeft deze methode een groot potentieel aangetoond voor PMQ-kwantificering van menselijke serummonsters bij klinisch relevante concentraties. In dit protocol beschrijven we de technische details met betrekking tot de syntheses en karakterisering van gekleurde azo-producten, de reagens voorbereiding en de procedures voor PMQ-bepaling.
Inleiding
PMQ is een van de belangrijkste Antimalarial drugs, het werkt niet alleen als een weefsel schizontocide om terugval te voorkomen, maar ook als een gametocytocide om de overdracht van de ziekte te onderbreken1,2,3,4. Intravasculaire hemolyse is een van de betreffende bijwerkingen van PMQ, die zeer ernstig wordt in die tekort aan G6PD. Het is bekend dat de G6PD genetische aandoening wereldwijd wordt gedistribueerd met een Genfrequentie tussen 3-30% in endemische gebieden van malaria. De ernst van de PMQ-zwakte hangt af van de mate van G6PD-deficiëntie, evenals de dosis en de duur van PMQ-blootstelling5,6. Om het risico te verlagen, de WHO heeft aanbevolen een enkele lage dosis (0,25 mg base/kg) PMQ voor behandeling van malaria. Echter, dit wordt nog steeds uitgedaagd door de variaties in de gevoeligheid van de drug van de patiënt5,7. Dosis controle is nodig om de farmacokinetiek na PMQ toediening, die kan effect aanpassing van de dosering voor een succesvolle behandeling met beperkte toxiciteit te beoordelen.
High-Performance vloeistofchromatografie (HPLC) is de meest gebruikte techniek voor klinische bepaling van PMQ. Endoh et al. rapporteerde een HPLC-systeem met een UV-detector voor serum PMQ-kwantificering met behulp van een C-18 Polymer gel column8. In hun systeem werden serumeiwitten eerst neergeslagen met acetonitril, en vervolgens werd de PMQ in het supernatant gescheiden voor HPLC. De ijkcurve was lineair over het concentratiebereik van 0,01-1,0 μg/mL8. Een andere methode op basis van een omgekeerde fase HPLC met UV-detectie bij 254 nm is gerapporteerd voor de kwantificering van PMQ en de belangrijkste metabolieten9. De ijkcurve voor PMQ was lineair in het bereik tussen 0,025-100 μg/mL. Een extra vloeistof-vloeistofextractie met gemengd hexaan en ethylacetaat als organische fase werd gebruikt voor PMQ scheiding met percentage terugwinning bereikt tot 89%9. Meer recentelijk ontwikkelde Miranda et al. een UPLC-methode met UV-detectie bij 260 nm voor PMQ-analyse in tabletformuleringen met een detectielimiet van 3 μg/mL10.
Hoewel HPLC-methoden een veelbelovende gevoeligheid vertonen bij de bepaling van het geneesmiddel en de gevoeligheid verder kan worden verbeterd als de HPLC is uitgerust met een massaspectrometer, zijn er nog steeds enkele nadelen. Directe geneesmiddelen metingen in biologische vloeistoffen zijn meestal niet toegankelijk via HPLC, omdat veel biomoleules de analyse sterk kunnen beïnvloeden. Aanvullende extracties zijn nodig om endogene moleculen te verwijderen vóór HPLC-analyse11,12. Bovendien wordt de PMQ-detectie door een HPLC-UV-detector meestal uitgevoerd bij de maximale absorptie golflengte (260 nm). Er zijn echter veel endogene moleculen in biologische vloeistoffen met een sterke extinctie bij 260 nm (bijv. aminozuren, vitaminen, nucleïnezuren en urochromen pigmenten), waardoor de PMQ UV-detectie wordt verstoord. Er is behoefte aan het ontwikkelen van eenvoudige en kosteneffectieve methoden voor de bepaling van PMQ met redelijke gevoeligheid en selectiviteit.
De Griess-reactie werd voor het eerst gepresenteerd in 1879 als een colorimetrische test voor nitriet detectie13,14,15,16. Onlangs is deze reactie uitgebreid onderzocht om niet alleen nitriet te detecteren, maar ook andere biologisch relevante moleculen17,18,19,20. We hebben eerder gerapporteerd de eerste systematische studie van een onverwachte Griess reactie met PMQ (Figuur 1). In dit systeem is PMQ in staat om gekleurde azos te vormen in combinatie met gesubstitueerde anilines in de aanwezigheid van nitriet ionen onder zure omstandigheden. We hebben verder ontdekt dat de kleur van azos varieerde van geel naar blauw bij het verhogen van het elektron donerende effect van de substituent op anilines21. Een UV-VIS absorptie gebaseerde colorimetrische methode voor PMQ kwantificering is ontwikkeld door de geoptimaliseerde reactie tussen 4-methoxyaniline en PMQ. Deze methode heeft een groot potentieel aangetoond voor gevoelige en selectieve detectie van PMQ in biorelevante vloeistoffen. Hier willen we de gedetailleerde procedures beschrijven voor de bepaling van PMQ op basis van deze colorimetrische strategie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. synthese van gekleurde Azo's
- Los in een ronde bodem kolf van 25 ml (RbF) aniline (0,1 mmol) en Quine-bisfosfaat(45,5 mg, 0,1 mmol) op in 10 ml H3po4 oplossing (5% v/v). Zet de RBF op een ijsbad, voeg een roerstaaf toe met de juiste maat in de oplossing en zet de RBF op een roer plaat.
Opmerking: Voor de synthese van azo 3G (Figuur 2), gebruik 0,2 mmol van Quine-bisfosfaat. - Los NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) op in 1 ml gekoeld water en voeg vervolgens in het reactiemengsel dropwise toe. Verwijder het ijsbad en houd het reactiemengsel bij kamertemperatuur geroerd.
- Bewaak de reactie met een met silica gel gecoate dun-Layer chromatografie (TLC) plaat. Gebruik een dichloormethaan (DCM)/methanol (meoh) mengsel (vol/vol = 5:1) als de eluens voor TLC. Het azo-product vertoont gekleurde vlekken op de TLC-plaat, die gemakkelijk te onderscheiden is door blote ogen. Stop de reactie wanneer de PMQ vlekken verdwijnen op TLC.
- Pas het reactiemengsel aan op pH > 10 door NaOH (2 M) op een ijsbad. Gebruik een scheitrechter van 50 mL om het mengsel 3 keer te extraheren met 20 mL ethylacetaat voor elk, combineer en concentreer de organische fase onder vacuüm met behulp van een roterende verdamper.
Opmerking: Pas vóór extractie de pH-waarde van reactie oplossingen boven 10 aan. Dit kan het primaire amine behouden als de niet-geïoniseerde vorm, waardoor extractie vergemakkelijkt. - Reinig de residuen door flits chromatografie met omgekeerde-fase silicagel onder normale druk, met behulp van MeOH/H2O als de eluent. Droog de product oplossing door middel van lyofilisatie om de gewenste azo-producten te geven.
Opmerking: Dezelfde reactie kan ook worden uitgevoerd in verdunde HCl-oplossingen (0,2 M).
2. UV-VIS metingen en theoretische berekening
- Los de zuivere azo (50 μM) op in gedistilleerd water of in 5% H3po4 -oplossing (pH 1,1). Noteer UV-VIS Absorptiespectra (250-700 nm) op een spectrofotometer bij kamertemperatuur (25 °C). Exporteer de gegevens als. xls/. xlsx-bestanden voor verdere analyse.
-
Voer alle theoretische berekeningen uit voor PMQ zelf en azo-producten met behulp van het Gaussiaanse 16-programma. Gebruik tijdafhankelijke dichtheid functionele theorie (TD-DFT) met een 6-31G basis set. Neem oplosmiddel effecten op met behulp van water via het polariseer bare Continuum-model (PCM) formalisme.
- Gebruik software (bijv. Chemdraw Office) om de structuren te tekenen en sla de structuur vervolgens op als een Gaussiaanse invoerbestand (. gif).
- Open het GIF-bestand met Gauss View en klik op de knop Bereken. Selecteer Gaussiaanse berekeningsinstellingen, opt + freq, en Ground State-DFT-B3LYP-6-31g; Klik vervolgens op verzenden. Met de geometrie-optimalisatie wordt een. log-bestand gegenereerd.
- Gebruik de Gauss-weergave om dit logboekbestand te openen volgens de bovenstaande procedure. Klik op berekenen-Gaussiaanse berekening instellen en selecteer energie en TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31g-singlet alleen. Vervolgens indienen. Bij de energieberekening wordt een ander logboekbestand en een kubusbestand gegenereerd.
- Gebruik de Gauss-weergave om het logboekbestand te openen vanuit de energieberekening. Klik op resultaten-UV/VIS om de voorspelde absorptie te zien.
- Gebruik de Gauss-weergave om het kubusbestand te openen. Klik op resultaats en selecteer oppervlak en contouren-oppervlakte acties en nieuw oppervlak om de banen te zien.
-
Vergelijk de resultaten van zowel experimentele meting als Gaussiaanse berekening. Bereken de procentuele fout tussen de berekende en gemeten waarden, volgens de volgende vergelijking.
Fout = | (WMax CAL.-wMaxexper.) /WMaxexper. | × 100%
waar WMax CAL. staat voor de maximale extinctie golflengte van theoretische berekening en wMax exper. vertegenwoordigt de golflengte van het experimentele resultaat.
3. bepaling van PMQ
- PMQ meting met behulp van een 96-well plate (Figuur 5)
- Los 4-methoxyaniline op in 0,2 M HCl voor een 200 mM aniline oplossing, R1. Los natriumnitriet op in gedistilleerd water om een 5 mM oplossing te verkrijgen, R2. Bewaar alle oplossingen voor gebruik in de koelkast bij 4 °C.
- Voeg 100 μL R1 toe aan een 96-put plaat en voeg 50 μL PMQ bevattende steekproef toe aan de plaat om te mengen met R1. Voeg vervolgens 50 μL R2 toe aan de plaat. Meng de oplossingen door herhaalde Pipetting.
- Bewaar de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en noteer de UV/VIS-extinctie bij 504 nm. Herhaal 3x voor elke test. Het azo-product is stabiel bij blootstelling aan kamer licht; het is niet nodig om de plaat onder het donker te houden.
- Exporteer de gegevens als. xls/. xlsx-bestanden voor verdere analyse.
- Kalibratiecurve voor directe PMQ-meting in een urinemonster
- Bereid PMQ-oplossingen met behulp van synthetische urine met PMQ-concentraties op 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM, respectievelijk.
- Voeg 100 μL R1 toe aan een 96-put plaat en voeg 50 μL PMQ urine oplossing toe om te mengen met R1. Voeg vervolgens 50 μL R2 toe aan het bovenstaande mengsel. Meng de oplossingen door herhaalde Pipetting. Bewaar de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en noteer de UV/VIS-extinctie bij 504 nm.
- Genereer een kalibratiecurve op basis van de extinctie I504 en PMQ concentraties. Gebruik de waarden uit de putjes zonder PMQ als leeg en trek de lege waarden van alle tests af vóór de gegevensverwerking.
- Voer een lineaire pasvorm uit om de lineaire vergelijkingen te genereren als y = aX + b, waarbij y de extinctie intensiteit bij 504 nm is, X de concentratie van PMQ, a is de helling, en b het Y-snijpunt van de lineaire lijn.
- Ijkcurve voor directe PMQ-meting in een humaan serummonster
- Bereid PMQ-oplossingen met behulp van humaan serum met PMQ-concentraties op 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM respectievelijk.
- Voeg 100 μL R1 toe aan een 96-well plaat en voeg 50 μL PMQ serum oplossing toe om te mengen met R1. Voeg 50 μL R2 toe aan het bovenstaande mengsel en meng de oplossingen door herhaalde pipetteren. Bewaar de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en noteer de UV/VIS-extinctie bij 504 nm. Exporteer de gegevens als. xls/. xlsx-bestand voor verdere analyse.
- Genereer een kalibratiecurve op basis van de extinctie I504 en PMQ concentraties. Gebruik de waarden uit de putjes zonder PMQ als leeg en trek de lege waarden van alle tests af vóór de gegevensverwerking.
- Voer een lineaire pasvorm uit om de lineaire vergelijkingen te genereren als y = aX + b, waarbij y de extinctie intensiteit bij 504 nm is, X de concentratie van PMQ, a is de helling, en b het Y-snijpunt van de lineaire lijn.
- PMQ extractie uit serum
- Voeg een bepaalde hoeveelheid PMQ toe aan humaan serum om het PMQ-bevattende serum te simuleren. Voeg voor PMQ-extractie 6 mL mengsel van ethylacetaat/hexaan (7:1 v/v) toe aan 2 mL PMQ-bevattende serum in een 15 mL centrifugebuis.
- Voeg 100 μL natriumhydroxide (2 M) oplossing toe aan het extractie systeem. Schud de buis met behulp van een Vortex-mixer voor 30 s. Verzamel de organische laag en concentreer het met behulp van een roterende verdamper onder vacuüm.
- Los het residu opnieuw op met 200 μL gedistilleerd water en verwijder onoplosbare lipide-componenten door filtratie door een schijfvormig membraan met een poriegrootte van 220 nm. Gebruik de uiteindelijke oplossing voor de test.
- Bepaal PMQ uit het serum met extractie
- Volg de stappen 3,2 of 3,3 om de ijkcurve voor PMQ in gedistilleerd water te genereren. Extract PMQ van PMQ-bevattende serums volgens stap 3,4.
- Voeg 100 μL R1 en 50 μL PMQ-oplossing toe aan een 96-goed plaat. Voeg 50 μL R2 toe aan het bovenstaande mengsel en meng de oplossingen door herhaalde pipetteren.
- Bewaar de plaat 15 min bij kamertemperatuur en noteer de UV/VIS-extinctie bij 504 nm. Gebruik de putten met R1 en R2, maar zonder PMQ als besturingselementen. Exporteer de gegevens als. xls/. xlsx-bestanden voor verdere analyse.
- Trek de controlewaarden af van de extinctiewaarden I504 voor elke test en gebruik vervolgens het resultaat voor concentratie berekeningen volgens de lijnlijn vergelijking van de ijkcurve.
Opmerking: De aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor PMQ kan in alle gevallen worden berekend volgens een standaardmethode22. De berekening was gebaseerd op de kalibratiefunctie: LOD = 3,3 × SD/b, waarbij SD de standaarddeviatie van de blanco is en b de helling van de regressielijn is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de reactie condities te optimaliseren (Figuur 2), werden verschillende anilines gebruikt om met PMQ te combinatie via de Griess-reactie. We hebben een reeks van azo's met verschillende kleuren bereikt. Het is gebleken dat anilines met een elektron donerende substituent een rode verschuiving in het UV-Vis absorptiespectrum kunnen veroorzaken. Theoretische berekeningen werden uitgevoerd door de tijdafhankelijke dichtheids theorie (TD-DFT). Zoals weergegeven in Figuur 2a...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschreven een colorimetrische methode voor handige PMQ kwantificering. Het is mogelijk de meest eenvoudige en kosteneffectieve huidige methode. Wat nog belangrijker is, deze methode biedt de mogelijkheid om op blote ogen gebaseerde PMQ-meting te gebruiken zonder gebruik te maken van apparatuur.
De geoptimaliseerde Griess reactie voor PMQ detectie kan een rode kleur azo genereren met een maximale absorptie bij 504 nm. De potentiële invloed van UV-VIS absorptie van endogene biomoleules is be...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te verklaren.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de start-up subsidie van Guangzhou University of Chinese Medicine en het Youth Scientific Research training project van GZUCM (2019QNPY06). We erkennen ook het Lingnan Medical Research Center van de Guangzhou University of Chinese Medicine voor de ondersteuning van faciliteiten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Versie: x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloorzuur | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | gratis editie: 15.6.29 | |
| Fosforzuur | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisfosfaat | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Natriumnitriet | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Wordt geleverd met SkanIt Software 4.1 |
Referenties
- Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351(2011).
- Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).
- Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
- McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).
- Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13 (1), 418(2014).
- Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
- Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111 (1), 16-24 (2008).
- Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).
- Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).
- Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29(2015).
- Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).
- Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
- Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).
- Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).
- Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
- Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
- Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
- Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).
- Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).
- Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).
- Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
- Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
